Бешенство

Бешенство – это крайне опасное вирусное заболевание, характеризующееся тяжелым поражением головного и спинного мозга. Оно часто заканчивается летальным исходом.

Бешенство встречается у всех млекопитающих и передается с биологическими жидкостями, в основном со слюной. Человек, как правило, заражается им в результате укуса инфицированного животного, чаще всего собаки, кошки, кролика, хорька, лисицы, волка, енота, летучей мыши и др.

На начальном этапе заболевание проявляется усиленным слюноотделением и боязнью воды, а также угнетенным состоянием, которое сменяется приступами агрессии и возбуждения.

Людям, входящим в группу риска развития бешенства, необходимо проходить вакцинацию.

К сожалению, появление симптомов заболевания неизбежно заканчивается летальным исходом, так что лечение предполагает лишь облегчение состояния больного.

Синонимы русские

Рабиес, гидрофобия, водобоязнь.

Синонимы английские

Rabies, Hydrophobia, Canine madness, Lyssa, Madnessan.

Симптомы

Обычно бешенство не вызывает никаких симптомов вплоть до последней стадии заболевания, когда лечение уже невозможно. Инкубационный период (от заражения до появления симптомов) составляет от 7 дней до 1 года, в среднем 20-90 дней. Признаки заболевания часто появляются за несколько дней до смерти больного:

• перед появлением основных симптомов на месте укуса может возникать припухлость, покраснение, зуд,
• лихорадка,
• головная боль, недомогание,
• потеря аппетита, тошнота, рвота, понос,
• беспокойство, нарушения сна,
• депрессия,
• повышенная чувствительность к слуховым, зрительным раздражителям,
• угнетенное состояние сознания, тревожность, апатия сменяются приступами возбуждения, беспокойства, агрессии. Приступы возбуждения при этом сопровождаются учащением дыхания и сердцебиения,
• расстройства дыхания и глотания,
• гидрофобия – боязнь воды (при разговоре о ней или при попытке попить больной испытывает ужас, у него возникают болезненные спазмы глотки и гортани),
• чрезмерное слюноотделение,
• галлюцинации,
• судороги,
• частичный паралич.

Общая информация о заболевании

Бешенство – это опасное вирусное заболевание, которое характеризуется тяжелым поражением центральной нервной системы (головного и спинного мозга). На начальном этапе оно протекает бессимптомно, симптомы появляются на поздней стадии, когда лечение уже невозможно.

Распространенность бешенства зависит от степени вакцинированности домашних животных. Наиболее распространено оно в сельской местности и чаще возникает в летний период.

Бешенство может поражать всех млекопитающих и передается с биологическими жидкостями, в основном со слюной. У человека заражение бешенством, как правило, происходит в результате укуса зараженным животным, попадания слюны зараженного животного на поврежденную кожу, слизистую оболочку рта, носа, глаз. Значительно реже бешенство передается при употреблении инфицированного мяса. От человека к человеку заболевание не переходит, крайне редко может встречаться заражение через пересадку органов от инфицированных доноров.

Чаще всего человек заражается от домашних животных – от собак, кошек, кроликов, лошадей, хорьков, реже – от диких – лисиц, енотовидных собак, волков, енотов, летучих мышей и др. Дикие животные, в свою очередь, заражают бешенством домашних.

После того как вирус попадает в организм через кожу или слизистую оболочку, он по нервным волокнам достигает спинного и головного мозга, где фиксируется и начинает делиться. Возникает энцефалит – воспаление головного мозга. Это приводит к повышению рефлекторной возбудимости и к развитию параличей. Затем вирус распространяется по нервным волокнам в обратном направлении, попадая в печень, почки, надпочечники, кожу, сердце, слюнные железы, скелет, вызывая нарушение деятельности нервной системы и нарушение функций различных органов.

Скорость распространения вируса зависит от расположения укуса (при укусах головы, рук она будет высокой), его глубины, от количества возбудителей, попавших в рану, от активности микроорганизмов, от иммунного статуса инфицированного человека.

Инкубационный период заболевания в среднем составляет 20-90 дней, однако может варьироваться от недели до одного года. При появлении симптомов летальный исход, как правило, неизбежен.

Смерть обычно наступает в результате поражения дыхательного центра, что влечет за собой остановку дыхания.

Кто в группе риска?

• Подвергшиеся укусам домашних или диких животных.
• Жители сельской местности, держащие дома животных, не вакцинированных от бешенства.
• Путешествующие по развивающимся странам (по Африке, Юго-Восточной Азии).
• Выезжающие на природу и контактирующие с дикими животными (лисицами, енотами, летучими мышами и др.)
• Охотники, звероловы.
• Служащие зоопарков, питомников, приютов для животных.
• Ветеринары.
• Работающие с вирусом бешенства в лаборатории.

Диагностика

Диагноз «бешенство» предполагается при наличии симптомов заболевания после укуса животного и подтверждается исследованием образца кожи с затылка, выделением вируса из слюны, слезной и спинномозговой жидкости.

Лабораторные исследования

• Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ). Уровень лейкоцитов может быть повышен.
• Общий анализ мочи. При бешенстве может отмечаться значительное увеличение числа лейкоцитов в моче при отсутствии бактериального воспаления.
• Исследование крови, направленное на определение антител к возбудителю бешенства. В ходе анализа с помощью специального иммунофлюоресцентного окрашивания выявляется наличие в крови молекул, вырабатываемых иммунной системой в ответ на попадание в организм вируса бешенства. Диагноз подтверждается при значительном (4 и более раза) повышении количества (титра) антител к вирусу бешенства у больных, которые не подвергались вакцинации.

• Определение возбудителя бешенства в биологических жидкостях и тканях организма.
  • Исследование биоптатов (фрагментов тканей) кожи затылка, отпечатков роговицы. В полученный материал добавляются меченые антитела (молекулы, специфически связывающиеся с молекулой вируса бешенства). Под воздействием ультрафиолетового излучения комплекс из вирусов, «склеенных» с антителами, дает характерное зеленоватое свечение, что говорит о присутствии вируса бешенства во взятом материале. Данный анализ является наиболее достоверным в течение первой недели заболевания.
  • Исследование генетического материала вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Может использоваться слюна, кровь, спинномозговая жидкость, а также пораженные ткани. Достоверность результатов приближается к 100 %.
  • Исследование тканей мозга в ходе электронной микроскопии. Производится взятие участка ткани мозга (биопсия), который затем подвергается специальному окрашиванию и изучается под электронным микроскопом, который позволяет достичь очень высокой степени увеличения. При этом в пораженных вирусом бешенства клетках нервной ткани выделяются специальные включения или обнаруживается сам вирус.

Другие методы исследования

• Электроэнцефалография (ЭЭГ) – это метод, оценивающий электрические потенциалы головного мозга.

Лечение

Специфического лечения бешенства не существует. Как правило, заболевание неизлечимо и приводит к летальному исходу.

При укусе дикого животного проводится промывание, тщательный осмотр на предмет инородных тел (например, сломанных зубов) и хирургическая обработка раны. Затем срочно вводятся иммуноглобулины – специальные клетки иммунной системы. Далее в течение двух недель проводится вакцинирование пациента (всего применяется 5 вакцин). Только этот способ позволяет предотвратить заболевание.

После укуса за домашним животным необходимо наблюдать в течение примерно 10 дней и при появлении симптомов бешенства срочно обратиться к врачу для принятия мер по иммунизации пациента. Источник бешенства – больное животное – необходимо изолировать.

Лечение бешенства направлено на облегчение его симптомов – снятие судорог, уменьшение боли. Для этого применяются, соответственно, противосудорожные, обезболивающие, успокаивающие лекарственные препараты.

Для уменьшения контакта с потенциальными раздражителями больной помещается в специальную палату.

Восполняются потери жидкости, минеральных веществ; проводится искусственная вентиляция легких.

Профилактика

• Людям, входящим в группу риска развития бешенства, следует обязательно пройти вакцинацию.
• После укуса дикого животного необходимо тщательно промыть рану водой с мылом и срочно обратиться к врачу, чтобы пройти курс иммунизации и вакцинации против бешенства.
• Профилактическая вакцинация домашних животных.
• Домашних животных следует держать дома и контролировать их при нахождении на улице. Для этого могут применяться клетки и закрытые загоны. Это поможет избежать заражения домашних животных от диких. Следует уделить особое внимание кроликам, морским свинкам, хомякам и другим мелким питомцам, так как они не могут быть вакцинированы против бешенства. Нередко домашнее животное заражается за городом, где у него есть возможность контактировать с дикими, например коты, собаки могут убегать в лес и контактировать там с инфицированными грызунами, лисицами.
• Следует соблюдать правила общения при встрече с бродячими животными – не трогать их, не гладить во избежание укуса.
• Необходимо избегать контакта с дикими животными (например, лисами, енотами). Здоровые дикие животные сами избегают людей, поэтому зверь, который не боится людей и не пытается убежать, должен вызвать подозрение.
• Поводом для обращения к врачу может стать и укус домашнего животного, например в случае если вы не знаете, может ли быть оно заражено бешенством, и тем более если животное в течение нескольких дней после укуса погибло.

Рекомендуемые анализы

• Общий анализ крови
• Общий анализ мочи

Литература

• Dan L. Longo, Dennis L. Kasper, J. Larry Jameson, Anthony S. Fauci, Harrison’s principles of internal medicine (18th ed.). New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2011.
• Manning SE, Rupprecht CE, Fishbein D, et al. Human rabies prevention—United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. MMWR Recomm Rep. May 23 2008;57:1-28.
• Hemachudha T. Human rabies: clinical aspects, pathogenesis, and potential therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 1994;187:121-43.
• Gerald L. Mandell. Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases: Expert Consult Premium Edition. Churchill Livingstone, 2009.

БУ «Сургутская городская клиническая поликлиника №2»

Бешенство

Подробности

Обновлено 16.11.2016

Это опасное инфекционное заболевание, смертельное для человека и большинства животных. Вирус бешенства передается человеку во время укуса больного животного. Человек может заразиться бешенством от диких животных (лиса, песец, волк, енот, летучая мышь и др) и от домашних животных (собак, кошек, домашнего скота).

Вирус бешенства проникает в нервную систему и, размножаясь, приводит к тяжелым нарушениям работы головного и спинного мозга.

Не существует эффективных методов лечения бешенства после развития симптомов, однако заболевание можно предотвратить, если вовремя начать экстренную профилактику бешенства. Для профилактики бешенства после укуса больного животного используется антирабическая вакцина и антирабический иммуноглобулин. Соблюдение всех правил экстренной профилактики бешенства помогает значительно снизить риск развития заболевания.

Что нам известно о возбудителе бешенства?

Возбудителем бешенства является вирус. Вирус бешенства в большом количестве содержится в слюне больного животного, в то время как кровь, моча и фекалии больных животных практически незаразны.

Вирус бешенства быстро погибает вне тела животного или человека: губительное действие на вирус оказывают солнечные лучи, практически любые дезинфицирующие средства, а также кипячение в течение 2 минут.

От каких животных можно заразиться бешенством?

Вирус бешенства передается человеку от больных животных. Заражение бешенством возможно от следующих животных:

• лисы,
• еноты,
• волки,
• песцы,
• шакалы,
• летучие мыши и пр.
• Заражение также возможно от домашних животных: чаще всего, кошек и собак.

Как происходит заражение бешенством?

• При укусе больного животного
• При попадании слюны больного животного на поврежденные участки кожи (царапины, ссадины, раны)
  Если вы каким-либо образом контактировали со слюной больного (или подозрительного) животного, вам следует немедленно обратиться за медицинской помощью, для проведения профилактики бешенства.
• Очень редко заражение бешенством происходит при вдыхании пыли или воздуха, содержащего вирус бешенства.
  Так, например, известны случаи развития бешенства у людей, обрабатывающих шкуры больных лисиц.
• Заражение бешенством практически исключено при контакте неповрежденной кожи с кровью, мочой или фекалиями больных животных. Также заражение бешенством невозможно при употреблении в пищу мяса больного животного. В этом случае нет необходимости проводить экстренную профилактику бешенства.
• Человек, больной бешенством, не может заразить другого человека.

Как распознать бешенство у животных?

Опасность животных, больных бешенством, заключается в том, что они становятся заразны за несколько дней или недель до появления первых симптомов бешенства.

Длительность инкубационного периода бешенства (время от заражения до появления первых признаков) зависит от типа животного, его веса, возраста, и может составлять от одной недели до года.

Ниже представлены основные признаки, наличие которых может указывать на бешенство у животного:

• Неадекватное поведение. Дикие животные при бешенстве могут терять чувство осторожности, подходить к другим животным и людям. Домашние животные, заражаясь бешенством, также меняют свое поведение: становятся чрезмерно ласковыми, пугливыми или сонливыми. Не реагируют на команды хозяина, не отзываются на кличку.
• Измененный аппетит. Животное, больное бешенством, может поедать различные несъедобные предметы, землю.
• Слюнотечение и рвота являются частыми симптомами бешенства у животного. Также больные звери не могут нормально глотать и часто давятся во время еды.
• Нарушение координации: животное не может удержать равновесие, при ходьбе шатается.
• Судороги – это подергивания или сокращения мышц, которые могут затрагивать только одну конечность или все тело.
• Агрессия является поздним симптомом бешенства и, как правило, через 2-3 дня животное погибает от бешенства. Агрессивное животное особенно опасно, так как оно может заразить других животных или людей.
• Параличи — это отсутствие движений в одной или нескольких частях тела животного. Часто развивается паралич нижней челюсти, что приводит к ее отвисанию (при этом животное приобретает характерный вид: открытая пасть и вытекающие из пасти слюни).

Что делать, если у домашнего животного появились симптомы бешенства?

Если ваше животное было укушено неизвестным животным или у него появились признаки, характерные для бешенства, как можно скорее обратитесь к ветеринару. Если животное ведет себя агрессивно, то постарайтесь закрыть его в каком-либо помещении (или в клетке) и избегайте контактов с его слюной. Как можно быстрее свяжитесь с ветеринаром.

Единственный способ подтвердить или опровергнуть диагноз бешенства у животного — это наблюдение за ним в течение 10 суток. Если в течение этого периода времени у животного не развились симптомы, характерные для бешенства, и оно не погибло, то диагноз бешенства исключается. Если животное погибло, то участок его мозга отправляют на исследование в лабораторию, которая устанавливает окончательный диагноз.

Что делать после контакта с больным животным?

1. Попадание слюны больного или подозрительного животного на кожу (например, если вас облизала собака или кошка)

   Если у вас хороший иммунитет (вы не принимаете лечение от рака, стероидные гормоны, у вас нет ВИЧ-инфекции), то следует тщательно вымыть кожу с мылом. Нет необходимости в обращении к врачу. Если же у вас снижен иммунитет или животное облизало ребенка – нужно вымыть кожу с мылом и обратиться к врачу. Больное или подозрительное животное по возможности изловить и показать ветеринару.

   Если у вас снижен иммунитет, то производится профилактика бешенства с помощью антирабической вакцины (см. ниже).

   Подозрительное животное наблюдается в течение 10 суток. Если через 10 суток бешенство не подтвердится, экстренную профилактику бешенства (введение вакцины по схеме) можно прекратить.

2. Попадание слюны на поврежденную кожу или укусы животного.

   Как можно быстрее и тщательнее вымойте место укуса и кожу, куда попала слюна, с мылом. После этого обработайте кожу и место укуса (края раны) перекисью водорода. После этого, обработайте место укуса йодом. Эти меры значительно снижают риск развития бешенства. Больное или подозрительное животное по возможности изловить и показать ветеринару. Производится экстренная профилактика бешенства с помощью вакцинации и, в особых случаях, введения антирабического иммуноглобулина. Рану от укуса ни в коем случае не ушивают.

   Подозрительное животное наблюдается в течение 10 суток. Если через 10 суток бешенство не подтвердится, экстренную профилактику бешенства можно прекратить.

Симптомы и признаки бешенства у человека

1. Инкубационный период (время от попадания вируса в организм до появления первых симптомов) у человека зависит от множества факторов: пути заражения, места укуса, величины и глубины раны, возраста, веса человека и пр. Первые симптомы бешенства могут появиться уже спустя 7-10 дней после заражения, либо спустя несколько месяцев (до года).
2. Наиболее опасными считаются укусы в области головы, шеи, кистей рук. При укусах в эти участки тела вирус бешенства намного быстрее проникает в нервную систему и раньше приводит к появлению симптомов заболевания (меньше, чем через 50 дней после укуса).
3. Важно понимать, что симптомы бешенства появляются не у всех людей, которых укусило больное животное, а, как правило, у тех, кто не позаботился о срочной профилактике бешенства после контакта с больным животным. Таким образом, даже если у вас был риск заражения, но вы получили курс профилактического лечения, то симптомы бешенства у вас не появятся.
4. Первые симптомы бешенства, как правило, появляются в области раны от укуса, это онемение кожи или сильный зуд. На фоне этих симптомов могут появляться слабость, головокружение, тошнота, диарея, повышение температуры тела до 37,5°С, бессонница.
5. Через несколько дней температура тела повышается до 40-41°С, появляются следующие симптомы бешенства:

• Приступы болезненных судорог (подергивания мышц), которые появляются спонтанно, либо в ответ на яркий свет, громкий звук, прикосновение.
• Повышенное слюноотделение (слюнотечение)
• Затруднения при глотании пищи и проглатывании слюны
• Изменения в поведении: чрезмерная возбудимость, агрессия

Спустя несколько часов или дней после появления этих симптомов у человека развиваются параличи (отсутствие сокращений в мышцах). Вскоре, в результате паралича наступает остановка дыхания и сердцебиения. Как правило, человек умирает на 7-14 день после появления первых признаков бешенства.

У некоторых людей симптомы бешенства могут быть практически незаметны. Это, так называемое, «немое бешенство», при котором не бывает судорог, слюнотечения, агрессивного поведения. С первых дней заболевания отмечаются сильные головные боли, высокая температура тела, параличи.

Диагностика бешенства

• Наличие контакта с больным или неизвестным животным за последний год (учитываются укусы животных и другие возможные контакты со слюной, обработка шкур животных и пр.)
• Наличие симптомов, характерных для бешенства. Результаты анализов на бешенство у подозрительного животного (если оно было поймано).
• Результаты анализов на бешенство у человека.

В диагностике бешенства используются следующие методы:

• Обнаружение антител против вируса бешенства возможно в коже человека (для этого анализа производится биопсия — берут участок кожи с задней поверхности шеи), либо в отпечатке с роговицы глаза.
• Обнаружение вируса бешенства в слюне и спинномозговой жидкости человека с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции). Этот метод диагностики возможен только в специальных лабораториях, имеющих соответствующее оборудование.
• Общий анализ крови при бешенстве может показать увеличение количества моноцитов (клетки, которые отвечают за борьбу с инфекцией).
• Анализ спинномозговой жидкости также показывает повышение уровня моноцитов.
• Окончательное подтверждение диагноза возможно только после смерти человека и обследования участков его головного мозга под микроскопом. В нервных клетках человека, умершего от бешенства, обнаруживаются особые включения (точки), которые называются тельцами Негри. Наличие этих телец подтверждает диагноз бешенства.

Лечение бешенства

Не существует эффективных методов лечения бешенства, поэтому все люди, у которых появились симптомы бешенства, умирают. Тем не менее, описано несколько случаев выздоровления от бешенства на фоне проводимого противовирусного лечения. Однако, к сожалению, эта схема лечения работает крайне редко.

Люди, больные бешенством, получают симптоматическое лечение (при появлении болей – обезболивающие, при появлении судорог – противосудорожные лекарства и т.д.)

Появления симптомов бешенства и смерти можно избежать, если после укуса больного или неизвестного животного вовремя начать профилактическое лечение.

Профилактика бешенства

Для профилактики заражения бешенством все люди, которые часто контактируют с дикими или бездомными домашними животными, должны пройти вакцинацию против бешенства. Прививка от бешенства необходима ветеринарам, охотникам, работникам животноводческих хозяйств, егерям, заводчикам собак и т.п.

Прививка от бешенства ставится несколько раз, по схеме: 0 день (первая прививка), затем через 7 дней и через 30 дней. Через год производится повторное прививание. После этого повторные прививания нужно делать раз в 3 года.

Противопоказания для профилактической прививки от бешенства: острые инфекционные заболевания, аллергия, беременность.

Как обезопасить себя и своих детей от бешенства?

1. Не приближайтесь и не гладьте бездомных животных. Животное может быть заразным еще до появления первых признаков бешенства, когда оно выглядит вполне здоровым. Даже маленький безобидный котенок может стать переносчиком бешенства.
2. Не позволяйте своим детям приближаться к бездомным животным. Объясните, что, если ребенка случайно укусит или поцарапает бездомное животное, ему необходимо как можно быстрее сообщить об этом кому-то из родителей.
3. Если у вас есть домашние животные, обязательно вакцинируйте их от бешенства.
4. Мусор вокруг вашего дома является приманкой для диких и бездомных животных, являющихся потенциальными переносчиками бешенства. Соблюдайте чистоту и держите мусорные баки на улице закрытыми.
5. Не оставляйте своих домашних животных без присмотра. Они могут быть атакованы больным животным.
6. Обязательно проконсультируйтесь у ветеринара, если ваш питомец стал себя неадекватно вести.
7. При укусе неизвестного дикого или бездомного животного как можно скорее вымойте руки с мылом, обработайте укус перекисью водорода и йодом, а затем как можно скорее обратитесь к врачу.

Соблюдение этих мер предосторожности может спасти вашу жизнь и жизнь ваших детей.

Бешенство у собак: основные симптомы и профилактика

Бешенство у собак: основные симптомы и профилактика

• Б

  • Балашиха
  • Быково

• Ж

  • Железнодорожный
  • Жуковский

• К

  • Королёв
  • Красково
  • Красногорск
  • Курск

• Л

  • Лобня
  • Лыткарино
  • Люберцы

• М

  • Москва
  • Московский
  • Мытищи

• Р

  • Раменское
  • Реутов
  • Ростов-на-Дону

• С

  • Санкт-Петербург

Лабораторная диагностика бешенства. Современное состояние и направление развития | Борисевич

1. World Health Organization 2018. [Электронный ресурс]. URL: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp/ (дата обращения 20.11.2018).

2. WHO Expert Consultation on Rabies: Second report. WHO technical report series. No. 982. WHO Press, World Health Organization. 1211 Geneva 27, Switzerland; 2013. 139 p.

3. WHO Expert Consultation on Rabies: Third report. WHO technical report series. No. 1012. WHO Press, World Health Organization. Geneva 27, Switzerland; 2018. 183 p.

4. Макаров В.В., Гулюкин А.М., Гулюкин М.И. Бешенство: естественная история на рубеже столетий. М.: ЗооВетКнига; 2015. С. 5–13.

5. WHO Immunological Basis for Immunization Series. Module 17: Rabies. Update 2017. World Health Organization. Switzerland, Geneva 27; 2017. 40 p.

6. Ходякова И.А., Смольянинов Д.И. Об эпидемиологическом надзоре за бешенством на территории Липецкой области. Санитарно-эпидемиологический вестник. 2018; 3:6–8.

7. Сидоров Г.Н., Полещук Е.М., Сидорова Д.Г. Источники заражения людей бешенством в России за последние 5 веков. Здоровье населения и среда обитания. 2016; 11:22–6.

8. Madhusudana S.N., Subha S., Thankappan U., Ashwin Y.B. Evaluation of a direct rapid immunohistochemical test (dRIT) for rapid diagnosis of rabies in animals and humans. Virol. Sin. 2012; 27(5):299–302. DOI: 10.1007/s12250-012-3265-6.

9. Madhusudana S.N., Malavalli B.V., Thankappan U.P., Sundramoorthy S., Belludi A.Y., Pulagumbaly S.B., Sanyal S. Development and evaluation of a new immunohistochemistry-based test for the detection of rabies virus neutralizing antibodies. Hum. Vaccin. Immunother. 2014; 10(5):1359–65. DOI: 10.4161/hv.28042.

10. Дедков В.Г., Девяткин А.А., Полещук Е.М., Сафонова М.В., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А. Разработка и апробация набора реагентов для определения РНК классического вируса бешенства методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Вопросы вирусологии. 2016; 61(5):235–240. DOI: 10.18821/0507-4088-2016-61-5-235-240.

11. Гулюкин А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза. Вопросы вирусологии. 2014; 3:5–10.

12. Грибенча С.В., Козлов А.Ю., Костина Л.В., Елаков А.Л., Лосич М.А., Цибезов В.В., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Получение моноклональных антител к нуклеопротеину вируса бешенства. Вопросы вирусологии. 2013; 6:38–43.

13. Кравцов А.Л., Генералов С.В., Кожевников В.А., Гаврилова Ю.К., Абрамова Е.Г., Кочкин А.В., Никифоров А.К. Определение доли инфицированных вирусом бешенства клеток линии Vero с помощью проточной цитометрии. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 3:18–25.

14. Vengatesan D., Raj G.D., Raja A., Ramadass P., Gunaseelan L. Detection of rabies virus antigen or antibody using flow cytometry. Cytometry B Clin. Cytom. 2006; 70(5):335–43. DOI: 10.1002/cyto.b.20104.

15. Mani R.S., Madhusudana S.N. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. Scientific World Journal. 2013; 2013:569712. DOI: 10.1155/2013/569712.

16. Wacharapluesadee S., Phumesin P., Supavonwong P., Khawplod P., Intarut N., Hemachudha T. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. J. Virol. Methods. 2011; 175(2):278–82. DOI: 10.1016/j.jviromet.2011.05.007.

17. Fischer M., Wernike K., Freuling C.M., Müller T., Aylan O., Brochier B., Cliquet F., Vázquez-Morón S., Hostnik P., Huovilainen A., Isaksson M., Kooi E.A., Mooney J., Turcitu M., Rasmussen T.B., Revilla-Fernández S., Smreczak M., Fooks A.R., Marston D.A., Beer M., Hoffmann B. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses – results of a ring trial among European laboratories. PLoS One. 2013; 8(3):e58372. DOI: 10.1371/journal.pone.0058372.

18. Hayman D.T.S., Banyard A.C., Wakeley P.R., Harkess G., Marston D., Wood J.L.N., Cunningham A.A., Fooks A.R. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. J. Virol. Methods. 2011; 177(1):87–93. DOI: 10.1016/j.jviromet.2011.07.002.

19. Faye M., Dacheux L., Weidmann M., Diop S.A., Loucoubar C., Bourhy H., Sall A.A., Faye O. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. J. Virol. Methods. 2017; 243:120–30. DOI: 10.1016/j.jviromet.2016.12.019.

20. Dacheux L., Larrous F., Lavenir R., Lepelletier A., Faouzi A., Troupin C., Nourlil J., Buchy P., Bourhy H. Dual combined real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of lyssavirus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(7):e0004812. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004812.

21. Mani R.S., Madhusudana S.N., Mahadevan A., Reddy V., Belludi A.Y., Shankar S.K. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. J. Med. Virol. 2014; 86(10):1804–12. DOI: 10.1002/jmv.23814.

22. Prabhu K.N., Isloor S., Veeresh B.H., Rathnamma D., Sharada R., Das L.J., Satyanarayana M.L., Hegde N.R., Rahman S.A. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Vet. Sci. 2018; 5(1):24. DOI: 10.3390/vetsci5010024.

23. Beltran F.J., Dohmen F.G., Del Pietro H., Cisterna D.M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. J. Infect. Dev. Ctries. 2014; 8:1016–21. DOI: 10.3855/jidc.4136.

24. Дедков В.Г., Бекова М.В., Девяткин А.А., Кулешов К.В., Полещук Е.М., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области. В кн.: Молекулярная диагностика – 2014: сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. М.; 2014. С. 453–4.

25. Девяткин А.А., Бекова М.В., Дедков В.Г., Полещук Е.М., Шипулин Г.А. Характеристика набора реагентов для выявления РНК вируса бешенства (rabies virus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени «Амплисенс® RABV-FL». Инфекция и иммунитет. 2014; 4(1):61–2.

26. Dedkov V.G., Deviatkin A.A., Poleshchuk E.M., Safonova M.V., Blinova E.A., Shchelkanov M.Yu., Sidorov G.N., Simonova E.G., Shipulin G.A. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2018; 90(1):18–25. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2017.09.009.

27. Онищенко Г.Г., Попова А.Ю., Ежлова Е.Б., Демина Ю.В., Пакскина Н.Д., Писцов М.Н., Рубцов В.В., Суровяткин А.В., Петров А.А., Казанцев А.В., Бережной А.М., Зверев А.Ю., Маношкин А.В., Кротков В.Т., Кутаев Д.А., Максимов В.А., Кузнецов С.Л., Вахнов Е.Ю., Тимофеев М.А., Мовсесянц А.А., Борисевич С.В. Эпидемиологическая обстановка и вопросы идентификации вируса бешенства среди людей на территории Российской Федерации в период 2002–2015 гг. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 3:27–32. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-27-32.

28. Dedkov V.G., Lukashev A.N., Deviatkin A.A., Kuleshov K.V., Safonova M.V., Poleshchuk E.M., Drexler G.F., Shipulin G.A. Retrospective diagnosis of two rabies cases in humans by high throughput sequencing. J. Clin. Virol. 2016; 78:74–81. DOI: 10.1016/j.jcv.2016.03.012.

29. Зайкова О.Н., Гребенникова Т.В., Гулюкин А.М., Шабейкин А.А., Полякова И.В., Метлин А.Е. Молекулярногенетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей. Вопросы вирусологии. 2017; 62(3):101–8. DOI: 10.18821/0507-4088-2017-62-3101-108.

30. Полещук Е.М., Сидоров Г.Н., Грибенча С.В. Итоги изучения антигенного и генетического разнообразия вируса бешенства в популяциях наземных млекопитающих России. Вопросы вирусологии. 2013; 58(3):9–16.

31. Зайкова О.Н., Гребенникова Т.В., Елаков А.Л., Кочергин-Никитский К.С., Алипер Т.И., Чучалин С.Ф., Гулюкин А.М. Молекулярно-генетическая характеристика геномов полевых изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Кировской области. Вопросы вирусологии. 2016; 61(4):186–92. DOI: 10.18821/0507-4088-2016-61-4-186-192.

32. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Максимов В.А., Марков В.И., Борисевич И.В., Федоров Ю.М. Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний в системе противоэпидемической защиты территории Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001; 6:114–5.

33. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Максимов В.А., Марков В.И., Меркулов В.А., Писцов М.Н., Бережной А.М., Сыромятникова С.И., Зубов В.В. Выделение и идентификация возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) от больного атипичной пневмонией. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003; 5:109–12.

34. Онищенко Г.Г, Васильев Н.Т., Максимов В.А., Писцов М.Н., Степанов Н.Н., Борисевич С.В., Ручко С.В., Евстигнеев О.В., Хамитов Р.А., Зверев А.Ю., Меркулов В.А., Ионов С.Н., Марков В.И., Мовсесянц А.А. Идентификация «уличного» вируса бешенства из биопроб головного мозга погибшего ребенка. Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2009; 1-2(33-34):37–40.

Эффективное лечение бешенства в Москве — все симптомы, диагностика, врачи

Инфекционисты Москвы — последние отзывы

Вызывали на дом врача — инфекциониста. Очень доброжелательный доктор. Видно, что Павел Владимирович понимает что мне было нужно. По ходу приёма специалист осмотрел, проконсультировал в общем по моей ситуации и выписал лечение. Пока прошло мало времени и не могу ничего сказать об эффективности назначений.

Нина, 02 октября 2021

Хороший гастроэнтеролог с большим стажем работы, который себя оправдал. Кирилл Александрович объяснил все факторы, которые могут провоцировать гастрит, прописал необходимые препараты и ответил на все интересующие меня вопросы. Назначенное врачом лечение идет на пользу, сегодня утром у ребенка уже не было рвоты, как обычно.

Алена, 19 сентября 2021

Доктор человечный, внимательный. Ничего плохого сказать не могу. Все было хорошо. На приеме Наталья Петровна меня внимательно выслушала, поверила в то что я сказала, предложила лечение. Результатов нет. Объяснила все понятно, ответила на все вопросы. Было мало времени для приема, я не все рассказала, поэтому хочу еще раз записаться и добавить и что-то подкорректировать. В целом осталась довольна качеством приема.

На модерации, 05 октября 2021

Все хорошо прошло. На приеме Любовь Анатольевна проконсультировала, она задавала вопросы, я задавала. И отвечали, она и я. Мне понравилось. Я записалась на повторный прием. Визит длился минут 15-20 примерно, времени было достаточно.

На модерации, 05 октября 2021

Мне всё понравилось. Врач хороший, который идёт на уступки и говорит по факту что нужно. Никаких жалоб не имею. Она назначила мне сдачу анализов, ответила на вопросы и пояснила конкретно, что я не понимала. Я буду сотрудничать с ней дальше.

Альмана, 04 октября 2021

Доктор внимательный, чуткий, очень деликатный, только положительные качества. Прием я считаю очень нормальный. Юлия Георгиевна дала заключение, что нет противопоказаний к биопсии. Все нормально, претензий нет. Рекомендовала через месяц повторную консультацию. По времени визит длился минут 20-25. Повторно обратился бы. Ничего полого сказать не могу.

Евгений, 04 октября 2021

На приёме доктор выслушал меня, просмотрел анализы, всё мне объяснил, разъяснил, дал свои рекомендации и назначил длительное лечение. Врач внимательный, вежливый, всё понятно и доступно объясняет. Могу рекомендовать данного специалиста своим знакомым, если потребуется и в случае необходимости могу обратиться повторно. Данного врача я выбрал по отзывам и по стажу работы. Качеством приёма я остался доволен.

Арсен, 04 октября 2021

Приём прошёл замечательно. Игорь иванович произвёл на меня впечатление грамотного человека. Он дал полные разъяснения по проблемам и проконсультировал меня. Спасибо!

Ирина, 04 октября 2021

Доктор вежливый, внимательный, мне понравился. На приеме Игорь Иванович назначил исследование, изучил всю информацию которая была, дал рекомендации. Я остался все доловлен. Думаю, что приду еще на повторный прием.

Игорь, 04 октября 2021

Хороший прием, понравился доктор. Любовь Анатольевна провела консультацию, назначила лечение, выписала анализы. Она внимательная, отзывчивая. Всё сделала как нужно, опросила, все оформила и мне выдали больничный.

Ольга, 03 октября 2021

Показать 10 отзывов из 2727

Бешенство у кошек симптомы и лечение

Бешенство у кошек симптомы и лечение

23 апреля 2020

Определить симптомы бешенства у кошек и перейти к лечению на ранних стадиях сложно, поскольку инкубационный период может длиться от 10 дней до 1 года (в некоторых случаях даже дольше). Однако можно приблизительно оценить, сколько времени есть у человека, пострадавшего от зараженного животного, чтобы принять меры.

Клинические симптомы бешенства у кошек развиваются с разной скоростью, в зависимости от следующих факторов:

·         Место укуса. Чем ближе поврежденный участок находится к спинному или головному мозгу, тем быстрее вирус проникнет в нервную ткань.

·         Серьезность раны. Чем глубже укус или царапина, тем выше скорость проявления болезни.

·         Количество клеток вируса в слюне атаковавшего животного. Помните, что зараженные животные не всегда являются распространителями инфекции.

Если вы точно знаете, что вашу кошку повредило животное с симптомами бешенства, то незамедлительно обратитесь в ветеринарную клинику для лечения питомца. В случае, когда вирус попал в организм кошки незаметно для вас, он может развиваться в нескольких формах. У каждой из этих них есть свои признаки:

Буйная форма

·         Сначала снижается активность животного, оно избегает людей и теряет аппетит. В некоторых случаях кошка наоборот становится необычно навязчивой. Кроме того, питомец может активно расчесывать место укуса.

·         Далее бешенство у кошек проявляется такими симптомами, как беспокойство и пугливость, возможна агрессия по отношению к хозяину. Больные питомцы предпочитают питаться несъедобными предметами. Наиболее важный показатель второй фазы – водобоязнь, при которой кошка не может глотать слюну и воду.

·         Последняя стадия характеризуется угнетенным состоянием питомца, появляются судороги и активно развивается паралич.

Тихая форма

Симптомы бешенства те же, что и на 1 и 3 стадиях буйной формы – сначала снижается активность кошки, животное становится ласковым и всюду следует за хозяином, после чего развивается паралич и затрудняется дыхание.

Атипичная форма

Наиболее сложная в диагностике форма бешенства у кошек, которая может длиться 3 и более месяцев без ярко выраженных симптомов. Характеризуется проблемами с кишечником и стулом. На последней стадии может наступить временное улучшение состояние.

Помощь при заражении

Если у кошки появились симптомы, характерные для бешенства, ее следует немедленно показать ветеринарному врачу, который назначит адекватное лечение. Специалисты клиники «Доктор Айболит» с большим стажем работы проводят все необходимые исследования, позволяющие убедиться в том, что симптомы действительно похожи на бешенство в ранней стадии.

В этом случае кошку помещают на карантин, изолируя ее от людей и других животных. Если в течение 10-60 дней (в зависимости от решения ветеринарного врача) состояние питомца улучшается, то карантин прекращается, животному вводят вакцину и выдают рекомендации по дальнейшим действиям его хозяину.

СЛУЧАИ ВЫЗДОРОВЛЕНИЯ ЛЮДЕЙ ОТ БЕШЕНСТВА И ПРИЖИЗНЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ЛИССАВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ | Метлин

1. Hampson K., Coudeville L., Lembo T., Sambo M., Kieffer A., Attlan M., et al. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Negl. Trop. Dis. 2015; 9(4): e0003709

2. Селимов М.А. Пути ликвидации гидрофобии. М.; 1963

3. Jackson A.C., Warrell M.J., Rupprecht C.E., Ertl H.C., Dietzschold B., O’Reilly M., et al. Management of rabies in humans. Clin. Infect. Dis. 2003; 36(1): 60-3

4. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я., ред. Инфекционные болезни: Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2009

5. Jackson A.C. Therapy of Human Rabies. In: Jackson AC, ed. Rabies. Chapter 16. Boston: Academic Press; 2013: 575-89.

6. Emmons R.W., Leonard L.L., DeGenaro F., Protas E.S., Bazeley P.L., Giammona S.T., et al. A case of human rabies with prolonged survival. Intervirology. 1973; 1(1): 60-72.

7. Gode G.R., Raju A.V., Jayalakshmi T.S., Kaul H.L., Bhide N.K. Intensive care in rabies therapy. Clinical observations. Lancet. 1976; 2(7975): 6-8.

8. Грибанова Л.Я., Рудаков В.А., Мальков Г.Б., Грибенча С.В., Селимов М.А. Абортивное бешенство у диких животных в эксперименте. В кн.: Тезисы конференции «Вопросы природной очаговости болезней». Выпуск 10. Алма-Ата; 1979: 183-4.

9. Грибенча С.В., Селимов М.А., Первиков Ю.В. Нелетальное бешенство у белых мышей, зараженных различными штаммами вируса. В кн.: Материалы конференции «Актуальные вопросы вирусных инфекций». Алма-Ата; 1973: 143-4.

10. Грибенча С.В., Баринский И.Ф. Влияние циклофосфана на воспроизведение в эксперименте абортивной и хронической форм бешенства. Вопросы вирусологии. 1982; 27(5): 586-9.

11. Сафаров Р.К., Джмухадзе В.А. Нелетальное бешенство собак. Ветеринария. 1975; (9): 67.

12. Bell J.F., Gonzalez M.A., Diaz A.M., Moore G.J. Nonfatal rabies in dogs: experimental studies and results of a survey. Am. J. Vet. Res. 1971; 32(12): 2049-58.

13. Fekadu M., Baer G.M. Recovery from clinical rabies of 2 dogs inoculated with a rabies virus strain from Ethiopia. Am. J. Vet. Res. 1980; 41(10): 1632-4.

14. Hamir A.N., Neizgoda M., Rupprecht C.E. Recovery from and clearance of rabies virus in domestic ferret. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Sci. 2011; 50(2): 248-51.

15. Kesdangsakonwut S., Sunden Y., Aoshima K., Iwaki Y., Okumura M., Sawa H., et al. Survival of rabid rabbits after intrathecal immunization. Neuropathology. 2014; 34(3): 277-83.

16. Подберезный Г.Г. Редкий случай легкой формы бешенства, закончившейся выздоровлением. В кн.: Сборник научных работ врачей Кировоградской области. Выпуск 2. Кировоград; 1958: 137-8

17. Fuerst H.T. Recovery from rabies in man. JAMA. 1966; 197(3): 224.

18. Hattwick M.A., Weis T.T., Stechschulte C.J., Baer G.M., Gregg M.B. Recovery from rabies. A case report. Ann. Intern. Med. 1972; 76(6): 931-42.

19. Willoughby R.E., Tieves K.S., Hoffman G.M., Ghanayem N.S., Amlie-Lefond C.M., SchwabeM.J., et al. Survival after treatment of rabies with induction of coma. N. Engl. J. Med. 2005; 352(24): 2508-14.

20. Subramaniam R. Human Rabies Survivors in India: An Emerging Paradox? PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(7): e0004774. doi: 10.1371/journal.pntd.0004774

21. Jackson A.C. Current and future approaches to the therapy of human rabies. Antiviral Res. 2013; 99(1): 61-7.

22. Jackson A.C. Recovery from rabies: a call to arms. J. Neurol. Sci. 2014; 339(1-2): 5-7.

23. Weyer J., Msimang-Dermaux V., Paweska J.T., le Roux K., Govender P., Coertse J., et al. A case of human survival of rabies, South Africa. S. Afr. J. Infect. Dis. 2015; 1(1): 1-3.

24. Wilde H., Hemachudha T. The “Milwaukee protocol” for treatment of human rabies is no longer valid. Pediatr. Infect. Dis. J. 2015; 34(6): 678-9.

25. Porras C., Barboza J.J., Fuenzalida E., Adaros H.L., Oviedo A.M., Furst J. Recovery from rabies in man. Ann. Intern. Med. 1976; 85(1): 44-8.

26. Tillotson J.R., Axelrod D., Lyman D.O. Epidemiologic notes and reports: Rabies in laboratory worker — New York. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 1977; 26(22): 183-4.

27. Tillotson J.R., Axelrod D., Lyman D.O. Follow-up on rabies — New York. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 1977; 26: 249-50.

28. Alvarez L., Fajardo R., Lopez E., Pedroza R., Hemachudha T., Kamolvarin N., et al. Partial recovery from rabies in a nine-year-old boy. Pediatr. Infect. Dis. J. 1994; 13(12): 1154-5.

29. Madhusudana S.N., Nagaraj D., Uday M., Ratnavalli E., Kumar M.V. Partial recovery from rabies in a six-year-old girl. Int. J. Infect. Dis. 2002; 6(1): 85-6.

30. Rubin J., David D., Willoughby R.E., Rupprecht C.E, Garcia C., Guarda D.C, et al. Applying the Milwaukee protocol to treat canine rabies in Equatorial Guinea. Scand. J. Infect. Dis. 2009; 41(5): 372-5.

31. Ministerio da Saude in Brazil. Rabies, human survival, bat — Brazil: (Pernambuco). Available at: http://www.promedmail.org

32. Caicedo Y., Paez A., Kuzmin I., Niezgoda M., Orciari L.A., Yager P.A., et al. Virology, immunology and pathology of human rabies during treatment. Pediatr. Infect. Dis. J. 2015; 34(5): 520-8.

33. Karahocagil M.K., Akdeniz H., Aylan O., Sünnetçioğlu M., Ün H., Yapici K., et al. Complete recovery from clinical rabies: case report. Turkiye Klinikleri J. Med. Sci. 2013; 33(2): 547-52.

34. Holzmann-Pazgal G., Wanger A., Degaffe G., Rose C., Heresi G., Amaya R., et al. Presumptive abortive human rabies — Texas, 2009. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2010; 59(7): 185-90.

35. Wiedeman J., Plant J., Glaser C., Messenger S., Wadford D., Sheriff H., et al. Recovery of a patient from clinical rabies — California, 2011. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2012; 61(4): 61-5.

36. Rawat A.K., Rao S.K. Survival of rabies patient. Indian Pediatr. 2011; 48(7): 574.

37. Souza A., Madhusudana S.N. Survival from rabies encephalitis. J. Neurol. Sci. 2014; 339(1-2): 8-14.

38. Netravathi M., Udani V., Mani R.S., Gadad V., Ashwini M.A., Bhat M., et al. Unique clinical and imaging findings in a first ever documented PCR positive rabies survival patient: A case report. J. Clin. Virol. 2015; 70: 83-8.

39. Galvez S., Basque M., Contreras L., Merino C., Ahumada R., Jamett J., et al. Survivor of rabies encephalitis in Chile. In: Platform presentation at the XXIVth International Meeting on Research Advancees and Rabies Control in the Americas in Toronto, Ontario, Canada on October. Volume 27. Toronto; 2013.

40. Karande S., Muranjan M., Mani R.S., Anand A.M., Amoghimath R., Sankhe S., et al. Atypical rabies encephalitis in a six-year-old boy: clinical, radiological, and laboratory findings. Int. J. Infect. Dis. 2015; 36: 1-3.

41. Hindustan times. Thakur B.S. 2nd rabies survivor in country at P’kula hospital. Available at: Scholar http://www.hindustantimes.com/chandigarh/2nd-rabies-survivor-in-country-at-p-kula-hospital/story-QblNMMmnXcSynC21JPzE4O.html

42. Kumar K.H., Ahmad F., Dutta V. Pituitary cachexia after rabies encephalitis. Neurol. India. 2015; 63(2): 255-6.

43. Manoj S., Mukherjee A., Johri S., Kumar K.V. Recovery from rabies, a universally fatal disease. Mil. Med. Res. 2016; 3: 21. doi: 10.1186/s40779-016-0089-y

44. Dacheux L., Reynes J.M., Buchy P., Sivuth O., Diop B.M., Rousset D., et al. A reliable diagnosis of human rabies based on analysis of skin biopsy specimens. Clin. Infect. Dis. 2008; 47(11): 1410-7.

45. Wacharapluesadee S., Hemachudha T. Ante- and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Rev. Mol. Diagn. 2010; 10(2): 207-18.

46. Mani R.S., Madhusudana S.N. Laboratory Diagnosis of Human Rabies: Recent Advances. Sci. World J. 2013; 2013: 569712.

47. Schneider L.G. The cornea test: A new method for intravitam diagnosis of rabies. Zentralbl. Veterinarmed. B. 1969; 16(1): 24-3.

48. Cifuentes E., Calderon E., Diglenga G. Rabies in a child diagnosed by a new intravitam method: The cornea test. J. Trop. Med. Hyg. 1971; 74: 23-5.

49. Spector S., Hodinka R., Young S., eds. Clinical Virology Manual. 3rd ed. Washington DC: ASM Press; 2000.

50. Nagaraj T., Vasanth J., Desai A., Kamat A., Madhusudana S.N., Ravi V. Ante mortem diagnosis of human rabies using saliva samples: Comparison of real time and conventional RT-PCR techniques. J. Clin. Virol. 2006; 36(1): 17-23.

51. Udow S.J., Marrie R.A., Jackson A.C. Clinical features of dog- and bat-acquired rabies in humans. Clin. Infect. Dis. 2013; 57: 689-96.

52. Баширова Д.К., Хисматуллина Н.А., Шафеев М.Ш., Шакиров Т.Н., Убасев А.Г., Ходиерова И.Ю. и др. Прижизненная клинико-лабораторная диагностика гидрофобии. Казанский медицинский журнал. 2007; 88(5): 449-52.

53. Фазылов В.Х., Муртазина Г.Х., Урманчеева Ю.Р., Мингажева Р.И. Диагностика бешенства (клинический случай). Практическая медицина. 2014; 83(7): 121-3.

54. Хисматуллина Н.А., Гулюкин А.М., Гулюкин М.И., Иванов А.В., Сабирова В.В., Южаков А.Г. и др. Два случая гидрофобии в Республике Татарстан: прижизненная и постмортальная лабораторная диагностика. Вопросы вирусологии. 2015; 60(2): 18-24.

55. Willoughby R.E. A cure for a rabies? Sci. Am. 2007; 296(4): 88-95.

56. Willoughby R.E. Are we getting closer to the treatment of rabies? Future Virol. 2009; 4(6): 563-70.

57. Willoughby R.E. Resistance to Rabies. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2012; 87(2): 205.

58. Aramburo A., Willoughby R.E., Bollen A.W., Glaser C.A., Hsieh C.J., Davis S.L., et al. Failure of the Milwaukee protocol in a child with rabies. Clin. Infect. Dis. 2011; 53(6): 572-4. doi: 10.1093/cid/cir483

59. Hunter M., Johnson N., Hedderwick S., McCaughey C., Lowry K., McConville J., et al. Immunovirological correlates in human rabies treated with therapeutic coma. J. Med. Virol. 2010; 82(7): 1255-65.

60. Гайдамович С.Я. К изучению некоторых случаев бешенства у человека. В кн.: Косяков П.Н., Шен Р.М., Горшунова Л.П., ред. Бешенство (этиология, патогенез, профилактика). М.: Медгиз; 1958: 99-102

CDC — Диагностика: у животных и людей

Диагностика у животных

Диагноз бешенства может быть поставлен после обнаружения вируса бешенства в любой части пораженного мозга, но для исключения бешенства тест должен включать ткань по крайней мере из двух мест в головном мозге, предпочтительно из ствола мозга и мозжечка.

Тест требует усыпления животного. Сам тест занимает около 2 часов, но требуется время, чтобы взять образцы мозга у животного, подозреваемого на бешенство, и отправить эти образцы в государственную лабораторию здравоохранения или ветеринарную диагностическую лабораторию для диагностики.

В США результаты теста на бешенство обычно доступны в течение 24–72 часов после сбора и эвтаназии животного. Поскольку контакт с подозрительными животными на бешенство является неотложной медицинской, но не критической ситуацией, тестирования в этот период более чем достаточно для определения того, контактировал ли человек с бешеным животным, и требует вакцинации от бешенства после контакта.

Приблизительно 120 000 или более животных ежегодно проверяются на бешенство в Соединенных Штатах, и приблизительно 6% из них обнаруживают бешенство.Доля положительных животных в значительной степени зависит от вида животных и колеблется от <1% у домашних животных до> 10% у диких животных.

Основываясь на рутинных исследованиях общественного здравоохранения и патогенеза, мы узнали, что нет необходимости усыплять и тестировать всех животных, которые кусают или иным образом потенциально могут подвергнуть человека заражению бешенством. Для животных с низкой вероятностью бешенства, таких как собаки, кошки и хорьки, периоды наблюдения (10 дней) могут быть подходящими, чтобы исключить риск потенциального заражения человека бешенством.

Консультации с местным или государственным медицинским работником после потенциального воздействия могут помочь определить наилучший курс действий на основе текущих рекомендаций общественного здравоохранения.

Диагностика у человека

Для диагностики предубойного бешенства (перед смертью) у людей необходимо несколько тестов; одного теста недостаточно. Тесты проводятся на образцах слюны, сыворотки, спинномозговой жидкости и биопсии кожи волосяных фолликулов в задней части шеи. Слюну можно проверить путем выделения вируса или обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР).Сыворотка и спинномозговая жидкость проверяются на антитела к вирусу бешенства. Образцы биопсии кожи исследуются на наличие антигена бешенства в кожных нервах у основания волосяных фолликулов.

CDC — Диагностика: у животных и людей

Диагностика у животных

Диагноз бешенства может быть поставлен после обнаружения вируса бешенства в любой части пораженного мозга, но для исключения бешенства тест должен включать ткань по крайней мере из двух мест в головном мозге, предпочтительно из ствола мозга и мозжечка.

Тест требует усыпления животного. Сам тест занимает около 2 часов, но требуется время, чтобы взять образцы мозга у животного, подозреваемого на бешенство, и отправить эти образцы в государственную лабораторию здравоохранения или ветеринарную диагностическую лабораторию для диагностики.

В США результаты теста на бешенство обычно доступны в течение 24–72 часов после сбора и эвтаназии животного. Поскольку контакт с подозрительными животными на бешенство является неотложной медицинской, но не критической ситуацией, тестирования в этот период более чем достаточно для определения того, контактировал ли человек с бешеным животным, и требует вакцинации от бешенства после контакта.

Приблизительно 120 000 или более животных ежегодно проверяются на бешенство в Соединенных Штатах, и приблизительно 6% из них обнаруживают бешенство. Доля положительных животных в значительной степени зависит от вида животных и колеблется от <1% у домашних животных до> 10% у диких животных.

Основываясь на рутинных исследованиях общественного здравоохранения и патогенеза, мы узнали, что нет необходимости усыплять и тестировать всех животных, которые кусают или иным образом потенциально могут подвергнуть человека заражению бешенством.Для животных с низкой вероятностью бешенства, таких как собаки, кошки и хорьки, периоды наблюдения (10 дней) могут быть подходящими, чтобы исключить риск потенциального заражения человека бешенством.

Консультации с местным или государственным медицинским работником после потенциального воздействия могут помочь определить наилучший курс действий на основе текущих рекомендаций общественного здравоохранения.

Диагностика у человека

Для диагностики предубойного бешенства (перед смертью) у людей необходимо несколько тестов; одного теста недостаточно.Тесты проводятся на образцах слюны, сыворотки, спинномозговой жидкости и биопсии кожи волосяных фолликулов в задней части шеи. Слюну можно проверить путем выделения вируса или обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Сыворотка и спинномозговая жидкость проверяются на антитела к вирусу бешенства. Образцы биопсии кожи исследуются на наличие антигена бешенства в кожных нервах у основания волосяных фолликулов.

Прижизненная диагностика и профилактика человеческого бешенства

Реферат

Человеческое бешенство по-прежнему остается серьезной проблемой для здоровья в Индии и других развивающихся странах, где собаки являются основными переносчиками инфекции.Бешенство у человека может проявляться в двух клинических формах: бешеной и паралитической. Хотя диагноз бешеного бешенства можно поставить на основании типичных симптомов и признаков, паралитическое бешенство ставит диагностическую дилемму для неврологов, которые могут столкнуться с этими случаями в своей практике. Хотя есть определенные клинические признаки, которые отличают это заболевание от других форм синдромов Гийена-Барре, для подтверждения диагноза может потребоваться лабораторная помощь. Обычные методы, такие как обнаружение антигена, анализы антител и выделение вируса, имеют ограниченный успех.Недавно представленные молекулярные методы показывают большие перспективы в подтверждении случаев паралитического бешенства. В лечении подтвержденных случаев бешенства не было большого успеха, а выздоровление от бешенства встречается крайне редко. Поэтому профилактика этой страшной болезни после заражения становится чрезвычайно важной. В настоящей статье рассматривается текущее состояние бешенства у людей с точки зрения прижизненной диагностики, ведения болезни и постконтактной профилактики.

Ключевые слова: Диагностика, полимеразная цепная реакция, бешенство

Введение

Бешенство — старейшее и наиболее опасное заболевание человека, известное человеку — вызывает острый прогрессирующий неизлечимый энцефаломиелит, вызываемый высоко нейротропным вирусом ssRNA, таксономически классифицированным в этом роду Вирус Lyssa и семейство Rhabdoviridae.Бешенство у человека может проявляться в двух клинических формах: бешеной и паралитической. В то время как диагноз бешеного бешенства может быть поставлен по характерным симптомам и признакам, паралитическое бешенство ставит перед неврологами диагностическую дилемму. Хотя есть определенные клинические признаки, которые отличают это заболевание от различных форм синдромов Гийена-Барре, для подтверждения диагноза может потребоваться обширная лабораторная помощь. Неврологи в развивающихся странах могут столкнуться со случаями бешеного энцефалита, особенно с атипичными и паралитическими формами, а также со случаями психиатрических проявлений в течение многих лет.Для диагностики бешенства в лабораториях был проведен ряд лабораторных тестов, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. Обычные методы, такие как обнаружение антигена, анализы антител и выделение вируса, отнимают много времени и имеют ограниченный успех. В настоящее время огромное внимание уделяется прижизненной диагностике бешенства. Например, сообщается о выживаемости пациентов с водобоязнью из различных географических точек по всему миру и из развивающихся стран, таких как Индия.[1,2] Существует возрастающая потребность в принятии мер контроля, поскольку человеческое бешенство по-прежнему остается серьезной проблемой для здоровья, а бродячие собаки являются основными переносчиками инфекции. Недавно были внедрены молекулярно-биологические методы для подтверждения диагноза паралитического бешенства, и они весьма многообещающие. Таким образом, прижизненное тестирование на бешенство приобретает все большее значение, поскольку задержка с постановкой диагноза может привести к заражению инструментов в отделениях интенсивной терапии и ненужным требованиям постконтактной профилактики для посторонних лиц и медперсонала.В недавнем прошлом в области бешенства был достигнут ряд успехов, особенно в понимании молекулярной биологии вируса, молекулярной эпидемиологии, патогенеза и профилактики заболевания. Необходимо сосредоточить больше усилий на прижизненной диагностике и лечении этой страшной инфекции бешенства. Цель этой обзорной статьи — выделить некоторые из этих аспектов, которые будут интересны неврологу в его повседневной практике, с акцентом на диагностические дилеммы, возникающие при атипичных и паралитических случаях бешенства, доступные новые методы диагностики, недавние усилия в лечение болезни и современные профилактические меры.

Вирус

Вирус бешенства представляет собой вирус с одноцепочечной РНК отрицательного смысла, принадлежащий к роду Lyssavirus и семейству Rhabdoviridae. Это вирус с оболочкой в ​​форме пули размером 180 нм × 75 нм. Оболочка окружена многочисленными шипами, состоящими из гликопротеина (G), которые необходимы для прикрепления вируса к рецепторам, а также являются основным белком для индукции нейтрализующих антител. Другими важными белками являются рибонуклеопротеин (N), который тесно связан со спиральной РНК, фосфопротеин (P) и матричный белок (M) [].В геноме бешенства около 12 000 нуклеотидов. Было идентифицировано семь генотипов вируса из разных частей мира. В Индии и других странах Азии преобладает только генотип 1.

(A) Схематическое изображение внутренней структуры вируса бешенства и положения различных вирусных белков. (B) Прямое иммунофлуоресцентное окрашивание свежего мазка головного мозга человека с поликлональными антителами к нуклеокапсиду, меченным FITC, ярко-зеленовато-желтыми флуоресцентными частицами антигена бешенства на стороне нейрона и вдоль аксонов.× 600. Врезка: эозинофильные интрацитоплазматические тельца Негри в соме нейронов × 360. (C) Клетки BHK 21, инфицированные штаммом CVS бешенства в RFFIT. × 600

Патогенез и патология

Заражение человека вирусом бешенства почти всегда происходит через укус инфицированного животного, при этом собаки являются основным переносчиком. Может происходить прямая передача инфекции через нервную систему из места укуса, и в этом случае инкубационный период обычно бывает коротким, иногда даже неделей, если в месте раны имеется достаточное количество нервных окончаний, обнаженных.Однако в большинстве случаев вирус претерпевает период репликации в обнаженных мышцах, прежде чем попадет в двигательные или сенсорные нервы, снабжающие мышцы. [3] Никотиновые рецепторы ацетилхолина были идентифицированы как основные рецепторы вируса бешенства. [4] После первоначальной репликации вирус поднимается в аксоплазме нервов к спинному мозгу, а затем к головному мозгу, где происходит быстрое размножение, охватывающее почти все области мозга. Первоначальное поражение гиппокампа, гипоталамуса и областей лимбической системы может объяснить некоторые драматические клинические особенности.Несмотря на обширную репликацию вируса в головном мозге, патологические данные минимальны. Единственным специфическим и диагностическим патологическим признаком является наличие телец Негри. Недавние данные показали, что неправильное функционирование нейромедиаторов в головном мозге может играть роль в патогенезе [5]. Некоторые исследования предполагают, что апоптоз нейронов, а не некроз играет роль в патогенезе бешенства, приводящем к летальному исходу. [6]

Клинические признаки

Развитие бешеного энцефалита у человека, подвергшегося воздействию, зависит от нескольких факторов, а именно.тяжесть укуса, место укуса, содержание вируса в слюне и, возможно, некоторые неспецифические иммунные факторы хозяина. Трансдермальные укусы головы, шеи и рук несут самый высокий риск и обычно связаны с более коротким инкубационным периодом. Однако укусы нижних конечностей более распространены, и, как показало недавнее исследование в Индии, у 80% всех случаев бешенства у людей были укусы ног. Также известно, что не каждый укус бешенства приводит к клиническому бешенству. Смертность от бешенства среди непривитых жертв укусов колеблется от 35 до 57%.[7] После непостоянного инкубационного периода у пациента развивается либо классическое и более часто встречающееся яростное бешенство, либо менее распространенное паралитическое (немое) бешенство.

Инкубационный период

Инкубационный период бешенства является наиболее изменчивым из всех острых инфекций ЦНС. Средний инкубационный период составляет около 1-3 месяцев, но может варьироваться от менее 7 дней до 6 лет. До сих пор не ясно, почему существует такой изменчивый и продолжительный инкубационный период. Инкубационный период может зависеть от нескольких факторов, включая плотность рецепторов вируса бешенства в пораженной ткани, степень иннервации в тканях, количество инокулированного вируса и свойства красителя вируса бешенства.[8] Предполагается, что случаи с необычно продолжительным инкубационным периодом могут быть связаны с тривиальным воздействием, которое считается незначительным и поэтому не раскрывается. Также возможно, что в некоторых случаях человеческого бешенства в анамнезе не было укусов. По нашему опыту в НИМХАНС с 1993 по 2004 год, 2 случая из 37 подтвержденных вскрытием случаев бешенства не показали укусов животных. В Таиланде почти 6% из 707 случаев заболевания людей бешенством за последние два десятилетия не имели укусов в анамнезе [9].

Продромальные симптомы

За исключением местных симптомов в месте укуса или укуса конечности, они обычно нечеткие и неспецифические.Может быть лихорадка, недомогание, генерализованная майалгия и чувство «плохого самочувствия». Почти в 50% случаев паралитического бешенства и 30% случаев бешеного бешенства местные проявления в виде зуда, боли или парестезии в месте укуса могут быть самым ранним симптомом, который часто игнорируется пациентом и игнорируется врачом. . Позднее этот симптом может охватывать всю укушенную конечность. Сенсорная функция обычно не нарушена, и на этом этапе нет явной слабости укушенной конечности.

Острая неврологическая фаза

В течение нескольких часов или нескольких дней после продрома пациенты с бешенством входят в острую неврологическую фазу. Две трети пациентов страдают энцефалитом или бешеной формой, а остальные страдают параличом или состоянием, напоминающим синдром Гийена-Барре (СГБ). Больные энцефалитической формой болезни обычно умирают в течение 3-4 дней; однако может быть длительное течение болезни, иногда до 15 дней в случае паралитического бешенства, особенно если эти пациенты проходят лечение в отделениях интенсивной терапии.Случай паралитического бешенства в неврологической службе Национального института психического здоровья и неврологии (NIMHANS), Бангалор, Индия, в этих условиях продолжался до 45 дней.

Яростное бешенство

Самым ранним проявлением яростного бешенства является нервозность и гиперактивность, напоминающие острую тревожную реакцию, часто связанную с умеренной или высокой лихорадкой. Первоначально мышление сохраняется, но продолжительность концентрации внимания сокращается, и в течение нескольких часов развиваются три типичных особенности яростного бешенства: фобические спазмы, колебания сознания и признаки вегетативной дисфункции.

Типичные фобические спазмы включают водобоязнь и аэрофобию. Они наблюдаются почти у всех пациентов с бешеным бешенством, хотя они могут отсутствовать на более поздних стадиях болезни, когда наступают сонливость и кома. Термин «гидрофобия» происходит от греческого слова, означающего «боязнь воды». Этот термин почти синонимичен бешенству у людей. Аэрофобия и водобоязнь могут быть продемонстрированы путем обдува или обдува лица или грудной клетки воздухом, а также путем предложения пациенту проглотить воду или простого предложения стакана воды.Интенсивная пугающая реакция возникает в результате спазмов дополнительных дыхательных мышц шеи, мышц глотки и диафрагмы, за которыми следует разгибание шеи и ощущение одышки. Во время этих эпизодов они чрезвычайно возбуждены и демонстрируют испуганное выражение лица. Патофизиологический механизм гидрофобии, которая наблюдается только у людей, а не у бешеных животных, до сих пор не ясен. Психическое состояние чередуется между периодами возбуждения и очевидным нормальным психическим состоянием.По мере прогрессирования болезни замешательство становится серьезным, и пациенты становятся дикими и агрессивными. Период возбуждения постепенно сменяется нарушением сознания и комой.

Признаки вегетативной дисфункции включают повышенное слюноотделение, аномалии зрачков, такие как суженные или расширенные зрачки, анизокорию, генерализованную пилоэрекцию, чрезмерное потоотделение, приапизм и, в редких случаях, спонтанную эякуляцию. Иногда пациенты могут проявлять типичные черты мании, повышенного сексуального возбуждения, попыток изнасилования, все из которых может заставить пациентов попасть в психиатрические клиники.[10]

Паралитическое (немое) бешенство

Эта форма бешенства встречается примерно у 20% пациентов, часто с диагностическими проблемами. Основные основные признаки бешеного бешенства могут никогда не проявиться или проявиться на очень поздней стадии болезни и могут быть очень легкими. Слабость обычно начинается в укушенной конечности, а затем постепенно распространяется на все конечности, а также мышцы глотки и гортани. Слабость лица — общая черта. Некоторые из признаков, которые могут отличать паралитическое бешенство от синдрома Гийена-Барре:

1. Лихорадка почти всегда присутствует при паралитическом бешенстве, но обычно отсутствует в случаях СГБ после развития слабости, если за этим не последуют такие осложнения, как аспирационная пневмония.

2. Сенсорная функция не нарушена при паралитическом бешенстве, за исключением начальной парестезии в месте укуса.

3. Квадрипарез с преимущественным поражением проксимальных мышц и недержание мочи всегда обнаруживаются на ранних стадиях паралитического бешенства. В случае СГБ недержание мочи встречается редко. При СГБ, особенно на ранней стадии, поражаются как проксимальные, так и дистальные мышцы.

4. Перкуторный миодема может присутствовать как на ранних, так и на поздних стадиях паралитического бешенства.Лучше всего это проявляется при перкуссии грудной клетки, дельтовидной или бедренной области и состоит из утолщения части мышцы в месте перкуссии, которая затем сглаживается и исчезает в течение нескольких секунд. Он не наблюдается у пациентов с СГБ, энцефалитической формой бешенства или у пациентов с неврологическими осложнениями после вакцинации против бешенства типа Семпл.

5. Генерализованные или очаговые фасцикуляции часто присутствуют у пациентов с паралитическим бешенством.

Гидрофобия необычна и может быть конечным проявлением паралитической формы болезни.Выживание обычно дольше, чем в бешеной форме. В конце концов, бульбарные и дыхательные мышцы парализованы, что приводит к смерти из-за остановки сердца и дыхания. Хотя отличительной чертой паралитического бешенства является восходящий паралич, иногда могут наблюдаться такие черты яростного бешенства, как беспокойство, аэрофобия, инспираторные спазмы и изменение сенсориума, особенно на терминальных стадиях, что приводит к наложению симптомов между двумя формами. Эти особенности, если они есть, дают ключ к диагностике бешенства, а не GBS.

Патогенетическая основа двух различных клинических форм бешенства неизвестна. Нет разницы в штаммах вирусов, вызывающих бешеную и паралитическую формы заболевания, и не коррелирует с инкубационным периодом или местом укуса. Однако паралитическое бешенство чаще наблюдается у пациентов, которые проходят частичный курс вакцинации против бешенства Семпл или клеточной культуры. Возможно, паралитическое бешенство является результатом иммунопатологической атаки на инфицированные вирусом клетки головного и спинного мозга.[11]

Клиническое исследование — МРТ

Компьютерные томографические (КТ) исследования мозга обычно являются нормальными при обеих формах бешенства, хотя были описаны гиподензивные поражения коры головного мозга и базальных ганглиев. [12] На магнитно-резонансной томографии (МРТ) мозга были описаны как нормальные особенности, так и повышенная интенсивность сигнала в областях серого вещества [13]. Прижизненная МРТ показала предрасположенность к поражению ствола мозга, гиппокампа и гипоталамуса в обеих клинических формах.МРТ в пяти случаях (2 яростных и 3 паралитических) продемонстрировала нечеткую гиперинтенсивность на Т2-взвешенных изображениях ствола мозга, гиппокампа, гипоталамуса, подкоркового и глубокого белого вещества и коркового серого вещества уже на 3-й день от начала заболевания, даже когда сознание было сохранено. [14] Поражения с повышенной контрастностью наблюдались в стволе головного мозга, гипоталамусе и корешках спинномозговых нервов только тогда, когда пациенты впадали в кому. На Т2-взвешенных изображениях с градиентным эхосигналом передний рог спинного мозга был обнаружен вовлеченным в обе клинические формы бешенства.

Лабораторные исследования

Электроэнцефалограмма (ЭЭГ) может быть нормальной или показывать неспецифические отклонения при бешенстве человека. Наблюдались медленные волны активности, а также периодическая активность эпилептических форм [15]. Гематологические и биохимические исследования обычно в норме. Анализ спинномозговой жидкости (СМЖ) может быть нормальным или может показывать плеоцитоз и небольшое повышение концентрации белка.

Сыворотка, спинномозговая жидкость, слюна и ткани, такие как кожа, из анатомических областей с высокой иннервиейностью являются подходящими биологическими образцами для прижизненной диагностики, и все эти образцы следует рассматривать как потенциально инфекционные, см. [См.].Появление высокого титра антител к специфическим вирусным антигенам в тестах на нейтрализацию сыворотки является диагностическим показателем у пациента с энцефалитом, не иммунизации в анамнезе. Специфические антитела против бешенства обычно появляются через 7 дней после болезни у непривитого пациента и могут быть хорошим диагностическим маркером в случаях паралитического бешенства, которые обычно выживают дольше. [16] При паралитическом бешенстве могут присутствовать как сывороточные, так и CSF-антитела, и демонстрация значительных уровней антител в CSF может дифференцировать паралитическое бешенство от энцефаломиелита в результате введения вакцины против бешенства Семпла.[17] Однако наличие антител в сыворотке и спинномозговой жидкости у уже вакцинированного пациента следует интерпретировать с осторожностью, и подтверждающий диагноз может быть поставлен только после демонстрации значительного повышения титра антител между первым и вторым образцами, взятыми после 7-10 дней.

Таблица 1

Доступность прижизненной диагностики человеческого бешенства

PCR на слюне для вирусной нуклеиновой кислоты 901 51 Требуется время

Анализы	Образцы	Специфичность%	Чувствительность%	Примечания
мазок на роговице	90	30	Не очень чувствителен
DFA при биопсии кожи (антиген)	Затылочная кожа	100	50-70	Более чувствительна, чем тест роговицы
Слюна	100	50-70	Умеренная чувствительность
ПЦР в слюне на вирусную нуклеиновую кислоту в реальном времени	Слюна	100	70-80	Более высокая чувствительность	Выделение вируса из слюны с помощью RTCIT	Слюна	100	70-80
Обнаружение антител * в сыворотке / спинномозговой жидкости с помощью RFFIT	Сыворотка и спинномозговая жидкость	100	70	Требуется время

Изоляты вирусов могут быть получены путем посева на культуре животных слюны или мазков из полости рта, хотя их применение в клинических условиях ограничено.Эти образцы могут быть исследованы на вирусную нуклеиновую кислоту. Вирусный антиген может быть обнаружен с помощью теста на прямые флуоресцентные антитела (DFA) на материале биопсии головного мозга, собираемом обычно во время post mortem для установления окончательного диагноза [], слепков прикосновения роговицы или биопсии полной толщины затылочной части кожи из волосистой части шеи. .

Тест мазка роговицы с помощью флуоресцентного теста на антитела (FAT)

Антиген вируса бешенства может быть обнаружен с помощью простого теста FAT на эпителии роговицы на терминальных стадиях заболевания. Intra vitam диагностика бешенства с помощью теста на флуоресцентные антитела (FAT) в оттиске роговицы была впервые описана Schneider на животных и Cifuentes et al. у людей. [18,19] Методология этого теста включает осторожное трение плоской поверхности чистого предметного стекла микроскопа о каждую роговицу. Образцы берутся с максимальной осторожностью из-за риска необратимого повреждения роговицы. Мазок, как обычно, фиксируется в ацетоне и подвергается стандартной FAT. Обычно антиген имеет характерную форму круглых или овальных внутрицитоплазматических включений в эпителиальных клетках роговицы.Чувствительность теста сравнительно низкая и зависит от стадии заболевания. Mathuranayagam et al. показал, что надежность оттисков роговицы для диагностики бешенства ограничена, особенно когда забор образцов проводится в полевых условиях, и отрицательный результат не может исключить диагноз бешенства [20].

Биопсия затылочной кости

Было показано, что исследование материала биопсии кожи является ценным методом для диагностики intra vitam у животных и людей.[21,22]

Blenden et al. обнаружил, что 25-50% пациентов показали положительные результаты иммунофлуоресценции в отношении антигена вируса бешенства, а доля положительных результатов на ранней стадии клинического заболевания увеличивалась по мере прогрессирования заболевания. [23] Тест прост, и для отбора пробы необходимо взять срез кожи диаметром 5-6 мм из задней части шеи по линии роста волос. Срез биопсии должен содержать минимум 10 волосяных фолликулов и должен иметь достаточную глубину до подкожной плоскости, чтобы охватить кожные нервы у основания волосяного фолликула.Не следует добавлять консерванты или дополнительные жидкости. Ткань, как обычно, фиксируется в ацетоне и подвергается стандартной FAT на криосрезе. Антиген обычно присутствует в нервных волокнах, окружающих основу волосяных фолликулов. Прежде чем дать отрицательный результат, необходимо изучить не менее двадцати серийных секций. Результат не связан со статусом антител пациента. По мере прогрессирования болезни тест становится более чувствительным. Исследование биопсии кожи может также использоваться для посмертной диагностики в странах, где вскрытие черепа мертвого человека не принято по культурным и религиозным причинам.

Обнаружение РНК в слюне и спинномозговой жидкости с помощью ПЦР

Демонстрация вирусной нуклеиновой кислоты в слюне, спинномозговой жидкости, мазке роговицы, биопсии кожи с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) представляется весьма многообещающим для прижизненной диагностики человеческого бешенства [] . Для обнаружения бешенства описаны как обычная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), так и ПЦР в реальном времени (TaqMan). Smith et al. сообщили об использовании полугнездовой ОТ-ПЦР для быстрой диагностики ante mortem в течение 36 часов с момента подачи образца в случае подозрения на бешенство, где тест на флуоресцентные антитела (FAT), тест на прививку мышей (MIT) и инфекция культур тканей от бешенства Тест (RTCIT) дал отрицательный результат.Smith et al. стандартизированная полувложенная ОТ-ПЦР с последующим автоматическим секвенированием и подтвердила присутствие классического вируса бешенства (генотип 1) как в образцах слюны, так и в образцах кожи через 36 часов [24]. Nagaraj et al. оценил применимость традиционной ОТ-ПЦР и SYBR Green ПЦР в реальном времени для диагностики ante mortem бешенства с использованием образцов слюны. Было обнаружено, что анализ ПЦР в реальном времени более чувствителен, чем обычный анализ ОТ-ПЦР, что подчеркивает полезность молекулярных диагностических тестов для установления диагноза ante mortem бешенства с использованием образцов слюны в течение нескольких часов.[25] Поскольку секреция вируса бешенства в слюну носит прерывистый характер, его выделение из слюны не всегда может давать успешные результаты. В редких случаях вирус был изолирован из спинномозговой жидкости пациентов. Saengseesom et al. провела исследование по выявлению присутствия вируса бешенства в слюне и спинномозговой жидкости у собак с подозрением на бешенство во время карантина с помощью анализа на основе ОТ-ПЦР в реальном времени SYBR Green для обнаружения РНК вируса бешенства. Положительные образцы спинномозговой жидкости были обнаружены у 4 из 15 собак (27%), образцы слюны которых были исследованы.Интервал времени от сбора пробы до получения результата составлял менее 5 часов. Их исследование показало, что, поскольку вирус может отсутствовать или присутствовать в очень низких концентрациях в клинических жидкостях, образцы, взятые для предубойной диагностики, не могут окончательно исключить бешенство у животного. [26] В 2001 году Wacharapluesadee и Hemachudha описали методику, которая может быть завершена за 4 часа, основанная на амплификации последовательностей нуклеиновых кислот для обнаружения специфичной для бешенства РНК в слюне и спинномозговой жидкости (CSF) четырех живых людей, больных бешенством.[27] РНК вируса бешенства может быть обнаружена либо в слюне, либо в спинномозговой жидкости, либо в том и другом, у всех пациентов уже на 2-й день после появления симптомов. На выделение вируса из слюны и спинномозговой жидкости влияет статус антител человека. Вероятность успеха больше на ранних стадиях, когда нейтрализующие антитела отсутствуют или имеют низкий титр.

(A) ОТ-ПЦР для гена N в образцах слюны, взятых у больных бешенством. (B) Быстрая ферментная иммунодиагностика бешенства (RREID). Лунки темно-коричневого цвета представляют образцы мозга, положительные на антиген бешенства

Выделение вируса

Выделение вируса от животных (или людей) является одним из самых надежных методов диагностики бешенства.Выделение вируса из инфицированной ткани можно проводить либо на мышах (тест на прививку мыши — MIT), либо в культуре клеток (тест на выделение культуры ткани бешенства — RTCIT). Радд и др. предложил методику культивирования тканей (клетки BHK 21) в качестве рутинного метода выделения уличного штамма вируса бешенства [28]. Отобранные образцы intra vitam включают образцы слюны, мазки из горла, мазки слизистой оболочки носа, мазки роговицы и спинномозговую жидкость. [29]

Тест на прививку мышей (MIT)

Швейцарские мыши-альбиносы предпочтительны для диагностики бешенства, но можно использовать и другие штаммы, поскольку все они одинаково восприимчивы к внутримозговому заражению вирусом уличного бешенства.Швейцарские мыши-альбиносы являются наиболее восприимчивыми и распространенными животными, используемыми для выделения вируса. В то время как мыши-отъемыши возрастом от 21 до 30 дней (весом 9-15 г)} предпочтительны, мыши-отъемыши менее 4 дней более восприимчивы. Гомогенизированный образец ткани головного мозга в забуференном разбавителе, содержащем стабилизатор белка и антибиотики, интрацеребрально инокулируют (0,03 мл) минимум шести отъемным мышам для каждого образца.

Техническая простота и высокая чувствительность — любимые атрибуты MIT.Основным недостатком этого теста является техническая экспертиза, экологические и этические проблемы, связанные с использованием большого количества животных.

Экспресс-тест на инфицирование тканевой культурой (RTCIT)

В настоящее время инокуляция клеточной культуры является признанным методом выделения уличного вируса для диагностики бешенства. Непредсказуемая и проблематичная задержка с выделением вируса in vivo in vivo значительно сокращается с инокуляцией клеточной культуры. Для выделения можно использовать несколько клеточных линий, таких как BHK 21, CER и нейробластома мыши.[30,31] Образцы, обычно используемые для выделения вируса, включают мозг и / или слюнные железы, суспензии которых готовят и инокулируют в культуры. После инкубации в течение ночи (18 ч) при 37 ° C в 5% CO _{2 ‘} клетки фиксируют, окрашивают антинуклеокапсидным антителом, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), и исследуют под флуоресцентным микроскопом. [29] Во многих лабораториях RTCIT заменил MIT, поскольку он относительно прост в исполнении, экономичен и может существенно сократить время, необходимое для получения результатов.

Обнаружение антител в спинномозговой жидкости и сыворотке

Косвенным доказательством инфекции бешенства является высокий титр антител в спинномозговой жидкости у невакцинированных лиц. Ниже приведены рекомендованные ВОЗ (Всемирной организацией здравоохранения) тесты, основанные на этом принципе: тест нейтрализации мышей (NT) и тест быстрого подавления флюоресцентного фокуса (RFFIT).

Тест нейтрализации мышей (MNT)

Вебстер и Атанасиу разработали тест нейтрализации вируса на мышах (тест нейтрализации мышей, (MNT) в 1935 году).[32,33] Это широко используемый тест, рекомендованный ВОЗ, и он стал стандартом, по которому в настоящее время оцениваются другие тесты. Вирус контрольного заражения для теста титруют путем внутримозгового заражения 21-дневных мышей-отъемышей. Разведение вируса, убивающее 50% инокулированных мышей, т.е. LD _{50 ‘}, определяют методами Рида-Мюнча или Спирмана-Карбера. К каждому разведению сыворотки от подозреваемого случая бешенства от 32 до 100 раз добавляют вирус LD ₅₀ и смесь инкубируют в течение 90 мин при 37 ° C, а затем интрацеребрально инокулируют мышей-отъемышей (5-10 мышей для каждого разведения сыворотки). ).За мышами наблюдают в течение 14 дней и записывают количество смертей при каждом разведении сыворотки. Разбавление сыворотки, при котором 50% мышей защищены (т.е. выживают), рассчитывают методами Рида-Мюнча или Спирмана-Карбера. Точность анализа ограничена количеством мышей, инокулированных для каждого разведения сыворотки, и шагом между используемыми разведениями. Утомительность и экономичность ограничивают количество мышей, подлежащих прививке, и оцениваемые разведения. Индивидуальная резистентность и неспецифическая смертность, связанные с любым тестом на животных, также отрицательно влияют на точность теста.[34]

Адаптация «стандартного штамма вируса заражения (CVS)» вируса бешенства (аттенуированного вируса) для роста в культуре клеток привела к разработке альтернативных анализов, в которых репликация ненейтрализованного вируса в культуре обнаруживается путем наблюдения бляшек, инфицированных клеток, окрашенных флуоресцентными антителами, или окраски, проявленной с помощью меченных ферментом антител против бешенства

Быстрый тест на подавление флюоресцентного фокуса (RFFIT)

RFFIT — один из наиболее широко используемых заменителей мыши Тест нейтрализации (MNT), разработанный Smith et al. [35] Это быстрый тест, для выполнения которого требуется всего 20 часов. Он включает наблюдение за очагами инфицированных вирусом клеток путем окрашивания флуоресцентными антителами []. Сыворотки серийно разводят на 8-луночных предметных стеклах Lab-Tek с последующим добавлением 30-100 FFD ₅₀ (Фокусообразующая доза; одна FFD ₅₀ представляет собой разведение вируса, при котором 50% наблюдаемых полей содержат одну или несколько инфицированных клеток) вируса и инкубируют смесь сыворотка-вирус при 37 ° C. Впоследствии добавляются суспензии клеток BHK-21.После 20-часового инкубационного периода при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ клетки окрашивают антителом против бешенства, конъюгированным с FITC. Титр антител определяется как величина, обратная разведению сыворотки, которое снижает заражение вирусом до 1FFD ₅₀ . Полученные титры примерно равны титрам, измеренным MNT. Скорость, с которой может быть проведен тест, и легкость, с которой можно тестировать несколько образцов одновременно, делают его пригодным для рутинной диагностики.Демонстрация антител в сыворотке крови при отсутствии вакцинации от бешенства в анамнезе или в спинномозговой жидкости является косвенным свидетельством инфекции бешенства. Было показано, что RFFIT немного более чувствителен, чем MNT, для обнаружения вирусонейтрализующих антител (VNAs) в поствакцинальных сыворотках. [36]

Тест нейтрализации вируса флуоресценции антител (FAVN)

Этот тест, являющийся адаптацией RFFIT, был разработан Cliquet et al. в 1998 году. [37] В этом тесте разведенная сыворотка каждого пациента помещается в четыре лунки микротитрационного планшета, содержащего LD ₅₀ живой вирус в клеточной линии, и каждая лунка оценивается как имеющая вирус или отсутствие вируса после 40-часового инкубационного периода.Результаты, полученные с помощью этого теста, показали хорошее согласие с MNT и RFFIT. По мнению авторов, отличить отрицательную сыворотку от положительной с низким титром антител легче с помощью FAVN по сравнению с RFFIT. Hostnik описал модификацию этого теста, в которой моноклональные антитела против бешенства и конъюгат пероксидазы против мыши использовались вместо конъюгированных с флуоресцеином антител против бешенства [38].

Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA)

IFA основан на взаимодействии между антителом и вирусным антигеном, присутствующим в мазках мозга инфицированных мышей или культурах клеток.Связанное антитело визуализируется с использованием меченной флуоресцеином видоспецифической антисыворотки, направленной против одного или нескольких классов иммуноглобулинов. Слайд исследуют под флуоресцентным микроскопом. Реакция оценивается по величине и яркости флуоресценции. Сообщается, что IFA более чувствителен, чем тест нейтрализации (NT) при обнаружении антител на ранней стадии иммунного ответа, что делает его ценным для диагностики. [39,40] IFA также может использоваться в сероэпидемиологических исследованиях. Это быстрый тест, он экономичен и прост в выполнении.Однако этот тест не коррелирует напрямую с NT при анализе сывороток после вакцинации. Хотя Thomas et al. , Gispen и Sathof сообщили, что IFA более чувствительна, чем NT, несколько других исследователей обнаружили, что NT лучше. [41–44] Madhusudhana et al. из Южной Индии сообщил о чувствительности 97,2% и специфичности 97,9% для IFA. [45] Сравнение двух методов показало, что относительная чувствительность двух тест-систем может зависеть от вакцины, используемой для иммунизации.[45] Титры IFA-антител в сыворотке от лиц, вакцинированных вакцинами из утиных эмбрионов или нервной ткани, были выше, чем от лиц, вакцинированных диплоидной вакциной для человека. При измерении титров нейтрализующих антител верно обратное. Крупные внутрицитоплазматические включения, наблюдаемые в монослоях, инфицированных бешенством, или мазках-слепках головного мозга с помощью флуоресцентных антител, обусловлены связыванием антител с нуклеокапсидными белками вируса бешенства. Антитела к вирусным гликопротеинам окрашивают инфицированные клеточные мембраны с незначительным или отсутствующим цитоплазматическим окрашиванием

Окрашивание мембран нелегко наблюдать в препаратах, фиксированных ацетоном, и его было бы трудно обнаружить с помощью обычного метода IFA.Относительная нечувствительность при обнаружении антигликопротеиновых антител может привести к неточной оценке защиты, обеспечиваемой иммунизацией, что делает IFA непригодным для испытаний эффективности вакцин. [36]

Попытки ante mortem диагностики бешенства с использованием клинических образцов не всегда могут быть успешными, и отрицательные тесты не исключают возможность бешенства. В отличие от диагностики бешенства ante mortem , посмертная диагностика более чувствительна и специфична.Тела Негри присутствуют более чем в 70% инфицированных головного мозга человека или животных [Врезка]. Более чувствительные и специфические тесты включают прямой иммунофлюоресцентный тест, проводимый на свежих мазках головного мозга. [46] Обнаружение антигена вируса бешенства в образцах головного мозга также может быть выполнено с помощью методов на основе ELISA, таких как экспресс-имунодиагностика ферментов бешенства (RREID) [] или недавно разработанный иммуноанализ дот-блоттинга. [47, 48] Выявление иммунных комплексов к антигенам бешенства может может использоваться как один из методов быстрой предубойной диагностики человеческого бешенства.Недавно был разработан тест ELISA на основе моноклональных антител к нуклеопротеину (N) и гликопротеину (G) бешенства для обнаружения иммунных комплексов в белках N и G бешенства [49]. Исследования выявили наличие специфических для бешенства иммунных комплексов в спинномозговой жидкости (CSF) пациента с паралитическим бешенством, что может помочь в диагностике ante-mortem . Антиген вируса бешенства может быть обнаружен путем агглютинации на предметном стекле с использованием латексных частиц, покрытых гамма-глобулином. Недавно Kasempimolporn et al. разработал простой и недорогой тест на основе латексной агглютинации (LA) для обнаружения антигена вируса бешенства в слюне живых собак. [50]

Профилактика бешенства

Хотя бешенство практически на 100% приводит к летальному исходу при появлении симптомов, с ним можно эффективно бороться, если сразу после контакта начать соответствующее лечение после контакта. Профилактика после контакта состоит из трех важных компонентов, а именно. местная обработка ран, пассивная иммунизация антирабическими иммуноглобулинами и активная иммунизация антирабическими вакцинами.Все это одинаково важно, и из-за пренебрежения какой-либо из процедур, особенно пассивной иммунизацией, лечение было неудачным.

Вскоре после заражения следует начать местную обработку ран. Укушенные раны следует промыть проточной водой из-под крана и промыть большим количеством мыла или моющего средства в течение не менее 10 минут. Это удаляет вирус механически, а также в значительной степени инактивирует вирус. После этого следует нанести местный антисептик, такой как Повидон Йод.По возможности следует избегать наложения швов, а если это необходимо по хирургическим причинам, его следует проводить только после инфильтрации раны антирабическим иммуноглобулином.

Дальнейшее лечение укуса зависит от степени или серьезности воздействия и риска развития бешенства. Нынешняя категоризация воздействий и требуемых лечебных процедур, которой повсеместно соблюдаются, соответствует национальным руководящим принципам, подробности которых можно найти на веб-сайте Ассоциации по профилактике и борьбе с бешенством в Индии (APCRI): www.apcri.org.

Вакцинация

Производство и использование устаревшей вакцины Семпл, полученной из нервной ткани, было прекращено в Индии с января 2005 года. Высокоэффективные и безопасные вакцины на культуре клеток доступны для постконтактного лечения в течение почти трех десятилетий. Это вакцина на основе диплоидных клеток человека (HDCV), вакцина из очищенных клеток куриного эмбриона (PCEC, Rabipur) и вакцина против бешенства из очищенных клеток Vero (PVRV, Verorab, Abhayrab). Недавно в Индии была представлена ​​высокоочищенная вакцина для эмбрионов утки (PDEV, Vaxirab).Пять доз вакцины необходимо ввести в 0, 3, 7, 14 и 28 день внутримышечно через дельтовидную область. График дозировки одинаков для всех возрастных групп, и нет противопоказаний для вакцинации против бешенства. Сударшан и др. оценил безопасность постконтактной иммунизации против бешенства и иммуногенность очищенной вакцины против бешенства (PVRV) во время беременности и обнаружил, что она безопасна и иммуногенно эффективна. Ни у одной из женщин не было побочных эффектов вакцины.[57] Поскольку вакцины на культурах клеток дороги и могут быть неэкономичными для использования в развивающихся странах, были разработаны экономически эффективные внутрикожные схемы, которые были одобрены ВОЗ в 1992 году. [58] Недавно правительство Индии также одобрило эти схемы. Эти схемы снижают стоимость лечения почти на 60%. На недавнем совещании экспертов ВОЗ по бешенству была рекомендована модифицированная схема Тайского Красного Креста, состоящая из введения 0,1 мл PCEC или PVRV на обе стороны дельтовидной области, внутрикожно на 0, 3 и 7 день и с одной стороны на 28 день.[59]

Пассивная иммунизация

Это один из аспектов постконтактной профилактики (ПКП), которым часто пренебрегают практикующие врачи. Доступные в настоящее время вакцины против бешенства индуцируют защитные уровни антител обычно через 10-14 дней после начала курса. В некоторых случаях контакта с категорией III может быть очень короткий инкубационный период, и в таких случаях простое введение вакцины не предотвратит бешенство, поскольку вирус достигнет ЦНС до образования достаточного количества нейтрализующих антител.Поэтому ВОЗ выступает за пассивную иммунизацию антирабическим иммуноглобулином (RIG) при всех контактах категории III. В настоящее время доступны два типа RIG, а именно. высокоочищенный и очищенный ферментами лошадиный иммуноглобулин против бешенства (ERIG) и человеческий иммуноглобулин против бешенства (HRIG). Рекомендуемая доза составляет 40 МЕ / кг массы тела ERIG и 20 МЕ / кг массы тела HRIG. Расчетную дозу следует ввести как можно больше локально в рану и вокруг нее, а оставшуюся дозу следует вводить внутримышечно в ягодичную область.ERIG следует вводить только после надлежащего теста на чувствительность, хотя частота анафилактических реакций после введения современных ERIG очень редка (около 0,001%). [60] Другие побочные реакции, подобные сывороточной болезни, могут наблюдаться чаще, но они, как правило, легкие и обычно не требуют приема лекарств. Во время недавнего исследования в Индии было поразительно отметить, что менее 2% облучений категории III получали RIG. Большинство неудачных попыток лечения происходит из-за несвоевременного введения RIG.В неврологических службах НИМХАНС (специализированный центр), Бангалор, некоторые пациенты с бешенством получили только курс вакцины на клеточных культурах (CCV) после укуса, но не RIG по разным причинам. Следовательно, существует необходимость в широкой кампании по использованию буровых установок в нашей стране. Более того, иммуноглобулин против бешенства должен строго назначаться всем пациентам с ВИЧ / СПИДом, имеющим контакт с категорией II и III в развивающихся странах, где подсчет CD4 недоступен. [61]

Предконтактная вакцинация

Рекомендуется людям, которые постоянно подвергаются риску заражения бешенством, например, ветеринарам, лабораторным работникам, работающим с вирусом бешенства, собаководам и лесничим, медикам и парамедикам, лечащим больных бешенством в отделениях интенсивной терапии.Три дозы любой современной вакцины против бешенства можно вводить в дни 0, 7 и 28. Людям из группы постоянного риска рекомендуется ревакцинация.

Вакцинация после повторного контакта

В соответствии с рекомендацией ВОЗ, требуется 2 дозы любой современной вакцины в дни 0 и 3 для людей, которые повторно подверглись воздействию бешенства и прошли курс полного постконтактного лечения любыми вакцинами. современной вакцины на клеточной культуре когда-либо в прошлом. Нет необходимости вводить антирабический иммуноглобулин.В развивающихся странах было предложено включить внутрикожную вакцину в графики иммунизации детей. [62] Hatz et al. рекомендовал предварительную иммунизацию путешественникам, посещающим районы, где собачье бешенство является энзоотическим и доступ к соответствующей медицинской помощи ограничен. [63]

Внутримышечный путь рекомендуется для предварительной вакцинации от бешенства, если одновременно вводится противомалярийный хлорохинфосфат. Эта рекомендация была сделана после того, как доброволец Корпуса мира умер от бешенства, несмотря на то, что за 6 месяцев до этого он прошел полную серию внутрикожных (ID) предэкспозиций.[64]

В эпоху многочисленных международных поездок неврологи, терапевты и практикующие врачи в отделениях интенсивной терапии сталкиваются со случаями бешенства, маскирующимися под другие неврологические заболевания, такие как периферическая невропатия. Точно так же в психиатрической практике случай, у которого диагностирован маниакальный психоз, на самом деле может быть одним из видов бешенства. Знание технических методов прижизненной диагностики может помочь в планировании ведения больницы и постконтактной профилактики лечащей медицинской бригады.Хотя клинические исходы бешенства все еще остаются мрачными, предконтактная и постконтактная вакцинация в сочетании с пассивной иммунизацией, вероятно, положительно изменит клинический результат.

Лабораторная диагностика бешенства человека: последние достижения

ScientificWorldJournal. 2013; 2013: 569712.

Рита Субраманиам Мани

Отделение нейровирологии, Сотрудничающий центр ВОЗ по справочной информации и исследованиям бешенства, Национальный институт психического здоровья и неврологии (NIMHANS), Бангалор 560029, Индия

Шампур Нараян Мадхусудана

Отделение нейровиологии , Сотрудничающий центр ВОЗ по справочной информации и исследованиям бешенства, Национальный институт психического здоровья и неврологии (NIMHANS), Бангалор 560029, Индия

Департамент нейровирологии, Сотрудничающий центр ВОЗ по справочным материалам и исследованиям в области бешенства, Национальный институт психического здоровья и неврологии ( NIMHANS), Bangalore 560029, India

Академические редакторы: H.Фикеншер и К. Икута

Получено 31 августа 2013 г .; Принято 26 сентября 2013 г.

Copyright © 2013 Р. С. Мани и С. Н. Мадхусудана.

Это статья в открытом доступе, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Бешенство, острый прогрессирующий смертельный энцефаломиелит, который чаще всего передается через укус бешеного животного, является причиной примерно 61 000 смертей людей во всем мире.Истинное бремя болезней и последствия бешенства для здоровья населения остаются недооцененными из-за отсутствия чувствительных методов лабораторной диагностики. Быстрая диагностика бешенства может помочь начать оперативный инфекционный контроль и меры общественного здравоохранения, устранить необходимость в ненужном лечении / медицинских тестах и ​​помочь в своевременном проведении профилактической вакцинации до или после контакта с членами семьи и медицинским персоналом. Прижизненная диагностика человеческого бешенства побуждает клиницистов попробовать экспериментальные терапевтические подходы к некоторым пациентам, особенно после того, как сообщается о выживании нескольких случаев человеческого бешенства.Традиционные методы прижизненной и посмертной диагностики бешенства имеют ряд ограничений. Последние достижения в технологии привели к усовершенствованию или развитию нескольких диагностических тестов, которые включают методы обнаружения антигена вируса бешенства и антител и анализы для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот и идентификации конкретных биомаркеров. Эти тесты, дополняющие традиционные методы, могут в будущем произвести революцию в диагностике бешенства.

1. Введение

Бешенство, одно из старейших и наиболее опасных зоонозных заболеваний, известных человечеству, представляет собой острый, прогрессирующий и почти смертельный энцефаломиелит, вызываемый вирусом бешенства (RABV) и другими видами Lyssavirus , вызываемыми вирусом бешенства. семейство Rhabdoviridae.

Несмотря на отсутствие точных данных о глобальном бремени забытых тропических болезней, оценки прямой смертности от бешенства, которое чаще всего передается через укус бешеного животного, являются одними из самых высоких. Ежегодное число случаев смерти людей от бешенства во всем мире в 2010 году оценивается в 61 000 (95% ДИ 37 000–86 000), при этом подавляющее большинство смертей (84%) приходится на сельские районы. Ориентировочная годовая стоимость бешенства составляет 6 миллиардов долларов США (95% ДИ, 4,6–7,3 миллиарда), из которых почти 2 миллиарда долларов США связаны с потерей производительности после преждевременной смерти и еще 1 доллар США.6 миллиардов потрачено непосредственно на постконтактную профилактику [1].

Большинство случаев смерти людей от бешенства происходит в Азии и Африке. Оценки смертности людей от эндемического собачьего бешенства в Азии и Африке ежегодно превышают 30 000 и 23 000, соответственно [2]. В Латинской Америке и Карибском бассейне за последние два десятилетия были достигнуты существенные успехи в борьбе с бешенством собак и в сокращении случаев заражения людей бешенством, передаваемым собаками. Однако, по сообщениям, заболеваемость бешенством летучих мышей увеличилась, что, вероятно, привело к увеличению числа случаев заболевания людей и падежам домашнего скота [3].

Собачье бешенство ликвидировано в Западной Европе, Канаде, Соединенных Штатах Америки (США), Японии, Малайзии и некоторых странах Латинской Америки. Австралия свободна от хищного бешенства, а многие государства тихоокеанских островов всегда были свободны от бешенства и связанных с ним вирусов. В этих областях человеческая смерть от бешенства ограничивается людьми, зараженными во время проживания или путешествий в районах, эндемичных по собачьему бешенству [1, 4]. Однако во многих странах, где циркулируют вирусы бешенства диких животных или летучих мышей, профилактика бешенства обходится дорого.Ежегодно в США происходит от одного до восьми случаев смерти людей от бешенства в результате бешенства диких животных, и, по оценкам, на профилактику бешенства ежегодно тратится около 300 миллионов долларов США [1, 5].

Лабораторная диагностика и эпиднадзор за бешенством животных и людей серьезно ограничены в большинстве развивающихся стран, где бешенство является эндемическим заболеванием. Истинное бремя болезней и воздействие бешенства на здоровье населения остаются недооцененными из-за отсутствия простых, чувствительных и экономичных лабораторных методов диагностики бешенства.Это может быть одной из важных причин, по которым бешенство остается забытым зоонозом во многих развивающихся странах Азии и Африки [6, 7].

2. Необходимость лабораторной диагностики случаев бешенства у человека

У людей различают две различные формы бешенства — бешеную и паралитическую. Диагностика классической формы бешенства (энцефалита), которая составляет около 80% случаев бешенства у людей, основана на ее характерных клинических признаках и симптомах и редко вызывает диагностические трудности.Однако лабораторная помощь может потребоваться в некоторых случаях, когда отсутствуют характерные клинические признаки, такие как аэрофобия или гидрофобия. В клинической практике паралитические или атипичные формы, которые составляют около 20% случаев бешенства среди людей, представляют собой диагностическую дилемму. Эти случаи часто клинически неотличимы от синдрома Гийена-Барре (СГБ), а также их необходимо дифференцировать от нейропаралитических осложнений из-за вакцины против бешенства типа Семпла, которая все еще используется в нескольких странах, таких как Монголия, Мьянма и Пакистан [8–11] .Ситуация усугубляется отсутствием в анамнезе укусов животных, психиатрических или других атипичных клинических проявлений, недоступностью окончательного диагностического теста на СГБ и ограниченной доступностью тестов для прижизненной диагностики человеческого бешенства [9].

Быстрая диагностика бешенства жизненно важна для принятия своевременных и надлежащих мер инфекционного контроля и общественного здравоохранения. Ранняя диагностика может устранить необходимость в ненужном лечении и медицинских тестах, а также помочь в прогнозировании, учреждении барьерного ухода, своевременном проведении профилактической вакцинации до или после контакта членам семьи пациента и лечащему медицинскому и медперсоналу, а также закрытию случая и психологическое консультирование с членами семьи.Отрицательные лабораторные тесты на бешенство могут указывать на наличие другого инфекционного агента или неинфекционную этиологию и способствовать надлежащему медицинскому ведению. Лабораторная диагностика бешенства также может помочь в конкретной характеристике возбудителя и предположить потенциальный источник инфекции, особенно при отсутствии истории контакта с животным, а также выявить других людей, которые могли подвергаться воздействию того же источника инфекции [ 1, 9, 12].

Сообщения о заражении бешенством при трансплантации органов [13–15] подчеркивают необходимость скрининга доноров органов на бешенство, особенно у доноров с острым прогрессирующим энцефалитом необъяснимой этиологии, и наличие других факторов риска бешенства.

Хотя известно, что человеческое бешенство приводит к почти 100% смертельному исходу, зарегистрированные данные о выживании подростка, который заболел бешенством после укуса летучей мыши в США с использованием «Протокола Милуоки» в 2005 году [16], возродили интерес в медицинском сообществе к попыткам эксперимента. терапевтические подходы. Возможности лечения дают дополнительный импульс попыткам поставить диагноз как можно скорее [17], и, следовательно, в последние годы прижизненная лабораторная диагностика приобрела большее значение. Недавняя консультация экспертов ВОЗ поощряет исследования по определению протоколов лечения, процедур иммуномодуляции и новых лекарств, включая противовирусные препараты [1].

Постоянный надзор и лабораторное подтверждение клинически подозреваемых случаев бешенства необходимы в странах, в которых в последние годы зарегистрировано снижение заболеваемости бешенством среди людей (например, Шри-Ланка, Таиланд) и которые работают над искоренением бешенства в ближайшем будущем. Географические границы не могут сдержать вирус бешенства; до тех пор, пока где-либо существуют очаги диких животных или собачьего бешенства, а также продолжаются международные поездки и глобальная торговля скотом, домашними животными и дикими животными, угроза реинтродукции бешенства существует даже в странах, которые были свободны от бешенства в течение многих лет.Например, индонезийский остров Бали до конца ноября 2008 года считался свободным от бешенства. Однако с тех пор произошла вспышка бешенства по всему острову, и бешенство было подтверждено как у собак, так и у людей, в результате чего к концу 2012 года погиб 141 человек. [1].

3. Обычные диагностические тесты на бешенство: преимущества и ограничения

Лабораторные методы лечения бешенства были начаты еще в 1800 году до нашей эры, когда Зинке впервые продемонстрировал, что инфекция может передаваться нормальным животным после прививки слюной от бешеных. животное.Знаменательное открытие тел Негри Адельчи Негри в 1903 году и демонстрация их диагностической значимости его женой Линой Негри-Луццани в 1913 году проложили путь к лабораторному подтверждению бешенства.

Окончательный диагноз бешенства может быть поставлен только с помощью соответствующих лабораторных методов. Основные методы описаны в публикации ВОЗ Лабораторные методы лечения бешенства [18] и Руководстве МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных [19].

3.1. Прямая микроскопия: гистологическая идентификация характерных клеточных поражений

Инфицированные нейрональные клетки выявляют агрегаты вирусных частиц «тельца Негри», которые представляют собой внутрицитоплазматические тельца включения, специфичные для бешеного энцефалита, что подтверждается гистологическими тестами (метод продавца) на мазках, взятых из различных областей мозга. . Тельца Негри различаются по размеру от 3 мкм мкм до 30 мкм мкм и обычно имеют круглую или овальную форму и глубоко эозинофильные с характерными базофильными гранулами, часто расположенными в форме розетки внутри эозинофильной матрицы. .

Несмотря на то, что это простой экспресс-тест, метод Продавца для нефиксированных мазков тканей имеет очень низкую чувствительность и подходит только для свежих образцов. Методы окрашивания срезов залитых парафином тканей мозга отнимают много времени, менее чувствительны и более дороги. Гистологические методы гораздо менее чувствительны, чем иммунологические, особенно в случае аутолизированных образцов, и больше не рекомендуются для первичной диагностики как у людей, так и у животных [1, 18, 19].

3.2. Демонстрация вирусного антигена

3.2.1. Метод флуоресцентных антител (FAT)

Наиболее широко используемый тест для посмертной диагностики бешенства — это тест на флуоресцентные антитела (FAT), который рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией здравоохранения животных (OIE). Этот тест, разработанный Голдвассером и Кисслингом в 1957 году, до сих пор является золотым стандартом диагностики бешенства [20, 21]. Он включает демонстрацию нуклеопротеинового антигена (N) вируса бешенства в свежих мазках мозга подозреваемого на бешенство с помощью иммунофлуоресцентного метода ().Его также можно использовать для подтверждения присутствия антигена бешенства в культуре клеток или в ткани мозга мышей, которые были привиты для диагностики. Специфичность и чувствительность теста почти достигают 99% в опытной лаборатории, а результаты доступны в течение нескольких часов.

Метод флуоресцентных антител (FAT) для анализа мазка мозга человека на бешенство.

Надежные результаты получаются только при использовании свежей мозговой ткани; тем не менее, FAT также может применяться к образцам, сохраненным в 50% физиологическом растворе глицерина, после тщательной промывки образцов физиологическим раствором.Если образец хранился в растворе формалина, FAT можно использовать только после обработки образца протеолитическим ферментом [22]. Однако FAT на фиксированных формалином и переваренных образцах всегда менее надежен и более сложен, чем когда выполняется на свежих тканях [23]. Частично разложившийся мозг не подходит для этого теста, так как очень трудно отличить специфическую флуоресценцию, вызванную N-антигеном, от неспецифической флуоресценции, которая может быть результатом бактериального заражения.

Получение посмертной биопсии / вскрытия мозга по-прежнему является проблемой из-за религиозных, культурных и других факторов, при этом снижение показателей вскрытия является общей проблемой как в развитых, так и в развивающихся странах. Наличие методов прижизненной диагностики бешенства в образцах, отличных от ткани головного мозга, очень важно и позволит обойтись без инвазивной биопсии / вскрытия мозга и связанных с этим процедур логистики и безопасности.

FAT также может быть выполнен на мазках роговицы и биопсии выйной кожи в подозреваемых случаях; однако было обнаружено, что он имеет ограниченную надежность и низкую чувствительность для прижизненной диагностики бешенства [24, 25].Кроме того, FAT на слепках роговицы не рекомендуется в качестве рутинного теста из-за риска скарификации роговицы, особенно у пациентов с энцефалитом, а не бешенством [1].

Кроме того, потребность в дорогом флуоресцентном микроскопе, который требует технического обслуживания, а также квалифицированного персонала для интерпретации результатов теста, ограничивает его использование во многих развивающихся странах.

3.2.2. Быстрая энзимная иммунодиагностика бешенства (RREID)

Антиген N бешенства также может быть обнаружен с помощью иммуногистохимических методов, а также иммуноферментных анализов.Методика на основе ELISA была разработана Perrin et al. в 1986 г., известный как экспресс-ферментная иммунодиагностика бешенства (RREID) [26]. Этот метод основан на улавливании белка N бешенства в гомогенате мозга поликлональным или моноклональным антителом против N, нанесенным на твердую фазу. Впоследствии захваченный антиген выявляется путем добавления конъюгированного с пероксидазой моноклонального или поликлонального антитела, полученного у разных видов, или, что еще лучше, путем добавления биотинилированного N-антитела с последующим добавлением стрептавидинпероксидазы и проявления окраски с помощью о-фенилендиамин дигидрохлорида (OPD) и перекиси водорода.В различных исследованиях установлено, что этот тест столь же чувствителен и специфичен, как и FAT [27, 28] (). Дополнительным преимуществом является то, что частичное разложение мозга не повлияет на результат теста. Ограничением теста является потребность в ткани головного мозга, что исключает его использование в прижизненной диагностике.

Диагностика бешенства методом быстрой ферментной иммунодиагностики бешенства (RREID). Обратите внимание на темно-коричневый цвет, полученный с положительным мозгом на бешенство по сравнению с отрицательным мозгом, который кажется бесцветным.

3.3. Изоляция вируса

Выделение вируса требуется для подтверждающего диагноза, особенно когда FAT дает неопределенный результат и, что более важно, для молекулярной характеристики вирусов в географическом районе и для отслеживания происхождения вируса, если бешенство происходит в зоне, свободной от бешенства. Для этой цели можно использовать два метода: метод инокуляции мышей (MIT) и экспресс-тест на инфицирование тканевой культурой (RTCT) [29, 30].

3.3.1. Тест на прививку мышей

От трех до десяти мышей в возрасте 3-4 недель (12–14 г) или помет двухдневных новорожденных мышей прививают интрацеребрально осветленным супернатантом 10–20% ( w / v) гомогенат мозгового материала в изотоническом буферном растворе, содержащем антибиотики.За привитыми мышами наблюдают ежедневно в течение 28 дней; у них появляются типичные признаки и симптомы бешенства в любое время через 5–7 дней в зависимости от инкубационного периода. Они состоят из начального взъерошивания волос, сгибания спины и волочения задних конечностей с последующим параличом задних и передних конечностей. Дальнейшее подтверждение диагноза может быть сделано путем извлечения головного мозга больной мыши и его обработки FAT.

Недостатком MIT является длительный интервал до постановки диагноза, поскольку за привитыми мышами необходимо наблюдать в течение 28 дней, поскольку некоторые дикие вирусы могут иметь очень длительный инкубационный период.Если в лаборатории имеются помещения для культивирования клеток, следует рассмотреть возможность замены теста на прививку мыши на культуру клеток, когда это возможно, поскольку он позволяет избежать использования живых животных, является менее дорогостоящим и дает более быстрые результаты. Однако преимущества MIT заключаются в том, что при положительном результате теста большое количество вируса может быть выделено из мозга отдельной мыши для целей идентификации штамма и что его можно легко и практически применить в ситуациях, когда навыки и возможности для других тестов (например, .g., клеточная культура) недоступны [19].

3.3.2. Быстрый тест на заражение тканевой культурой (RTCT)

По сравнению с MIT, выделение вируса в клеточной культуре происходит быстро, а результаты можно получить в течение 24–48 часов. Клеточные линии, наиболее подходящие для выделения вируса, имеют нервное происхождение, и наиболее часто используемой клеточной линией является клеточная линия нейробластомы мыши Neuro-2a. Другие используемые клеточные линии, которые могут быть не такими чувствительными, как Neuro-2a, включают клетки, связанные с куриным эмбрионом (CER) и клетки почек детеныша хомячка (BHK 21).Подозрительный клинический образец или гомогенат головного мозга инокулируют на клетки, выращенные во флаконе с оболочкой или 96-луночных планшетах, инкубируют в течение 24 часов и окрашивают прямым FAT после фиксации ацетоном. Недавно новая клеточная линия, линия клеток эмбриональной почки человека (HEK 293), была оценена на предмет выделения фиксированных и уличных вирусов и оказалась столь же чувствительной и специфичной, как клеточная линия Neuro-2a [31] (). RTCT — более быстрая и дешевая альтернатива MIT; однако это может быть выполнено только в лабораториях с оборудованием для культивирования клеток, а также с флуоресцентным микроскопом.

Выделение вируса в культуре клеток: инфицированные уличным вирусом Neuro-2a (a) и HEK 293 (b), окрашенные методом флуоресцентных антител (FAT).

3.4. Демонстрация антител

Демонстрация антител в сыворотке при отсутствии вакцинации против бешенства в анамнезе или в спинномозговой жидкости предлагает косвенное свидетельство инфекции бешенства. Интерпретация результатов тестов может быть затруднена, поскольку иммунный ответ хозяина может различаться у разных людей. Отрицательная прогностическая ценность серологических тестов для диагностики бешенства считается низкой [32].Серологическое тестирование редко бывает полезным для прижизненной диагностики из-за поздней сероконверсии и высокой смертности видов-хозяев, но может помочь в диагностике паралитического бешенства, когда выживаемость относительно дольше. Однако серологические методы очень полезны для оценки сероконверсии после вакцинации и для эпидемиологических исследований.

Поскольку нейтрализующие антитела считаются ключевым компонентом адаптивного иммунного ответа против вируса бешенства, тесты нейтрализации вируса (VN) в клеточных культурах являются предписанными тестами для проверки ответов на вакцинацию.Результаты выражены в международных единицах относительно международной стандартной антисыворотки. Для этой цели были описаны тест нейтрализации мыши (MNT), тест быстрого ингибирования флюоресцентного фокуса (RFFIT) и тест нейтрализации вируса флуоресценции антител (FAVN). Широко используемый тест нейтрализации вирусов на мышах (MNT), разработанный в 1935 году Вебстером и Доусоном [33, 34], больше не рекомендуется ВОЗ или МЭБ.

Адаптация «стандартного штамма контрольного вируса (CVS)» вируса бешенства для роста в культуре клеток привела к разработке альтернативных анализов, в которых репликация ненейтрализованного вируса в культуре выявляется путем наблюдения за бляшками, инфицированными клетками. окрашивание флуоресцентным антителом или окрашивание меченным ферментом антителом против бешенства.RFFIT является одним из наиболее широко используемых заменителей теста нейтрализации мышей (MNT) и представляет собой быстрый тест, для выполнения которого требуется всего 20 часов, и он немного более чувствителен, чем MNT для обнаружения вирус-нейтрализующих антител (VNAs) в поствакцинальных сыворотках [ 35, 36]. Тест FAVN, который является адаптацией RFFIT, был разработан в 1998 году, и полученные результаты показали хорошее согласие с MNT и RFFIT [37]. Также сообщается о модификации этого теста, в котором моноклональные антитела против бешенства и конъюгат пероксидазы с антимышиным антителом использовались вместо конъюгированных с флуоресцеином антител против бешенства [38].

В недавнем лабораторном исследовании по диагностике человеческого бешенства антитела, нейтрализующие вирус бешенства, были обнаружены с помощью RFFIT в 4/11 (36,3%) образцах ЦСЖ, полученных для прижизненной диагностики, и 7/13 (53,8%) образцах ЦСЖ, полученных посмертно, что представляет собой терминальная стадия болезни. Обнаружена обратная корреляция между обнаружением нейтрализующих антител и присутствием вирусной РНК в образцах спинномозговой жидкости [39]. Тестирование на антитела также является полезным инструментом для мониторинга иммунного ответа в центральной нервной системе и, таким образом, возможного избавления от вируса бешенства у пациентов, которые будут лечиться по «протоколу Милуоки» или другим экспериментальным вмешательствам в будущем [40].

RFFIT считается золотым стандартом анализа и уже несколько лет используется для оценки титра нейтрализующих антител к вирусу бешенства. Однако для проведения теста требуются подготовленные кадры, оборудование для культивирования клеток и флуоресцентной микроскопии, а также адекватные меры биобезопасности для работы с живым вирусом. RFFIT чувствителен к цитотоксичности в сыворотках низкого качества [41], а неспецифические ингибиторы вируса в сыворотках могут давать ложноположительные результаты.

4. Новые диагностические тесты на бешенство

4.1. Демонстрация вирусного антигена

4.1.1. Прямой экспресс-иммуногистохимический тест (dRIT)

Одним из наиболее значительных достижений последних лет является разработка и оценка экспресс-иммуногистохимического теста под названием Direct Rapid Immunohistochemical Test (dRIT), разработанного в Центрах по контролю за заболеваниями (CDC), Атланта, США [ 42]. Тест основан на обнаружении белка N бешенства в предполагаемых мазках мозга, зафиксированных в забуференном формалине, с использованием смеси высококонцентрированных и очищенных биотинилированных моноклональных антител к белку N с последующим добавлением стрептавидинпероксидазы и окрашивающего реагента субстрата (H ₂ O ₂ и аминоэтилкарбазол).N-антигены бешенства, если они присутствуют, обнаруживаются в виде коричневато-красных кластеров внутри нейрона, вдоль аксонов и разбросаны по мазкам головного мозга (). Вся процедура тестирования занимает менее одного часа и имеет то преимущество, что ее можно применять в полевых условиях, поскольку не требуется дорогостоящий флуоресцентный микроскоп. Тест был оценен в полевых условиях в Танзании и оказался на 100% чувствительным и специфичным по сравнению с FAT. Тест может быть успешно проведен на образцах, хранящихся в растворе глицерина в течение 15 месяцев или замороженных в течение 24 месяцев, и в различных условиях хранения.Это увеличивает его пригодность для использования в полевых условиях в развивающихся странах, где холодильные камеры могут быть недоступны [7]. Тест также прошел обширную оценку в других странах [43–45], и была обнаружена 100% корреляция с FAT.

Методика прямого быстрого иммуногистохимического теста (dRIT), проводимая на человеческом мозге с положительным результатом на бешенство. Обратите внимание на присутствие коричневато-красных частиц в нейроне, распространяющемся по дендритам и аксону.

Хотя для dRIT требуется хранение реагентов в холодильнике, одним из основных преимуществ этого недавно разработанного теста является относительная простота интерпретации с использованием обычного светового микроскопа.Этот простой тест позволит развивающимся странам улучшить эпидемиологический надзор за бешенством при значительно меньших затратах и ​​без необходимости в чрезмерно дорогом флуоресцентном микроскопическом оборудовании, а также в экспертных знаниях и финансовых затратах, необходимых для его обслуживания. Экономическая эффективность dRIT позволит передавать знания и технологии в отдаленные районы развивающегося мира, где трудно получить данные о заболеваемости бешенством. Это также может быть полезно при принятии решений относительно рационального использования постконтактной профилактики бешенства [7, 44].

ВОЗ рекомендует дальнейшее развитие прямых быстрых иммуногистохимических тестов в качестве альтернативы прямому флуоресцентному тесту на антитела для улучшенного децентрализованного лабораторного надзора [1]. Однако один из основных факторов, который требует рассмотрения, прежде чем рекомендовать лабораториям в развивающихся странах принять dRIT для диагностики бешенства, — это бесперебойная поставка критически важных реагентов (моноклональных антител против N), которые в настоящее время доступны только через CDC, Атланта.Следует рассмотреть вопрос о коммерциализации реагентов или возможности местного производства в отдельных лабораториях в развивающихся странах [43].

4.1.2. Непрямой экспресс-иммуногистохимический тест (IRIT)

Недавно с помощью традиционной световой микроскопии был проведен непрямой экспресс-иммуногистохимический тест (IRIT) для обнаружения и дифференциации вариантов вируса бешенства (RABV). Свежезамороженные слепки прикосновения мозга или монослои культур клеток, зафиксированные в забуференном формалине, окрашивают панелью мышиных моноклональных антител против нуклеопротеина (mAb-N) и коммерчески доступных меченных биотином козьих антимышиных антител.Девяносто шесть (96) изолятов RABV, представляющих 20 вариантов RABV, ранее определенных с помощью антигенного типирования с использованием панели mAb-N и непрямого флуоресцентного теста на антитела (IFA), а также анализа генетической последовательности были охарактеризованы с помощью IRIT. Результаты IRIT выявили различные паттерны реактивности, связанные с текущими и историческими резервуарными хозяевами RABV, аналогично тесту IFA и анализу генетической последовательности.

ИРИТ не требует специального оборудования и может выполняться в полевых условиях. Кроме того, коммерчески доступные меченые вторичные антитела позволяют использовать стандартную панель немеченых первичных mAb без необходимости флуоресцентной микроскопии.Таким образом, IRIT можно использовать в качестве экономичного диагностического теста, который также может помочь в изучении распространенности, распространения и передачи вируса бешенства среди резервуарных хозяев в энзоотических областях бешенства [46].

4.1.3. Иммунохроматографические методы

Другой недавно описанный метод обнаружения антигена вируса бешенства в патологоанатомических пробах — это быстрый иммунодиагностический тест (RIDT), полезный метод диагностики бешенства без необходимости в лабораторном оборудовании. Этот иммунохроматографический тест с полосками с боковым потоком представляет собой одноэтапный тест, который обеспечивает недорогую и быструю идентификацию вирусного антигена.Вкратце, обработанный подозрительный материал добавляется в тестовое устройство, и конъюгированные детекторные антитела, прикрепленные к двум разным зонам на мембране, указывают на присутствие вирусного антигена [47]. Другой тест для обнаружения антигена вируса бешенства, использующий тот же принцип, был разработан с использованием комбинации очищенных поликлональных и моноклональных антител и оценен с использованием образцов слюны собак [48]. Простой и быстрый иммунохроматографический тестовый набор для диагностики бешенства, разработанный с использованием моноклональных антител, распознающих эпитоп II и III нуклеопротеина вируса бешенства, также был оценен как быстрый скрининговый тест на бешенство [49].Улучшенная версия того же самого была недавно разработана для диагностики бешенства у животных и человека и признана надежным, удобным, быстрым и надежным тестом для использования в лабораториях со скромной инфраструктурой. Хотя этот тест показал высокую чувствительность, он имел низкую специфичность для образцов человеческого мозга и, следовательно, не подходил для диагностики человеческого бешенства [50]. Хотя тесты, основанные на иммунохроматографических методах, могут использоваться в качестве быстрого скринингового теста на животных, они должны пройти значительное улучшение и оценку на клинических образцах людей, прежде чем их можно будет рекомендовать для использования в диагностике человеческого бешенства.

4.1.4. Другие анализы обнаружения антигена

Простой, надежный и быстрый сэндвич-ELISA (WELYSSA) можно использовать для обнаружения Lyssaviruses , принадлежащих ко всем семи генотипам, циркулирующим в Европе, Африке, Азии и Океании [51, 52]. Другие тесты для обнаружения антигена вируса бешенства включают иммуноферментный анализ тканей мозга [53] и иммуноферментный анализ для быстрой диагностики бешенства у людей и животных [54].

Колориметрические ферменты, используемые при обнаружении антигена вируса бешенства, обычно связываются с антителом химическим путем с использованием перекрестно-сшивающих реагентов, что может привести к получению гетерогенных конъюгатов, иногда со сниженной активностью и специфичностью.Химерные бифункциональные молекулы, в которых вариабельные домены антитела связаны с неродственными белковыми индикаторами с помощью генной инженерии, могут помочь обойти эту проблему. Недавнее исследование описало успешное производство бифункционального химерного белка на основе слитого с щелочной фосфатазой фрагмента гликопротеина scFv вируса бешенства. Было обнаружено, что это новый инструмент in vitro для обнаружения антигена вируса бешенства в мазках мозга [55].

4.2. Методы обнаружения нуклеиновых кислот

Методы амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот в последние годы произвели революцию в диагностике бешенства и играют важную роль в прижизненной диагностике бешенства у людей.В настоящее время несколько анализов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) были оценены в качестве дополнения к обычным тестам для предубойной и посмертной диагностики бешенства. Большинство анализов нацелены на высококонсервативный ген нуклеопротеина вируса бешенства для амплификации.

4.2.1. ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

Описано несколько традиционных анализов ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на основе геля с вложенными / геминированными протоколами для обнаружения РНК вируса бешенства в клинических образцах [12, 56–60].Ампликоны, полученные в этих анализах, можно секвенировать для дальнейшей характеристики вируса и филогенетического анализа. Однако основным недостатком этих анализов является риск перекрестного заражения, что исключает их рутинное использование для диагностики бешенства людей и животных.

4.2.2. ПЦР в реальном времени

Анализы, основанные на ПЦР в реальном времени, позволяют обнаруживать и количественно определять копии генома, а благодаря тому, что эти анализы являются «закрытыми пробирками», достигается значительное снижение перекрестной контаминации.ПЦР в реальном времени с использованием химии SYBR Green была оценена на образцах слюны человека для прижизненной диагностики бешенства [61] и в качестве универсального анализа в реальном времени для обнаружения Lyssaviruses [62]. Хотя эти анализы многообещающие, для обеспечения специфичности требуется особая осторожность [63]. Однако ПЦР-анализы в реальном времени с использованием флуорогенных зондов TaqMan обеспечивают высокую специфичность из-за внутренней реакции гибридизации [39, 63–66], имеют широкий диапазон обнаружения и в 10–1000 раз более чувствительны, чем традиционные вложенные RT. -PCR [63, 64].В недавнем исследовании TaqMan-ПЦР в реальном времени на вирусную РНК дала положительный результат в 5/11 (45,4%) образцах спинномозговой жидкости, 6/10 (60%) биопсиях затылочной кожи и 6/7 (85,7%) образцах слюны, полученных перед смертью. от пациентов с клиническим подозрением на бешенство. По крайней мере, один клинический образец (спинномозговая жидкость / кожа / слюна) был положительным с помощью TaqMan PCR в реальном времени у 11 из 13 (84,6%) пациентов; В сочетании с обнаружением нейтрализующих вирусов бешенства антител в спинномозговой жидкости прижизненный диагноз бешенства может быть достигнут во всех 13 (100%) случаях [39].

Несмотря на ряд преимуществ, вирусная генетическая гетерогенность может оказаться препятствием для разработки ПЦР на основе зонда TaqMan, поскольку несоответствие между мишенью и зондом может привести к ложноотрицательным результатам или снижению чувствительности [64, 65].Однако несовпадения на сайтах связывания праймера и / или зонда не влияли на амплификацию или детекцию в нескольких других исследованиях [66].

Другие молекулярные анализы . В методе амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) используются три фермента для создания множественных копий РНК в изотермических условиях. Автоматизированный NASBA позволяет легко и быстро тестировать образцы и, как сообщается, имеет более высокую чувствительность, чем обычные ПЦР-тесты для обнаружения РНК вируса бешенства в прижизненной слюне и образцах спинномозговой жидкости [67].Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — это альтернативный метод амплификации ДНК с высокой специфичностью и эффективностью без необходимости термоциклирования, который использовался для диагностики бешенства [68, 69]. Поскольку этот метод не имеет технологических требований к термоциклированию, используемому в ОТ-ПЦР, его можно использовать для разработки протоколов наблюдения, где тестирование может проводиться в полевых условиях или в менее сложных лабораториях [32].

Тесты на обнаружение нуклеиновых кислот могут выполняться на различных биологических образцах, таких как спинномозговая жидкость, слюна, слезы, моча, биопсия кожи, извлеченные волосяные фолликулы и ткань мозга для прижизненной и посмертной диагностики человеческого бешенства.Эти анализы оказались полезными для диагностики бешенства в разложенных и архивных образцах [39, 70–72] и играют важную роль в ретроспективной диагностике и эпидемиологических исследованиях. Поскольку инфекция бешенства может быть передана при трансплантации органов, молекулярные анализы также могут быть полезны для тестирования доноров, подверженных риску заражения бешенством. ПЦР в реальном времени также может использоваться для количественного определения вирусной РНК для оценки вирусной нагрузки, прогрессирования заболевания и эффективности экспериментальных терапевтических подходов [63, 73] и может быть ценным, поскольку в будущем будут изучаться новые варианты лечения бешенства.

Однако основным ограничением этих анализов является необходимость строгих мер контроля качества, чтобы избежать ложноположительных результатов, а также отсутствие международных стандартов и универсальных протоколов, которые должны использоваться для диагностики. В настоящее время молекулярные анализы не рекомендуются для рутинной патологоанатомической диагностики бешенства; при наличии ткани головного мозга следует провести FAT. Однако их можно использовать для прижизненной диагностики человеческого бешенства и для эпидемиологических исследований в лабораториях со строгими процедурами контроля качества и с опытом и знаниями в использовании таких методов [1].

4.3. Демонстрация антител

Хотя RFFIT считается золотым стандартом для оценки антител, нейтрализующих вирус бешенства, он имеет несколько недостатков, как упоминалось ранее. Райт и др. исследовали нейтрализацию антителом Lyssaviruses с использованием лентивирусных псевдотипов. Псевдотипы, представляющие собой вирусы, несущие геном и ядро ​​одного вируса и оболочку другого, являются более безопасной альтернативой тестам нейтрализации живых вирусов и могут использоваться для исследований по надзору за бешенством [74].

Методы, основанные на иммуноферментном анализе (ELISA), используются в качестве альтернативы RFFIT. Хотя они представляют собой только тесты связывания антигена, а не функциональные тесты, которые могут обнаруживать нейтрализующие антитела, в отличие от RFFIT, они являются простой, легкой, безопасной и быстрой альтернативой RFFIT. Анализы, которые не требуют наличия живых вирусов и помещений с высокой степенью сдерживания и дают быстрые результаты, были валидированы и хорошо коррелируют с RFFIT [75, 76]. ELISA, основанный на моноклональных антителах к нуклеопротеину (N) и гликопротеину (G) бешенства, был разработан для выявления бешеных иммунных комплексов в образцах спинномозговой жидкости для быстрой предубойной диагностики человеческого бешенства [77].ELISA второго поколения (Platelia Rabies II), разработанный для обнаружения гликопротеиновых антител в образцах человеческой сыворотки и спинномозговой жидкости, прошел многоцентровую оценку. Было обнаружено, что он хорошо коррелирует с RFFIT и может использоваться в лабораториях, в которых нет оборудования для культивирования вирусов и клеток [78]. Несмотря на ряд преимуществ, тесты ELISA, как сообщается, имеют более низкую чувствительность, чем тесты нейтрализации [79–81]. Новый метод ELISA, использующий электрохемилюминесценцию для обнаружения антител к гликопротеинам бешенства в сыворотке крови человека и животных, продемонстрировал более высокую чувствительность, чем традиционные методы ELISA [41].Тест быстрого обнаружения нейтрализующих антител (RAPINA), разработанный с использованием принципа иммунохроматографии, оказался простым и быстрым методом качественного и полуколичественного определения нейтрализующих антител против бешенства у людей и собак [82]. Также был описан простой и быстрый тест латексной агглютинации для обнаружения антирабических антител [83].

Последние достижения в области генной инженерии привели к дальнейшему совершенствованию анализов на основе ELISA. Недавно был разработан новый двойной сэндвич-ELISA с использованием препарата рекомбинантного антигена для обнаружения антител у собак и других видов [84].Nimmagadda et al. впервые описали использование рекомбинантного диатела при разработке ELISA для количественной оценки содержания гликопротеина вируса бешенства в вакцинах против бешенства человека, включающих штамм PV вируса бешенства, и его сравнение с тестом защиты мышей NIH [85]. Анализы, разработанные с использованием этой технологии, могут иметь многообещающее применение в диагностике бешенства в будущем.

4.4. Протеомика и метаболомика

В недавнем исследовании сообщалось о количественном протеомном анализе тканей мозга человека, полученных при вскрытии подтвержденных случаев энцефалитического и паралитического бешенства, для выявления сигнатурных белков, которые дифференцированно регулируются с помощью масс-спектрометрии с высоким разрешением.Некоторые белки экспрессировались по-разному, в том числе кариоферин альфа 4 (KPNA4), сверхэкспрессируемый только при паралитическом бешенстве, кальций-кальмодулинзависимая киназа 2 альфа (CAMK2A), которая активировалась при паралитическом бешенстве, и глутаматаммиачная лигаза (GLUL), которая чрезмерно экспрессировалась как при паралитическом, так и при паралитическом бешенстве. энцефалитное бешенство. Эти молекулы необходимо дополнительно исследовать в жидкостях организма, таких как спинномозговая жидкость, в более широкой когорте случаев бешенства, чтобы определить их возможное использование в качестве предубойных диагностических биомаркеров при бешенстве [86].Другое недавнее исследование метаболомики спинномозговой жидкости людей, лечившихся от бешенства, с использованием спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса ( ¹ HNMR) выявило несколько метаболитов, которые отличали выживших от бешенства от тех, кто впоследствии умер [87]. Дальнейшие исследования метаболомики бешенства могут дать новое понимание диагностической и прогностической значимости этих тестов и механизмов патогенеза бешенства, которые могут служить ориентиром для будущих терапевтических вмешательств при бешенстве.

5.Выводы

Бешенство по-прежнему остается одной из самых запущенных зоонозных болезней во всем мире. Низкий уровень приверженности борьбе с бешенством частично объясняется отсутствием точных и обширных данных эпиднадзора, указывающих на бремя болезни, частой ошибочной диагностикой бешенства и отсутствием межотраслевой координации. Традиционные методы прижизненной и посмертной диагностики бешенства имеют ряд ограничений. Хотя бешенство почти всегда заканчивается смертельным исходом, в последние годы было зарегистрировано несколько выживших людей.Следовательно, раннее, прижизненное лабораторное подтверждение бешенства дает клиницистам стимул к попыткам экспериментальных терапевтических подходов, особенно у пациентов с паралитическим бешенством, которые могут иметь более длительную выживаемость. Последние достижения в диагностических методах, включая молекулярные, дополняют традиционные диагностические подходы и могут произвести революцию в диагностике бешенства. Хотя финансовые и логистические барьеры могут помешать рутинному использованию молекулярных диагностических тестов, соотношение затрат и выгод все же следует измерять.Быстрое сокращение времени обработки и стоимости этих тестов указывает на то, что в ближайшем будущем они станут жизнеспособной технологией в диагностических и справочных лабораториях во всем мире [32, 88].

Список литературы

1. Всемирная организация здравоохранения. Консультация экспертов ВОЗ по бешенству. Второй отчет. Серия технических отчетов Всемирной организации здравоохранения . 2013; (982)

2. Кнобель Д.Л., Кливленд С., Колман П.Г. и др. Переоценка бремени бешенства в Африке и Азии. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения .2005. 83 (5): 360–368. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Streicker DG, Recuenco S, Valderrama W. и др. Экологические и антропогенные факторы воздействия бешенства у летучих мышей-вампиров: последствия для передачи и борьбы. Труды Королевского общества B . 2012. 279 (1742): 3384–3392. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Malerczyk C, DeTora L, Gniel D. Завозные случаи заражения людей бешенством в Европе, США и Японии, с 1990 по 2010 год. Journal of Travel Medicine .2011. 18 (6): 402–407. [PubMed] [Google Scholar] 5. Блэнтон Дж. Д., Палмер Д., Дайер Дж., Рупрехт CE. Эпиднадзор за бешенством в США в 2010 г. Журнал Американской ветеринарной медицинской ассоциации . 2011. 239 (6): 773–783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Коулман П.Г., Февр Е.М., Кливленд С. Оценка воздействия бешенства на здоровье населения. Возникающие инфекционные заболевания . 2004. 10 (1): 140–142. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Лембо Т., Незгода М, Веласко-Вилла А, Кливленд С., Эрнест Э., Рупрехт CE.Оценка прямого быстрого иммуногистохимического теста для диагностики бешенства. Возникающие инфекционные заболевания . 2006. 12 (2): 310–313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Хемачудха Т., Вачараплуесади С., Митрабхакди Э, Уайлд Х., Моримото К., Льюис Р.А. Патофизиология паралитического бешенства человека. Журнал нейровирологии . 2005. 11 (1): 93–100. [PubMed] [Google Scholar] 9. Гадре Г., Сатишчандра П., Махадеван А. и др. Вирусный энцефалит бешенства: клинические детерминанты в диагностике с особым акцентом на паралитическую форму. Журнал неврологии, нейрохирургии и психиатрии . 2010. 81 (7): 812–820. [PubMed] [Google Scholar] 10. Удават Х., Чаудхари Х.Р., Гоял Р.К., Чаудхари В.К., Матур Р. Синдром Гийена-Барре после вакцинации против бешенства семпл — отчет о шести случаях. Журнал ассоциации врачей Индии . 2001; 49: 384–385. [PubMed] [Google Scholar] 11. Шейх К.А., Рамос-Альварес М., Джексон А.С., Ли С.Й., Эсбери А.К., Гриффин Дж.В. Перекрытие патологии при паралитическом бешенстве и аксональном синдроме Гийена-Барре. Анналы неврологии . 2005. 57 (5): 768–772. [PubMed] [Google Scholar] 12. Coertse J, Weyer J, Nel LH, Markotter W. Улучшенные методы ПЦР для обнаружения африканского бешенства и лиссавирусов, связанных с бешенством. Журнал клинической микробиологии . 2010. 48 (11): 3949–3955. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Srinivasan A, Burton EC, Kuehnert MJ, et al. Передача вируса бешенства от донора органов четырем реципиентам трансплантата. Медицинский журнал Новой Англии .2005. 352 (11): 1103–1111. [PubMed] [Google Scholar] 14. Hellenbrand W, Meyer C, Rasch G, Steffens I, Ammon A. Случаи бешенства в Германии после трансплантации органов. Евро наблюдения . 2005; 10 (2) E050224.6 [PubMed] [Google Scholar] 15. Вора Н.М., Басавараджу С.В., Фельдман К.А. и др. Группа по расследованию передачи вируса бешенства, связанного с трансплантатом. Передача варианта вируса бешенства енотов при трансплантации твердых органов. Журнал Американской медицинской ассоциации . 2013. 310 (4): 398–407.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Уиллоуби Р. Э. младший, Тивз К. С., Хоффман Г. М. и др. Выживаемость после лечения бешенства с введением в кому. Медицинский журнал Новой Англии . 2005. 352 (24): 2508–2514. [PubMed] [Google Scholar] 17. Соломон Т., Марстон Д., Маллева М. и др. Урок недели: паралитическое бешенство после двухнедельного отпуска в Индии. Британский медицинский журнал . 2005. 331 (7515): 501–503. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Меслин Ф.Х., Копровский Х., Каплан М.М., редакторы. Лабораторные методы лечения бешенства . 4-е издание. Женева, Швейцария: Всемирная организация здравоохранения; 1996. [Google Scholar] 20. Гольдвассер Р.А., Кисслинг Р.Э. Окрашивание флуоресцентными антителами уличных и фиксированных антигенов вируса бешенства. Труды Общества экспериментальной биологии и медицины . 1958. 98 (2): 219–223. [PubMed] [Google Scholar] 21. Дин DJ, Аблесет М.К., Атанасиу П. Тест флуоресцентных антител. В: Меслин Ф.-Х, Каплан М.М., Копровский Х., ред. Лабораторные методы лечения бешенства .4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 88–96. [Google Scholar] 22. Уорнер К.К., Уитфилд С.Г., Фекаду М., Хо Х. Процедуры воспроизводимого обнаружения мРНК и генома антигена вируса бешенства in situ в фиксированных формалином тканях. Журнал вирусологических методов . 1997. 67 (1): 5–12. [PubMed] [Google Scholar] 23. Баррат Дж. Экспериментальная диагностика бешенства. Адаптация к полевым и тропическим условиям. Материалы Международной конференции по эпидемиологии, контролю и профилактике бешенства в восточной и южной частях Африки; Июнь 1992 г .; Лусака, Замбия.С. 72–83. [Google Scholar] 24. Мадхусудана С.Н. Бешенство . Гургаон, Индия: Macmillan Medical Communications; 2011. [Google Scholar] 25. Mathuranayagam D, Rao PV. Прижизненная диагностика бешенства человека по мазкам-слепкам роговицы иммунофлуоресцентным методом. Индийский журнал медицинских исследований . 1984. 79: 463–467. [PubMed] [Google Scholar] 26. Perrin P, Rollin PE, Sureau P. Быстрая иммуноферментная диагностика бешенства (RREID): полезный и простой метод рутинной диагностики бешенства. Журнал биологической стандартизации . 1986. 14 (3): 217–222. [PubMed] [Google Scholar] 27. Саксена С.Н., Мадхусудана С.Н., Трипати К.К., Гупта П., Ахуджа С. Оценка нового метода быстрой иммунодиагностики бешенства. Индийский журнал медицинских исследований A . 1989. 89: 445–448. [PubMed] [Google Scholar] 28. Миранда Н.Л., Роблес К.Г. Сравнительная оценка нового иммуноферментного теста (RREID) с используемыми в настоящее время диагностическими тестами (DME и FAT) для собачьего бешенства. Журнал тропической медицины и общественного здравоохранения Юго-Восточной Азии .1991. 22 (1): 46–50. [PubMed] [Google Scholar] 29. Копровский Х. Тест на прививку мышей. В: Meslin FX, Kaplan MM, Koprowsky H, ред. Лабораторные методы лечения бешенства . 4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 80–87. [Google Scholar] 30. Вебстер WA, Кейси GA. Выделение вируса в культуре клеток нейробластомы. В: Meslin FX, Kaplan MM, Koprowsky H, ред. Лабораторные методы лечения бешенства . 4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 96–104. [Google Scholar] 31.Мадхусудана С. Н., Сундарамурти С., Уллас П. Т.. Использование линии клеток эмбриональной почки человека HEK-293 для быстрого выделения фиксированных и уличных вирусов бешенства: сравнение с клеточными линиями Neuro-2a и BHK-21. Международный журнал инфекционных болезней . 2010; 14 (12): e1067 – e1071. [PubMed] [Google Scholar] 32. Фукс А.Р., Джонсон Н., Фрейлинг С.М. и др. Новые технологии обнаружения вируса бешенства: вызовы и надежды в 21 веке. PLoS Забытые тропические болезни .2009; 3 (9, статья E530) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Вебстер Л.Т., Доусон Р. Ранняя диагностика бешенства с помощью прививки мышей: измерение гуморального иммунитета к бешенству с помощью теста защиты мышей. Труды Общества экспериментальной биологии и медицины . 1935. 32: 570–573. [Google Scholar] 34. Атанасиу П. Количественный анализ и проверка активности сыворотки против бешенства и иммуноглобулина. В кн .: Каплан М.М., Копровский Х., ред. Лабораторные методы лечения бешенства . 3-е издание.Женева, Швейцария: ВОЗ; 1973. С. 314–318. [Google Scholar] 35. Смит Дж. С., Ягер П. А., Баер Г. М.. Быстрый воспроизводимый тест для определения антител, нейтрализующих бешенство. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения . 1973; 48 (5): 535–541. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Смит Дж. С., Ягер П. А., Баер Г. М.. Быстрый тест ингибирования флюоресцентного фокуса (RFFIT) для определения антител, нейтрализующих вирус бешенства. В: Meslin FX, Kaplan MM, Koprowsky H, ред. Лабораторные методы лечения бешенства .4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 181–191. [Google Scholar] 37. Клике Ф., Обер М., Санье Л. Разработка теста нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (тест FAVN) для количественного определения антител, нейтрализующих бешенство. Журнал иммунологических методов . 1998. 212 (1): 79–87. [PubMed] [Google Scholar] 38. Хостник П. Модификация теста нейтрализации флуоресцентных антител (FAVN) для выявления антител к вирусу бешенства. Журнал ветеринарной медицины, серия B .2000. 47 (6): 423–427. [PubMed] [Google Scholar] 39. Мани Р.С., Мадхусудана С.Н., Махадеван А., Редди В., Беллуди А.Ю., Шанкар С.К. Утилита Taqman PCR в реальном времени для прижизненной и патологоанатомической диагностики человеческого бешенства. Журнал медицинской вирусологии . 2013 [PubMed] [Google Scholar] 40. Хантер М., Джонсон Н., Хеддервик С. и др. Иммуновирологические корреляты у людей, леченных бешенством в терапевтической коме. Журнал медицинской вирусологии . 2010. 82 (7): 1255–1265. [PubMed] [Google Scholar] 41. Ma X, Niezgoda M, Blanton JD, Recuenco S, Rupprecht CE.Оценка нового серологического метода выявления антител к вирусу бешенства после вакцинации. Вакцина . 2012. 30 (36): 5358–5362. [PubMed] [Google Scholar] 42. Neizgoda M, Rupprecht CE. Стандартная рабочая процедура прямого быстрого иммуногистохимического теста для обнаружения антигена вируса бешенства . Атланта: курс национальной сети лабораторной подготовки; Министерство здравоохранения и социальных служб США; Центры по контролю и профилактике заболеваний; 2006. [Google Scholar] 43.Мадхусудана С.Н., Субха С., Танкаппан У., Ашвин Ю.Б. Оценка прямого быстрого иммуногистохимического теста (dRIT) для быстрой диагностики бешенства у животных и людей. Virologica Sinica . 2012. 27 (5): 299–302. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Дюрр С., Наиссенгар С., Миндекем Р. и др. Диагностика бешенства для развивающихся стран. PLoS Забытые тропические болезни . 2008; 2 (3, статья e206) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45. Тао X-Y, Niezgoda M, Du J-L и др.Основное применение прямого экспресс-иммуногистохимического теста для диагностики бешенства в Китае. Чжунхуа Ши Ян Хэ Линь Чуанг Бин Ду Сюэ За Чжи . 2008. 22 (3): 168–170. [PubMed] [Google Scholar] 46. Дайер Дж. Л., Незгода М., Орчиари Л. А., Ягер П. А., Эллисон Дж. А., Рупрехт CE. Оценка непрямого экспресс-иммуногистохимического теста для дифференциации вариантов вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 2013; 190 (1-2): 29–33. [PubMed] [Google Scholar] 47. Кан Б, О Дж, Ли С. и др.Оценка набора для экспресс-иммунодиагностики вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 2007. 145 (1): 30–36. [PubMed] [Google Scholar] 48. Kasempimolporn S, Saengseesom W, Huadsakul S, Boonchang S, Sitprija V. Оценка экспресс-иммунохроматографической тест-полоски для обнаружения вируса бешенства в образцах слюны собак. Журнал ветеринарных диагностических исследований . 2011. 23 (6): 1197–1201. [PubMed] [Google Scholar] 49. Нишизоно А., Хавплод П., Ахмед К. и др. Простой и быстрый иммунохроматографический тест-набор для диагностики бешенства. Микробиология и иммунология . 2008. 52 (4): 243–249. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 50. Ахмед К., Вималаратне О., Дахал Н. и др. Оценка иммунохроматографического экспресс-теста на основе моноклональных антител для прямого обнаружения вируса бешенства в головном мозге людей и животных. Американский журнал тропической медицины и гигиены . 2012. 86 (4): 736–740. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 51. Сюй Г., Вебер П., Ху К. и др. Простой сэндвич-ELISA (WELYSSA) для обнаружения нуклеокапсида лиссавируса в образцах с подозрением на бешенство с использованием мышиных моноклональных антител. Биологические препараты . 2007. 35 (4): 297–302. [PubMed] [Google Scholar] 52. Сюй Г., Вебер П., Ху К. и др. WELYSSA: простой инструмент, использующий моноклональные антитела мыши для обнаружения нуклеокапсида лиссавируса в образцах с подозрением на бешенство. Разработки в области биологии . 2008. 131: 555–561. [PubMed] [Google Scholar] 53. Мадхусудана С.Н., Пол JPV, Абхилаш В.К., Суджа М.С. Быстрая диагностика бешенства у людей и животных с помощью иммуноферментного дот-блоттинга. Международный журнал инфекционных болезней .2004. 8 (6): 339–345. [PubMed] [Google Scholar] 54. Васант Дж. П., Мадхусудана С. Н., Абхилаш К. В., Суджа М. С., Мухамуда К. Разработка и оценка иммуноферментного анализа для быстрой диагностики бешенства у людей и животных. Индийский журнал патологии и микробиологии . 2004. 47 (4): 574–578. [PubMed] [Google Scholar] 55. Mousli M, Turki I, Kharmachi H, Dellagi K. Генетически сконструированный колориметрический гибридный белок с одноцепочечным антителом для быстрой диагностики вируса бешенства. Разработки в области биологии .2008. 131: 483–491. [PubMed] [Google Scholar] 56. Crepin P, Audry L, Rotivel Y, Gacoin A, Caroff C, Bourhy H. Интравитамная диагностика человеческого бешенства с помощью ПЦР с использованием слюны и спинномозговой жидкости. Журнал клинической микробиологии . 1998. 36 (4): 1117–1121. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Даше Л., Рейнс Дж. М., Бучи П. и др. Надежный диагноз человеческого бешенства на основе анализа биоптатов кожи. Клинические инфекционные болезни . 2008. 47 (11): 1410–1417. [PubMed] [Google Scholar] 58.Надин-Дэвис С.А. Протоколы полимеразной цепной реакции для распознавания вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 1998. 75 (1): 1–8. [PubMed] [Google Scholar] 59. Маседо К.И., Карниели П., младший, Брандао П.Е. и др. Диагностика случаев бешенства у людей методом полимеразной цепной реакции образцов кожи шеи. Бразильский журнал инфекционных заболеваний . 2006. 10 (5): 341–345. [PubMed] [Google Scholar] 60. Бисвал М., Ратхо Р.К., Мишра Б. Роль полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы в диагностике бешенства человека. Индийский журнал медицинских исследований . 2012. 135 (6): 837–842. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 61. Нагарадж Т., Васант Дж. П., Десаи А., Камат А., Мадхусудана С. Н., Рави В. Предубойная диагностика человеческого бешенства с использованием образцов слюны: сравнение методов RT-PCR в реальном времени и традиционных. Журнал клинической вирусологии . 2006. 36 (1): 17–23. [PubMed] [Google Scholar] 62. Hayman DTS, Banyard AC, Wakeley PR и др. Универсальный анализ в реальном времени для обнаружения лиссавирусов. Журнал вирусологических методов . 2011; 177 (1): 87–93. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 63. Надин-Дэвис С.А., Шин М., Ванделер А.И. Разработка методов полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы в реальном времени для диагностики бешенства человека. Журнал медицинской вирусологии . 2009. 81 (8): 1484–1497. [PubMed] [Google Scholar] 64. Уэйкли П.Р., Джонсон Н., Макэлхинни Л.М., Марстон Д., Сойер Дж., Фукс А.Р. Разработка анализа обратной транскрипции TaqMan-ПЦР в реальном времени для обнаружения и дифференциации генотипов лиссавируса 1, 5 и 6. Журнал клинической микробиологии . 2005. 43 (6): 2786–2792. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. Hughes GJ, Smith JS, Hanlon CA, Rupprecht CE. Оценка анализа TaqMan PCR для обнаружения РНК вируса бешенства: влияние вариации последовательности и применение для количественной оценки вирусной нагрузки. Журнал клинической микробиологии . 2004. 42 (1): 299–306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Wacharapluesadee S, Sutipanya J, Damrongwatanapokin S, et al. Разработка TaqMan анализа RT-PCR в реальном времени для обнаружения вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 2008. 151 (2): 317–320. [PubMed] [Google Scholar] 67. Wacharapluesadee S, Hemachudha T. Амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот в быстрой диагностике бешенства. Ланцет . 2001. 358 (9285): 892–893. [PubMed] [Google Scholar] 68. Мулея В., Намангала Б., Мвине А. и др. Молекулярная эпидемиология и метод петлевой изотермической амплификации для диагностики инфекции вирусом бешенства в Замбии. Исследование вирусов . 2012. 163 (1): 160–168.[PubMed] [Google Scholar] 69. Болдбаатар Б., Иноуэ С., Сугиура Н. и др. Быстрое обнаружение вируса бешенства с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией. Японский журнал инфекционных болезней . 2009. 62 (3): 187–191. [PubMed] [Google Scholar] 70. Араужо Д.Б., Лангони Х., Алмейда М.Ф., Мегид Дж. Геминизированная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (hnRT-PCR) как инструмент для обнаружения вируса бешенства в хранимых и разложенных образцах. BMC Research Notes . 2008; 1, статья 17 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 71.Дэвид Д., Якобсон Б., Ротенберг Д., Дверес Н., Дэвидсон И., Страм Ю. Обнаружение вируса бешенства с помощью ОТ-ПЦР в разложенном, естественно инфицированном мозге. Ветеринарная микробиология . 2002. 87 (2): 111–118. [PubMed] [Google Scholar] 72. Джонсон Н., Фукс А.Р. Архивное исследование финского изолята от вспышки бешенства 1988/89 гг. Архив вирусологии . 2005. 150 (7): 1407–1414. [PubMed] [Google Scholar] 73. Майер Т., Швартинг А., Мауэр Д. и др. Ведение и результаты после нескольких трансплантаций роговицы и твердых органов от донора, инфицированного вирусом бешенства. Клинические инфекционные болезни . 2010. 50 (8): 1112–1119. [PubMed] [Google Scholar] 74. Райт Э., Темпертон, штат Нью-Джерси, Марстон Д.А., Макэлхинни Л.М., Фукс А.Р., Вайс Р.А. Изучение нейтрализации лиссавирусов антителами с использованием лентивирусных псевдотипов: межвидовое сравнение. Журнал общей вирусологии . 2008. 89 (9): 2204–2213. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Серват А, Фейссаге М., Бланшар I и др. Количественный непрямой ИФА для мониторинга эффективности вакцинации против бешенства домашних и диких плотоядных животных. Журнал иммунологических методов . 2007. 318 (1-2): 1–10. [PubMed] [Google Scholar] 76. Мухамуда К., Мадхусудана С.Н., Рави В. Разработка и оценка конкурентного ИФА для оценки нейтрализующих антител против бешенства после постконтактной вакцинации против бешенства у людей. Международный журнал инфекционных болезней . 2007. 11 (5): 441–445. [PubMed] [Google Scholar] 77. Мухамуда К., Мадхусудана С. Н., Рави В., Десаи А. Присутствие специфических для бешенства иммунных комплексов в спинномозговой жидкости может помочь в предубойной диагностике паралитического бешенства человека. Журнал клинической вирусологии . 2006. 37 (3): 162–167. [PubMed] [Google Scholar] 78. Фейсаге М., Даше Л., Одри Л. и др. Многоцентровое сравнительное исследование нового ELISA, PLATELIA ™ RABIES II, для обнаружения и титрования антител к гликопротеинам против бешенства и сравнения с быстрым тестом ингибирования флюоресцентного фокуса (RFFIT) на человеческих образцах от вакцинированных и невакцинированных людей. Вакцина . 2007. 25 (12): 2244–2251. [PubMed] [Google Scholar] 79. Кликет Ф., МакЭлхинни Л.М., Серват А. и др.Разработка качественного непрямого ИФА для измерения специфических антител к вирусу бешенства у вакцинированных собак и кошек. Журнал вирусологических методов . 2004. 117 (1): 1–8. [PubMed] [Google Scholar] 80. Серват А., Клике Ф. Совместное исследование по оценке нового теста ELISA для мониторинга эффективности вакцинации против бешенства у домашних хищников. Исследование вирусов . 2006. 120 (1-2): 17–27. [PubMed] [Google Scholar] 81. Уэлч Р.Дж., Андерсон Б.Л., Литвин К.М. Оценка двух коммерчески доступных ELISA и одной собственной референс-лаборатории ELISA для определения человеческих антител к вирусу бешенства. Журнал медицинской микробиологии . 2009. 58 (6): 806–810. [PubMed] [Google Scholar] 82. Нишизоно А., Ямада К., Хавплод П. и др. Оценка улучшенного теста быстрого обнаружения нейтрализующих антител (RAPINA) для качественного и полуколичественного обнаружения нейтрализующих антител против бешенства у людей и собак. Вакцина . 2012. 30 (26): 3891–3896. [PubMed] [Google Scholar] 83. Мадхусудана С.Н., Сарасвати С. Разработка и оценка теста латексной агглютинации на антитела к бешенству. Журнал клинической вирусологии .2003. 27 (2): 129–135. [PubMed] [Google Scholar] 84. Ян Л-М, Чжао Л-З, Ху Р-Л, Ши З-С, Лю В-Дж. Новый иммуноферментный сэндвич-анализ с двойным антигеном для измерения антител против вируса бешенства. Клиническая и вакцинная иммунология . 2006. 13 (8): 966–968. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85. Ниммагадда С.В., Аавула С.М., Бирадхар Н. и др. Иммуноферментный иммуносорбент на основе рекомбинантных диател для количественного определения гликопротеина вируса бешенства. Клиническая и вакцинная иммунология .2010. 17 (8): 1261–1268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 86. Венугопал А.К., Гантасала С.С., Сельван Л.Д. и др. Количественная протеомика для определения биомаркеров бешенства. Клиническая протеомика . 2013; 10 (1, статья 3) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 87. О’Салливан А., Уиллоуби Р. Э., Мищук Д. и др. Метаболомика спинномозговой жидкости людей, леченных от бешенства. Журнал протеомных исследований . 2013; 12 (1): 481–490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 88.Сильва С.Р., Кац И.С., Мори Э. и др. Достижения биотехнологии: взгляд на диагностику и исследование вируса бешенства. Биологические препараты . 2013. 41 (4): 217–223. [PubMed] [Google Scholar]

Лабораторная диагностика бешенства человека: последние достижения

ScientificWorldJournal. 2013; 2013: 569712.

Рита Субраманиам Мани

Отделение нейровирологии, Сотрудничающий центр ВОЗ по справочной информации и исследованиям бешенства, Национальный институт психического здоровья и неврологии (NIMHANS), Бангалор 560029, Индия

Шампур Нараян Мадхусудана

Отделение нейровиологии , Сотрудничающий центр ВОЗ по справочной информации и исследованиям бешенства, Национальный институт психического здоровья и неврологии (NIMHANS), Бангалор 560029, Индия

Департамент нейровирологии, Сотрудничающий центр ВОЗ по справочным материалам и исследованиям в области бешенства, Национальный институт психического здоровья и неврологии ( NIMHANS), Bangalore 560029, India

Академические редакторы: H.Фикеншер и К. Икута

Получено 31 августа 2013 г .; Принято 26 сентября 2013 г.

Copyright © 2013 Р. С. Мани и С. Н. Мадхусудана.

Это статья в открытом доступе, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Бешенство, острый прогрессирующий смертельный энцефаломиелит, который чаще всего передается через укус бешеного животного, является причиной примерно 61 000 смертей людей во всем мире.Истинное бремя болезней и последствия бешенства для здоровья населения остаются недооцененными из-за отсутствия чувствительных методов лабораторной диагностики. Быстрая диагностика бешенства может помочь начать оперативный инфекционный контроль и меры общественного здравоохранения, устранить необходимость в ненужном лечении / медицинских тестах и ​​помочь в своевременном проведении профилактической вакцинации до или после контакта с членами семьи и медицинским персоналом. Прижизненная диагностика человеческого бешенства побуждает клиницистов попробовать экспериментальные терапевтические подходы к некоторым пациентам, особенно после того, как сообщается о выживании нескольких случаев человеческого бешенства.Традиционные методы прижизненной и посмертной диагностики бешенства имеют ряд ограничений. Последние достижения в технологии привели к усовершенствованию или развитию нескольких диагностических тестов, которые включают методы обнаружения антигена вируса бешенства и антител и анализы для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот и идентификации конкретных биомаркеров. Эти тесты, дополняющие традиционные методы, могут в будущем произвести революцию в диагностике бешенства.

1. Введение

Бешенство, одно из старейших и наиболее опасных зоонозных заболеваний, известных человечеству, представляет собой острый, прогрессирующий и почти смертельный энцефаломиелит, вызываемый вирусом бешенства (RABV) и другими видами Lyssavirus , вызываемыми вирусом бешенства. семейство Rhabdoviridae.

Несмотря на отсутствие точных данных о глобальном бремени забытых тропических болезней, оценки прямой смертности от бешенства, которое чаще всего передается через укус бешеного животного, являются одними из самых высоких. Ежегодное число случаев смерти людей от бешенства во всем мире в 2010 году оценивается в 61 000 (95% ДИ 37 000–86 000), при этом подавляющее большинство смертей (84%) приходится на сельские районы. Ориентировочная годовая стоимость бешенства составляет 6 миллиардов долларов США (95% ДИ, 4,6–7,3 миллиарда), из которых почти 2 миллиарда долларов США связаны с потерей производительности после преждевременной смерти и еще 1 доллар США.6 миллиардов потрачено непосредственно на постконтактную профилактику [1].

Большинство случаев смерти людей от бешенства происходит в Азии и Африке. Оценки смертности людей от эндемического собачьего бешенства в Азии и Африке ежегодно превышают 30 000 и 23 000, соответственно [2]. В Латинской Америке и Карибском бассейне за последние два десятилетия были достигнуты существенные успехи в борьбе с бешенством собак и в сокращении случаев заражения людей бешенством, передаваемым собаками. Однако, по сообщениям, заболеваемость бешенством летучих мышей увеличилась, что, вероятно, привело к увеличению числа случаев заболевания людей и падежам домашнего скота [3].

Собачье бешенство ликвидировано в Западной Европе, Канаде, Соединенных Штатах Америки (США), Японии, Малайзии и некоторых странах Латинской Америки. Австралия свободна от хищного бешенства, а многие государства тихоокеанских островов всегда были свободны от бешенства и связанных с ним вирусов. В этих областях человеческая смерть от бешенства ограничивается людьми, зараженными во время проживания или путешествий в районах, эндемичных по собачьему бешенству [1, 4]. Однако во многих странах, где циркулируют вирусы бешенства диких животных или летучих мышей, профилактика бешенства обходится дорого.Ежегодно в США происходит от одного до восьми случаев смерти людей от бешенства в результате бешенства диких животных, и, по оценкам, на профилактику бешенства ежегодно тратится около 300 миллионов долларов США [1, 5].

Лабораторная диагностика и эпиднадзор за бешенством животных и людей серьезно ограничены в большинстве развивающихся стран, где бешенство является эндемическим заболеванием. Истинное бремя болезней и воздействие бешенства на здоровье населения остаются недооцененными из-за отсутствия простых, чувствительных и экономичных лабораторных методов диагностики бешенства.Это может быть одной из важных причин, по которым бешенство остается забытым зоонозом во многих развивающихся странах Азии и Африки [6, 7].

2. Необходимость лабораторной диагностики случаев бешенства у человека

У людей различают две различные формы бешенства — бешеную и паралитическую. Диагностика классической формы бешенства (энцефалита), которая составляет около 80% случаев бешенства у людей, основана на ее характерных клинических признаках и симптомах и редко вызывает диагностические трудности.Однако лабораторная помощь может потребоваться в некоторых случаях, когда отсутствуют характерные клинические признаки, такие как аэрофобия или гидрофобия. В клинической практике паралитические или атипичные формы, которые составляют около 20% случаев бешенства среди людей, представляют собой диагностическую дилемму. Эти случаи часто клинически неотличимы от синдрома Гийена-Барре (СГБ), а также их необходимо дифференцировать от нейропаралитических осложнений из-за вакцины против бешенства типа Семпла, которая все еще используется в нескольких странах, таких как Монголия, Мьянма и Пакистан [8–11] .Ситуация усугубляется отсутствием в анамнезе укусов животных, психиатрических или других атипичных клинических проявлений, недоступностью окончательного диагностического теста на СГБ и ограниченной доступностью тестов для прижизненной диагностики человеческого бешенства [9].

Быстрая диагностика бешенства жизненно важна для принятия своевременных и надлежащих мер инфекционного контроля и общественного здравоохранения. Ранняя диагностика может устранить необходимость в ненужном лечении и медицинских тестах, а также помочь в прогнозировании, учреждении барьерного ухода, своевременном проведении профилактической вакцинации до или после контакта членам семьи пациента и лечащему медицинскому и медперсоналу, а также закрытию случая и психологическое консультирование с членами семьи.Отрицательные лабораторные тесты на бешенство могут указывать на наличие другого инфекционного агента или неинфекционную этиологию и способствовать надлежащему медицинскому ведению. Лабораторная диагностика бешенства также может помочь в конкретной характеристике возбудителя и предположить потенциальный источник инфекции, особенно при отсутствии истории контакта с животным, а также выявить других людей, которые могли подвергаться воздействию того же источника инфекции [ 1, 9, 12].

Сообщения о заражении бешенством при трансплантации органов [13–15] подчеркивают необходимость скрининга доноров органов на бешенство, особенно у доноров с острым прогрессирующим энцефалитом необъяснимой этиологии, и наличие других факторов риска бешенства.

Хотя известно, что человеческое бешенство приводит к почти 100% смертельному исходу, зарегистрированные данные о выживании подростка, который заболел бешенством после укуса летучей мыши в США с использованием «Протокола Милуоки» в 2005 году [16], возродили интерес в медицинском сообществе к попыткам эксперимента. терапевтические подходы. Возможности лечения дают дополнительный импульс попыткам поставить диагноз как можно скорее [17], и, следовательно, в последние годы прижизненная лабораторная диагностика приобрела большее значение. Недавняя консультация экспертов ВОЗ поощряет исследования по определению протоколов лечения, процедур иммуномодуляции и новых лекарств, включая противовирусные препараты [1].

Постоянный надзор и лабораторное подтверждение клинически подозреваемых случаев бешенства необходимы в странах, в которых в последние годы зарегистрировано снижение заболеваемости бешенством среди людей (например, Шри-Ланка, Таиланд) и которые работают над искоренением бешенства в ближайшем будущем. Географические границы не могут сдержать вирус бешенства; до тех пор, пока где-либо существуют очаги диких животных или собачьего бешенства, а также продолжаются международные поездки и глобальная торговля скотом, домашними животными и дикими животными, угроза реинтродукции бешенства существует даже в странах, которые были свободны от бешенства в течение многих лет.Например, индонезийский остров Бали до конца ноября 2008 года считался свободным от бешенства. Однако с тех пор произошла вспышка бешенства по всему острову, и бешенство было подтверждено как у собак, так и у людей, в результате чего к концу 2012 года погиб 141 человек. [1].

3. Обычные диагностические тесты на бешенство: преимущества и ограничения

Лабораторные методы лечения бешенства были начаты еще в 1800 году до нашей эры, когда Зинке впервые продемонстрировал, что инфекция может передаваться нормальным животным после прививки слюной от бешеных. животное.Знаменательное открытие тел Негри Адельчи Негри в 1903 году и демонстрация их диагностической значимости его женой Линой Негри-Луццани в 1913 году проложили путь к лабораторному подтверждению бешенства.

Окончательный диагноз бешенства может быть поставлен только с помощью соответствующих лабораторных методов. Основные методы описаны в публикации ВОЗ Лабораторные методы лечения бешенства [18] и Руководстве МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных [19].

3.1. Прямая микроскопия: гистологическая идентификация характерных клеточных поражений

Инфицированные нейрональные клетки выявляют агрегаты вирусных частиц «тельца Негри», которые представляют собой внутрицитоплазматические тельца включения, специфичные для бешеного энцефалита, что подтверждается гистологическими тестами (метод продавца) на мазках, взятых из различных областей мозга. . Тельца Негри различаются по размеру от 3 мкм мкм до 30 мкм мкм и обычно имеют круглую или овальную форму и глубоко эозинофильные с характерными базофильными гранулами, часто расположенными в форме розетки внутри эозинофильной матрицы. .

Несмотря на то, что это простой экспресс-тест, метод Продавца для нефиксированных мазков тканей имеет очень низкую чувствительность и подходит только для свежих образцов. Методы окрашивания срезов залитых парафином тканей мозга отнимают много времени, менее чувствительны и более дороги. Гистологические методы гораздо менее чувствительны, чем иммунологические, особенно в случае аутолизированных образцов, и больше не рекомендуются для первичной диагностики как у людей, так и у животных [1, 18, 19].

3.2. Демонстрация вирусного антигена

3.2.1. Метод флуоресцентных антител (FAT)

Наиболее широко используемый тест для посмертной диагностики бешенства — это тест на флуоресцентные антитела (FAT), который рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией здравоохранения животных (OIE). Этот тест, разработанный Голдвассером и Кисслингом в 1957 году, до сих пор является золотым стандартом диагностики бешенства [20, 21]. Он включает демонстрацию нуклеопротеинового антигена (N) вируса бешенства в свежих мазках мозга подозреваемого на бешенство с помощью иммунофлуоресцентного метода ().Его также можно использовать для подтверждения присутствия антигена бешенства в культуре клеток или в ткани мозга мышей, которые были привиты для диагностики. Специфичность и чувствительность теста почти достигают 99% в опытной лаборатории, а результаты доступны в течение нескольких часов.

Метод флуоресцентных антител (FAT) для анализа мазка мозга человека на бешенство.

Надежные результаты получаются только при использовании свежей мозговой ткани; тем не менее, FAT также может применяться к образцам, сохраненным в 50% физиологическом растворе глицерина, после тщательной промывки образцов физиологическим раствором.Если образец хранился в растворе формалина, FAT можно использовать только после обработки образца протеолитическим ферментом [22]. Однако FAT на фиксированных формалином и переваренных образцах всегда менее надежен и более сложен, чем когда выполняется на свежих тканях [23]. Частично разложившийся мозг не подходит для этого теста, так как очень трудно отличить специфическую флуоресценцию, вызванную N-антигеном, от неспецифической флуоресценции, которая может быть результатом бактериального заражения.

Получение посмертной биопсии / вскрытия мозга по-прежнему является проблемой из-за религиозных, культурных и других факторов, при этом снижение показателей вскрытия является общей проблемой как в развитых, так и в развивающихся странах. Наличие методов прижизненной диагностики бешенства в образцах, отличных от ткани головного мозга, очень важно и позволит обойтись без инвазивной биопсии / вскрытия мозга и связанных с этим процедур логистики и безопасности.

FAT также может быть выполнен на мазках роговицы и биопсии выйной кожи в подозреваемых случаях; однако было обнаружено, что он имеет ограниченную надежность и низкую чувствительность для прижизненной диагностики бешенства [24, 25].Кроме того, FAT на слепках роговицы не рекомендуется в качестве рутинного теста из-за риска скарификации роговицы, особенно у пациентов с энцефалитом, а не бешенством [1].

Кроме того, потребность в дорогом флуоресцентном микроскопе, который требует технического обслуживания, а также квалифицированного персонала для интерпретации результатов теста, ограничивает его использование во многих развивающихся странах.

3.2.2. Быстрая энзимная иммунодиагностика бешенства (RREID)

Антиген N бешенства также может быть обнаружен с помощью иммуногистохимических методов, а также иммуноферментных анализов.Методика на основе ELISA была разработана Perrin et al. в 1986 г., известный как экспресс-ферментная иммунодиагностика бешенства (RREID) [26]. Этот метод основан на улавливании белка N бешенства в гомогенате мозга поликлональным или моноклональным антителом против N, нанесенным на твердую фазу. Впоследствии захваченный антиген выявляется путем добавления конъюгированного с пероксидазой моноклонального или поликлонального антитела, полученного у разных видов, или, что еще лучше, путем добавления биотинилированного N-антитела с последующим добавлением стрептавидинпероксидазы и проявления окраски с помощью о-фенилендиамин дигидрохлорида (OPD) и перекиси водорода.В различных исследованиях установлено, что этот тест столь же чувствителен и специфичен, как и FAT [27, 28] (). Дополнительным преимуществом является то, что частичное разложение мозга не повлияет на результат теста. Ограничением теста является потребность в ткани головного мозга, что исключает его использование в прижизненной диагностике.

Диагностика бешенства методом быстрой ферментной иммунодиагностики бешенства (RREID). Обратите внимание на темно-коричневый цвет, полученный с положительным мозгом на бешенство по сравнению с отрицательным мозгом, который кажется бесцветным.

3.3. Изоляция вируса

Выделение вируса требуется для подтверждающего диагноза, особенно когда FAT дает неопределенный результат и, что более важно, для молекулярной характеристики вирусов в географическом районе и для отслеживания происхождения вируса, если бешенство происходит в зоне, свободной от бешенства. Для этой цели можно использовать два метода: метод инокуляции мышей (MIT) и экспресс-тест на инфицирование тканевой культурой (RTCT) [29, 30].

3.3.1. Тест на прививку мышей

От трех до десяти мышей в возрасте 3-4 недель (12–14 г) или помет двухдневных новорожденных мышей прививают интрацеребрально осветленным супернатантом 10–20% ( w / v) гомогенат мозгового материала в изотоническом буферном растворе, содержащем антибиотики.За привитыми мышами наблюдают ежедневно в течение 28 дней; у них появляются типичные признаки и симптомы бешенства в любое время через 5–7 дней в зависимости от инкубационного периода. Они состоят из начального взъерошивания волос, сгибания спины и волочения задних конечностей с последующим параличом задних и передних конечностей. Дальнейшее подтверждение диагноза может быть сделано путем извлечения головного мозга больной мыши и его обработки FAT.

Недостатком MIT является длительный интервал до постановки диагноза, поскольку за привитыми мышами необходимо наблюдать в течение 28 дней, поскольку некоторые дикие вирусы могут иметь очень длительный инкубационный период.Если в лаборатории имеются помещения для культивирования клеток, следует рассмотреть возможность замены теста на прививку мыши на культуру клеток, когда это возможно, поскольку он позволяет избежать использования живых животных, является менее дорогостоящим и дает более быстрые результаты. Однако преимущества MIT заключаются в том, что при положительном результате теста большое количество вируса может быть выделено из мозга отдельной мыши для целей идентификации штамма и что его можно легко и практически применить в ситуациях, когда навыки и возможности для других тестов (например, .g., клеточная культура) недоступны [19].

3.3.2. Быстрый тест на заражение тканевой культурой (RTCT)

По сравнению с MIT, выделение вируса в клеточной культуре происходит быстро, а результаты можно получить в течение 24–48 часов. Клеточные линии, наиболее подходящие для выделения вируса, имеют нервное происхождение, и наиболее часто используемой клеточной линией является клеточная линия нейробластомы мыши Neuro-2a. Другие используемые клеточные линии, которые могут быть не такими чувствительными, как Neuro-2a, включают клетки, связанные с куриным эмбрионом (CER) и клетки почек детеныша хомячка (BHK 21).Подозрительный клинический образец или гомогенат головного мозга инокулируют на клетки, выращенные во флаконе с оболочкой или 96-луночных планшетах, инкубируют в течение 24 часов и окрашивают прямым FAT после фиксации ацетоном. Недавно новая клеточная линия, линия клеток эмбриональной почки человека (HEK 293), была оценена на предмет выделения фиксированных и уличных вирусов и оказалась столь же чувствительной и специфичной, как клеточная линия Neuro-2a [31] (). RTCT — более быстрая и дешевая альтернатива MIT; однако это может быть выполнено только в лабораториях с оборудованием для культивирования клеток, а также с флуоресцентным микроскопом.

Выделение вируса в культуре клеток: инфицированные уличным вирусом Neuro-2a (a) и HEK 293 (b), окрашенные методом флуоресцентных антител (FAT).

3.4. Демонстрация антител

Демонстрация антител в сыворотке при отсутствии вакцинации против бешенства в анамнезе или в спинномозговой жидкости предлагает косвенное свидетельство инфекции бешенства. Интерпретация результатов тестов может быть затруднена, поскольку иммунный ответ хозяина может различаться у разных людей. Отрицательная прогностическая ценность серологических тестов для диагностики бешенства считается низкой [32].Серологическое тестирование редко бывает полезным для прижизненной диагностики из-за поздней сероконверсии и высокой смертности видов-хозяев, но может помочь в диагностике паралитического бешенства, когда выживаемость относительно дольше. Однако серологические методы очень полезны для оценки сероконверсии после вакцинации и для эпидемиологических исследований.

Поскольку нейтрализующие антитела считаются ключевым компонентом адаптивного иммунного ответа против вируса бешенства, тесты нейтрализации вируса (VN) в клеточных культурах являются предписанными тестами для проверки ответов на вакцинацию.Результаты выражены в международных единицах относительно международной стандартной антисыворотки. Для этой цели были описаны тест нейтрализации мыши (MNT), тест быстрого ингибирования флюоресцентного фокуса (RFFIT) и тест нейтрализации вируса флуоресценции антител (FAVN). Широко используемый тест нейтрализации вирусов на мышах (MNT), разработанный в 1935 году Вебстером и Доусоном [33, 34], больше не рекомендуется ВОЗ или МЭБ.

Адаптация «стандартного штамма контрольного вируса (CVS)» вируса бешенства для роста в культуре клеток привела к разработке альтернативных анализов, в которых репликация ненейтрализованного вируса в культуре выявляется путем наблюдения за бляшками, инфицированными клетками. окрашивание флуоресцентным антителом или окрашивание меченным ферментом антителом против бешенства.RFFIT является одним из наиболее широко используемых заменителей теста нейтрализации мышей (MNT) и представляет собой быстрый тест, для выполнения которого требуется всего 20 часов, и он немного более чувствителен, чем MNT для обнаружения вирус-нейтрализующих антител (VNAs) в поствакцинальных сыворотках [ 35, 36]. Тест FAVN, который является адаптацией RFFIT, был разработан в 1998 году, и полученные результаты показали хорошее согласие с MNT и RFFIT [37]. Также сообщается о модификации этого теста, в котором моноклональные антитела против бешенства и конъюгат пероксидазы с антимышиным антителом использовались вместо конъюгированных с флуоресцеином антител против бешенства [38].

В недавнем лабораторном исследовании по диагностике человеческого бешенства антитела, нейтрализующие вирус бешенства, были обнаружены с помощью RFFIT в 4/11 (36,3%) образцах ЦСЖ, полученных для прижизненной диагностики, и 7/13 (53,8%) образцах ЦСЖ, полученных посмертно, что представляет собой терминальная стадия болезни. Обнаружена обратная корреляция между обнаружением нейтрализующих антител и присутствием вирусной РНК в образцах спинномозговой жидкости [39]. Тестирование на антитела также является полезным инструментом для мониторинга иммунного ответа в центральной нервной системе и, таким образом, возможного избавления от вируса бешенства у пациентов, которые будут лечиться по «протоколу Милуоки» или другим экспериментальным вмешательствам в будущем [40].

RFFIT считается золотым стандартом анализа и уже несколько лет используется для оценки титра нейтрализующих антител к вирусу бешенства. Однако для проведения теста требуются подготовленные кадры, оборудование для культивирования клеток и флуоресцентной микроскопии, а также адекватные меры биобезопасности для работы с живым вирусом. RFFIT чувствителен к цитотоксичности в сыворотках низкого качества [41], а неспецифические ингибиторы вируса в сыворотках могут давать ложноположительные результаты.

4. Новые диагностические тесты на бешенство

4.1. Демонстрация вирусного антигена

4.1.1. Прямой экспресс-иммуногистохимический тест (dRIT)

Одним из наиболее значительных достижений последних лет является разработка и оценка экспресс-иммуногистохимического теста под названием Direct Rapid Immunohistochemical Test (dRIT), разработанного в Центрах по контролю за заболеваниями (CDC), Атланта, США [ 42]. Тест основан на обнаружении белка N бешенства в предполагаемых мазках мозга, зафиксированных в забуференном формалине, с использованием смеси высококонцентрированных и очищенных биотинилированных моноклональных антител к белку N с последующим добавлением стрептавидинпероксидазы и окрашивающего реагента субстрата (H ₂ O ₂ и аминоэтилкарбазол).N-антигены бешенства, если они присутствуют, обнаруживаются в виде коричневато-красных кластеров внутри нейрона, вдоль аксонов и разбросаны по мазкам головного мозга (). Вся процедура тестирования занимает менее одного часа и имеет то преимущество, что ее можно применять в полевых условиях, поскольку не требуется дорогостоящий флуоресцентный микроскоп. Тест был оценен в полевых условиях в Танзании и оказался на 100% чувствительным и специфичным по сравнению с FAT. Тест может быть успешно проведен на образцах, хранящихся в растворе глицерина в течение 15 месяцев или замороженных в течение 24 месяцев, и в различных условиях хранения.Это увеличивает его пригодность для использования в полевых условиях в развивающихся странах, где холодильные камеры могут быть недоступны [7]. Тест также прошел обширную оценку в других странах [43–45], и была обнаружена 100% корреляция с FAT.

Методика прямого быстрого иммуногистохимического теста (dRIT), проводимая на человеческом мозге с положительным результатом на бешенство. Обратите внимание на присутствие коричневато-красных частиц в нейроне, распространяющемся по дендритам и аксону.

Хотя для dRIT требуется хранение реагентов в холодильнике, одним из основных преимуществ этого недавно разработанного теста является относительная простота интерпретации с использованием обычного светового микроскопа.Этот простой тест позволит развивающимся странам улучшить эпидемиологический надзор за бешенством при значительно меньших затратах и ​​без необходимости в чрезмерно дорогом флуоресцентном микроскопическом оборудовании, а также в экспертных знаниях и финансовых затратах, необходимых для его обслуживания. Экономическая эффективность dRIT позволит передавать знания и технологии в отдаленные районы развивающегося мира, где трудно получить данные о заболеваемости бешенством. Это также может быть полезно при принятии решений относительно рационального использования постконтактной профилактики бешенства [7, 44].

ВОЗ рекомендует дальнейшее развитие прямых быстрых иммуногистохимических тестов в качестве альтернативы прямому флуоресцентному тесту на антитела для улучшенного децентрализованного лабораторного надзора [1]. Однако один из основных факторов, который требует рассмотрения, прежде чем рекомендовать лабораториям в развивающихся странах принять dRIT для диагностики бешенства, — это бесперебойная поставка критически важных реагентов (моноклональных антител против N), которые в настоящее время доступны только через CDC, Атланта.Следует рассмотреть вопрос о коммерциализации реагентов или возможности местного производства в отдельных лабораториях в развивающихся странах [43].

4.1.2. Непрямой экспресс-иммуногистохимический тест (IRIT)

Недавно с помощью традиционной световой микроскопии был проведен непрямой экспресс-иммуногистохимический тест (IRIT) для обнаружения и дифференциации вариантов вируса бешенства (RABV). Свежезамороженные слепки прикосновения мозга или монослои культур клеток, зафиксированные в забуференном формалине, окрашивают панелью мышиных моноклональных антител против нуклеопротеина (mAb-N) и коммерчески доступных меченных биотином козьих антимышиных антител.Девяносто шесть (96) изолятов RABV, представляющих 20 вариантов RABV, ранее определенных с помощью антигенного типирования с использованием панели mAb-N и непрямого флуоресцентного теста на антитела (IFA), а также анализа генетической последовательности были охарактеризованы с помощью IRIT. Результаты IRIT выявили различные паттерны реактивности, связанные с текущими и историческими резервуарными хозяевами RABV, аналогично тесту IFA и анализу генетической последовательности.

ИРИТ не требует специального оборудования и может выполняться в полевых условиях. Кроме того, коммерчески доступные меченые вторичные антитела позволяют использовать стандартную панель немеченых первичных mAb без необходимости флуоресцентной микроскопии.Таким образом, IRIT можно использовать в качестве экономичного диагностического теста, который также может помочь в изучении распространенности, распространения и передачи вируса бешенства среди резервуарных хозяев в энзоотических областях бешенства [46].

4.1.3. Иммунохроматографические методы

Другой недавно описанный метод обнаружения антигена вируса бешенства в патологоанатомических пробах — это быстрый иммунодиагностический тест (RIDT), полезный метод диагностики бешенства без необходимости в лабораторном оборудовании. Этот иммунохроматографический тест с полосками с боковым потоком представляет собой одноэтапный тест, который обеспечивает недорогую и быструю идентификацию вирусного антигена.Вкратце, обработанный подозрительный материал добавляется в тестовое устройство, и конъюгированные детекторные антитела, прикрепленные к двум разным зонам на мембране, указывают на присутствие вирусного антигена [47]. Другой тест для обнаружения антигена вируса бешенства, использующий тот же принцип, был разработан с использованием комбинации очищенных поликлональных и моноклональных антител и оценен с использованием образцов слюны собак [48]. Простой и быстрый иммунохроматографический тестовый набор для диагностики бешенства, разработанный с использованием моноклональных антител, распознающих эпитоп II и III нуклеопротеина вируса бешенства, также был оценен как быстрый скрининговый тест на бешенство [49].Улучшенная версия того же самого была недавно разработана для диагностики бешенства у животных и человека и признана надежным, удобным, быстрым и надежным тестом для использования в лабораториях со скромной инфраструктурой. Хотя этот тест показал высокую чувствительность, он имел низкую специфичность для образцов человеческого мозга и, следовательно, не подходил для диагностики человеческого бешенства [50]. Хотя тесты, основанные на иммунохроматографических методах, могут использоваться в качестве быстрого скринингового теста на животных, они должны пройти значительное улучшение и оценку на клинических образцах людей, прежде чем их можно будет рекомендовать для использования в диагностике человеческого бешенства.

4.1.4. Другие анализы обнаружения антигена

Простой, надежный и быстрый сэндвич-ELISA (WELYSSA) можно использовать для обнаружения Lyssaviruses , принадлежащих ко всем семи генотипам, циркулирующим в Европе, Африке, Азии и Океании [51, 52]. Другие тесты для обнаружения антигена вируса бешенства включают иммуноферментный анализ тканей мозга [53] и иммуноферментный анализ для быстрой диагностики бешенства у людей и животных [54].

Колориметрические ферменты, используемые при обнаружении антигена вируса бешенства, обычно связываются с антителом химическим путем с использованием перекрестно-сшивающих реагентов, что может привести к получению гетерогенных конъюгатов, иногда со сниженной активностью и специфичностью.Химерные бифункциональные молекулы, в которых вариабельные домены антитела связаны с неродственными белковыми индикаторами с помощью генной инженерии, могут помочь обойти эту проблему. Недавнее исследование описало успешное производство бифункционального химерного белка на основе слитого с щелочной фосфатазой фрагмента гликопротеина scFv вируса бешенства. Было обнаружено, что это новый инструмент in vitro для обнаружения антигена вируса бешенства в мазках мозга [55].

4.2. Методы обнаружения нуклеиновых кислот

Методы амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот в последние годы произвели революцию в диагностике бешенства и играют важную роль в прижизненной диагностике бешенства у людей.В настоящее время несколько анализов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) были оценены в качестве дополнения к обычным тестам для предубойной и посмертной диагностики бешенства. Большинство анализов нацелены на высококонсервативный ген нуклеопротеина вируса бешенства для амплификации.

4.2.1. ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

Описано несколько традиционных анализов ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на основе геля с вложенными / геминированными протоколами для обнаружения РНК вируса бешенства в клинических образцах [12, 56–60].Ампликоны, полученные в этих анализах, можно секвенировать для дальнейшей характеристики вируса и филогенетического анализа. Однако основным недостатком этих анализов является риск перекрестного заражения, что исключает их рутинное использование для диагностики бешенства людей и животных.

4.2.2. ПЦР в реальном времени

Анализы, основанные на ПЦР в реальном времени, позволяют обнаруживать и количественно определять копии генома, а благодаря тому, что эти анализы являются «закрытыми пробирками», достигается значительное снижение перекрестной контаминации.ПЦР в реальном времени с использованием химии SYBR Green была оценена на образцах слюны человека для прижизненной диагностики бешенства [61] и в качестве универсального анализа в реальном времени для обнаружения Lyssaviruses [62]. Хотя эти анализы многообещающие, для обеспечения специфичности требуется особая осторожность [63]. Однако ПЦР-анализы в реальном времени с использованием флуорогенных зондов TaqMan обеспечивают высокую специфичность из-за внутренней реакции гибридизации [39, 63–66], имеют широкий диапазон обнаружения и в 10–1000 раз более чувствительны, чем традиционные вложенные RT. -PCR [63, 64].В недавнем исследовании TaqMan-ПЦР в реальном времени на вирусную РНК дала положительный результат в 5/11 (45,4%) образцах спинномозговой жидкости, 6/10 (60%) биопсиях затылочной кожи и 6/7 (85,7%) образцах слюны, полученных перед смертью. от пациентов с клиническим подозрением на бешенство. По крайней мере, один клинический образец (спинномозговая жидкость / кожа / слюна) был положительным с помощью TaqMan PCR в реальном времени у 11 из 13 (84,6%) пациентов; В сочетании с обнаружением нейтрализующих вирусов бешенства антител в спинномозговой жидкости прижизненный диагноз бешенства может быть достигнут во всех 13 (100%) случаях [39].

Несмотря на ряд преимуществ, вирусная генетическая гетерогенность может оказаться препятствием для разработки ПЦР на основе зонда TaqMan, поскольку несоответствие между мишенью и зондом может привести к ложноотрицательным результатам или снижению чувствительности [64, 65].Однако несовпадения на сайтах связывания праймера и / или зонда не влияли на амплификацию или детекцию в нескольких других исследованиях [66].

Другие молекулярные анализы . В методе амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) используются три фермента для создания множественных копий РНК в изотермических условиях. Автоматизированный NASBA позволяет легко и быстро тестировать образцы и, как сообщается, имеет более высокую чувствительность, чем обычные ПЦР-тесты для обнаружения РНК вируса бешенства в прижизненной слюне и образцах спинномозговой жидкости [67].Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — это альтернативный метод амплификации ДНК с высокой специфичностью и эффективностью без необходимости термоциклирования, который использовался для диагностики бешенства [68, 69]. Поскольку этот метод не имеет технологических требований к термоциклированию, используемому в ОТ-ПЦР, его можно использовать для разработки протоколов наблюдения, где тестирование может проводиться в полевых условиях или в менее сложных лабораториях [32].

Тесты на обнаружение нуклеиновых кислот могут выполняться на различных биологических образцах, таких как спинномозговая жидкость, слюна, слезы, моча, биопсия кожи, извлеченные волосяные фолликулы и ткань мозга для прижизненной и посмертной диагностики человеческого бешенства.Эти анализы оказались полезными для диагностики бешенства в разложенных и архивных образцах [39, 70–72] и играют важную роль в ретроспективной диагностике и эпидемиологических исследованиях. Поскольку инфекция бешенства может быть передана при трансплантации органов, молекулярные анализы также могут быть полезны для тестирования доноров, подверженных риску заражения бешенством. ПЦР в реальном времени также может использоваться для количественного определения вирусной РНК для оценки вирусной нагрузки, прогрессирования заболевания и эффективности экспериментальных терапевтических подходов [63, 73] и может быть ценным, поскольку в будущем будут изучаться новые варианты лечения бешенства.

Однако основным ограничением этих анализов является необходимость строгих мер контроля качества, чтобы избежать ложноположительных результатов, а также отсутствие международных стандартов и универсальных протоколов, которые должны использоваться для диагностики. В настоящее время молекулярные анализы не рекомендуются для рутинной патологоанатомической диагностики бешенства; при наличии ткани головного мозга следует провести FAT. Однако их можно использовать для прижизненной диагностики человеческого бешенства и для эпидемиологических исследований в лабораториях со строгими процедурами контроля качества и с опытом и знаниями в использовании таких методов [1].

4.3. Демонстрация антител

Хотя RFFIT считается золотым стандартом для оценки антител, нейтрализующих вирус бешенства, он имеет несколько недостатков, как упоминалось ранее. Райт и др. исследовали нейтрализацию антителом Lyssaviruses с использованием лентивирусных псевдотипов. Псевдотипы, представляющие собой вирусы, несущие геном и ядро ​​одного вируса и оболочку другого, являются более безопасной альтернативой тестам нейтрализации живых вирусов и могут использоваться для исследований по надзору за бешенством [74].

Методы, основанные на иммуноферментном анализе (ELISA), используются в качестве альтернативы RFFIT. Хотя они представляют собой только тесты связывания антигена, а не функциональные тесты, которые могут обнаруживать нейтрализующие антитела, в отличие от RFFIT, они являются простой, легкой, безопасной и быстрой альтернативой RFFIT. Анализы, которые не требуют наличия живых вирусов и помещений с высокой степенью сдерживания и дают быстрые результаты, были валидированы и хорошо коррелируют с RFFIT [75, 76]. ELISA, основанный на моноклональных антителах к нуклеопротеину (N) и гликопротеину (G) бешенства, был разработан для выявления бешеных иммунных комплексов в образцах спинномозговой жидкости для быстрой предубойной диагностики человеческого бешенства [77].ELISA второго поколения (Platelia Rabies II), разработанный для обнаружения гликопротеиновых антител в образцах человеческой сыворотки и спинномозговой жидкости, прошел многоцентровую оценку. Было обнаружено, что он хорошо коррелирует с RFFIT и может использоваться в лабораториях, в которых нет оборудования для культивирования вирусов и клеток [78]. Несмотря на ряд преимуществ, тесты ELISA, как сообщается, имеют более низкую чувствительность, чем тесты нейтрализации [79–81]. Новый метод ELISA, использующий электрохемилюминесценцию для обнаружения антител к гликопротеинам бешенства в сыворотке крови человека и животных, продемонстрировал более высокую чувствительность, чем традиционные методы ELISA [41].Тест быстрого обнаружения нейтрализующих антител (RAPINA), разработанный с использованием принципа иммунохроматографии, оказался простым и быстрым методом качественного и полуколичественного определения нейтрализующих антител против бешенства у людей и собак [82]. Также был описан простой и быстрый тест латексной агглютинации для обнаружения антирабических антител [83].

Последние достижения в области генной инженерии привели к дальнейшему совершенствованию анализов на основе ELISA. Недавно был разработан новый двойной сэндвич-ELISA с использованием препарата рекомбинантного антигена для обнаружения антител у собак и других видов [84].Nimmagadda et al. впервые описали использование рекомбинантного диатела при разработке ELISA для количественной оценки содержания гликопротеина вируса бешенства в вакцинах против бешенства человека, включающих штамм PV вируса бешенства, и его сравнение с тестом защиты мышей NIH [85]. Анализы, разработанные с использованием этой технологии, могут иметь многообещающее применение в диагностике бешенства в будущем.

4.4. Протеомика и метаболомика

В недавнем исследовании сообщалось о количественном протеомном анализе тканей мозга человека, полученных при вскрытии подтвержденных случаев энцефалитического и паралитического бешенства, для выявления сигнатурных белков, которые дифференцированно регулируются с помощью масс-спектрометрии с высоким разрешением.Некоторые белки экспрессировались по-разному, в том числе кариоферин альфа 4 (KPNA4), сверхэкспрессируемый только при паралитическом бешенстве, кальций-кальмодулинзависимая киназа 2 альфа (CAMK2A), которая активировалась при паралитическом бешенстве, и глутаматаммиачная лигаза (GLUL), которая чрезмерно экспрессировалась как при паралитическом, так и при паралитическом бешенстве. энцефалитное бешенство. Эти молекулы необходимо дополнительно исследовать в жидкостях организма, таких как спинномозговая жидкость, в более широкой когорте случаев бешенства, чтобы определить их возможное использование в качестве предубойных диагностических биомаркеров при бешенстве [86].Другое недавнее исследование метаболомики спинномозговой жидкости людей, лечившихся от бешенства, с использованием спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса ( ¹ HNMR) выявило несколько метаболитов, которые отличали выживших от бешенства от тех, кто впоследствии умер [87]. Дальнейшие исследования метаболомики бешенства могут дать новое понимание диагностической и прогностической значимости этих тестов и механизмов патогенеза бешенства, которые могут служить ориентиром для будущих терапевтических вмешательств при бешенстве.

5.Выводы

Бешенство по-прежнему остается одной из самых запущенных зоонозных болезней во всем мире. Низкий уровень приверженности борьбе с бешенством частично объясняется отсутствием точных и обширных данных эпиднадзора, указывающих на бремя болезни, частой ошибочной диагностикой бешенства и отсутствием межотраслевой координации. Традиционные методы прижизненной и посмертной диагностики бешенства имеют ряд ограничений. Хотя бешенство почти всегда заканчивается смертельным исходом, в последние годы было зарегистрировано несколько выживших людей.Следовательно, раннее, прижизненное лабораторное подтверждение бешенства дает клиницистам стимул к попыткам экспериментальных терапевтических подходов, особенно у пациентов с паралитическим бешенством, которые могут иметь более длительную выживаемость. Последние достижения в диагностических методах, включая молекулярные, дополняют традиционные диагностические подходы и могут произвести революцию в диагностике бешенства. Хотя финансовые и логистические барьеры могут помешать рутинному использованию молекулярных диагностических тестов, соотношение затрат и выгод все же следует измерять.Быстрое сокращение времени обработки и стоимости этих тестов указывает на то, что в ближайшем будущем они станут жизнеспособной технологией в диагностических и справочных лабораториях во всем мире [32, 88].

Список литературы

1. Всемирная организация здравоохранения. Консультация экспертов ВОЗ по бешенству. Второй отчет. Серия технических отчетов Всемирной организации здравоохранения . 2013; (982)

2. Кнобель Д.Л., Кливленд С., Колман П.Г. и др. Переоценка бремени бешенства в Африке и Азии. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения .2005. 83 (5): 360–368. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Streicker DG, Recuenco S, Valderrama W. и др. Экологические и антропогенные факторы воздействия бешенства у летучих мышей-вампиров: последствия для передачи и борьбы. Труды Королевского общества B . 2012. 279 (1742): 3384–3392. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Malerczyk C, DeTora L, Gniel D. Завозные случаи заражения людей бешенством в Европе, США и Японии, с 1990 по 2010 год. Journal of Travel Medicine .2011. 18 (6): 402–407. [PubMed] [Google Scholar] 5. Блэнтон Дж. Д., Палмер Д., Дайер Дж., Рупрехт CE. Эпиднадзор за бешенством в США в 2010 г. Журнал Американской ветеринарной медицинской ассоциации . 2011. 239 (6): 773–783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Коулман П.Г., Февр Е.М., Кливленд С. Оценка воздействия бешенства на здоровье населения. Возникающие инфекционные заболевания . 2004. 10 (1): 140–142. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Лембо Т., Незгода М, Веласко-Вилла А, Кливленд С., Эрнест Э., Рупрехт CE.Оценка прямого быстрого иммуногистохимического теста для диагностики бешенства. Возникающие инфекционные заболевания . 2006. 12 (2): 310–313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Хемачудха Т., Вачараплуесади С., Митрабхакди Э, Уайлд Х., Моримото К., Льюис Р.А. Патофизиология паралитического бешенства человека. Журнал нейровирологии . 2005. 11 (1): 93–100. [PubMed] [Google Scholar] 9. Гадре Г., Сатишчандра П., Махадеван А. и др. Вирусный энцефалит бешенства: клинические детерминанты в диагностике с особым акцентом на паралитическую форму. Журнал неврологии, нейрохирургии и психиатрии . 2010. 81 (7): 812–820. [PubMed] [Google Scholar] 10. Удават Х., Чаудхари Х.Р., Гоял Р.К., Чаудхари В.К., Матур Р. Синдром Гийена-Барре после вакцинации против бешенства семпл — отчет о шести случаях. Журнал ассоциации врачей Индии . 2001; 49: 384–385. [PubMed] [Google Scholar] 11. Шейх К.А., Рамос-Альварес М., Джексон А.С., Ли С.Й., Эсбери А.К., Гриффин Дж.В. Перекрытие патологии при паралитическом бешенстве и аксональном синдроме Гийена-Барре. Анналы неврологии . 2005. 57 (5): 768–772. [PubMed] [Google Scholar] 12. Coertse J, Weyer J, Nel LH, Markotter W. Улучшенные методы ПЦР для обнаружения африканского бешенства и лиссавирусов, связанных с бешенством. Журнал клинической микробиологии . 2010. 48 (11): 3949–3955. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Srinivasan A, Burton EC, Kuehnert MJ, et al. Передача вируса бешенства от донора органов четырем реципиентам трансплантата. Медицинский журнал Новой Англии .2005. 352 (11): 1103–1111. [PubMed] [Google Scholar] 14. Hellenbrand W, Meyer C, Rasch G, Steffens I, Ammon A. Случаи бешенства в Германии после трансплантации органов. Евро наблюдения . 2005; 10 (2) E050224.6 [PubMed] [Google Scholar] 15. Вора Н.М., Басавараджу С.В., Фельдман К.А. и др. Группа по расследованию передачи вируса бешенства, связанного с трансплантатом. Передача варианта вируса бешенства енотов при трансплантации твердых органов. Журнал Американской медицинской ассоциации . 2013. 310 (4): 398–407.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Уиллоуби Р. Э. младший, Тивз К. С., Хоффман Г. М. и др. Выживаемость после лечения бешенства с введением в кому. Медицинский журнал Новой Англии . 2005. 352 (24): 2508–2514. [PubMed] [Google Scholar] 17. Соломон Т., Марстон Д., Маллева М. и др. Урок недели: паралитическое бешенство после двухнедельного отпуска в Индии. Британский медицинский журнал . 2005. 331 (7515): 501–503. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Меслин Ф.Х., Копровский Х., Каплан М.М., редакторы. Лабораторные методы лечения бешенства . 4-е издание. Женева, Швейцария: Всемирная организация здравоохранения; 1996. [Google Scholar] 20. Гольдвассер Р.А., Кисслинг Р.Э. Окрашивание флуоресцентными антителами уличных и фиксированных антигенов вируса бешенства. Труды Общества экспериментальной биологии и медицины . 1958. 98 (2): 219–223. [PubMed] [Google Scholar] 21. Дин DJ, Аблесет М.К., Атанасиу П. Тест флуоресцентных антител. В: Меслин Ф.-Х, Каплан М.М., Копровский Х., ред. Лабораторные методы лечения бешенства .4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 88–96. [Google Scholar] 22. Уорнер К.К., Уитфилд С.Г., Фекаду М., Хо Х. Процедуры воспроизводимого обнаружения мРНК и генома антигена вируса бешенства in situ в фиксированных формалином тканях. Журнал вирусологических методов . 1997. 67 (1): 5–12. [PubMed] [Google Scholar] 23. Баррат Дж. Экспериментальная диагностика бешенства. Адаптация к полевым и тропическим условиям. Материалы Международной конференции по эпидемиологии, контролю и профилактике бешенства в восточной и южной частях Африки; Июнь 1992 г .; Лусака, Замбия.С. 72–83. [Google Scholar] 24. Мадхусудана С.Н. Бешенство . Гургаон, Индия: Macmillan Medical Communications; 2011. [Google Scholar] 25. Mathuranayagam D, Rao PV. Прижизненная диагностика бешенства человека по мазкам-слепкам роговицы иммунофлуоресцентным методом. Индийский журнал медицинских исследований . 1984. 79: 463–467. [PubMed] [Google Scholar] 26. Perrin P, Rollin PE, Sureau P. Быстрая иммуноферментная диагностика бешенства (RREID): полезный и простой метод рутинной диагностики бешенства. Журнал биологической стандартизации . 1986. 14 (3): 217–222. [PubMed] [Google Scholar] 27. Саксена С.Н., Мадхусудана С.Н., Трипати К.К., Гупта П., Ахуджа С. Оценка нового метода быстрой иммунодиагностики бешенства. Индийский журнал медицинских исследований A . 1989. 89: 445–448. [PubMed] [Google Scholar] 28. Миранда Н.Л., Роблес К.Г. Сравнительная оценка нового иммуноферментного теста (RREID) с используемыми в настоящее время диагностическими тестами (DME и FAT) для собачьего бешенства. Журнал тропической медицины и общественного здравоохранения Юго-Восточной Азии .1991. 22 (1): 46–50. [PubMed] [Google Scholar] 29. Копровский Х. Тест на прививку мышей. В: Meslin FX, Kaplan MM, Koprowsky H, ред. Лабораторные методы лечения бешенства . 4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 80–87. [Google Scholar] 30. Вебстер WA, Кейси GA. Выделение вируса в культуре клеток нейробластомы. В: Meslin FX, Kaplan MM, Koprowsky H, ред. Лабораторные методы лечения бешенства . 4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 96–104. [Google Scholar] 31.Мадхусудана С. Н., Сундарамурти С., Уллас П. Т.. Использование линии клеток эмбриональной почки человека HEK-293 для быстрого выделения фиксированных и уличных вирусов бешенства: сравнение с клеточными линиями Neuro-2a и BHK-21. Международный журнал инфекционных болезней . 2010; 14 (12): e1067 – e1071. [PubMed] [Google Scholar] 32. Фукс А.Р., Джонсон Н., Фрейлинг С.М. и др. Новые технологии обнаружения вируса бешенства: вызовы и надежды в 21 веке. PLoS Забытые тропические болезни .2009; 3 (9, статья E530) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Вебстер Л.Т., Доусон Р. Ранняя диагностика бешенства с помощью прививки мышей: измерение гуморального иммунитета к бешенству с помощью теста защиты мышей. Труды Общества экспериментальной биологии и медицины . 1935. 32: 570–573. [Google Scholar] 34. Атанасиу П. Количественный анализ и проверка активности сыворотки против бешенства и иммуноглобулина. В кн .: Каплан М.М., Копровский Х., ред. Лабораторные методы лечения бешенства . 3-е издание.Женева, Швейцария: ВОЗ; 1973. С. 314–318. [Google Scholar] 35. Смит Дж. С., Ягер П. А., Баер Г. М.. Быстрый воспроизводимый тест для определения антител, нейтрализующих бешенство. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения . 1973; 48 (5): 535–541. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Смит Дж. С., Ягер П. А., Баер Г. М.. Быстрый тест ингибирования флюоресцентного фокуса (RFFIT) для определения антител, нейтрализующих вирус бешенства. В: Meslin FX, Kaplan MM, Koprowsky H, ред. Лабораторные методы лечения бешенства .4-е издание. Женева, Швейцария: ВОЗ; 1996. С. 181–191. [Google Scholar] 37. Клике Ф., Обер М., Санье Л. Разработка теста нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (тест FAVN) для количественного определения антител, нейтрализующих бешенство. Журнал иммунологических методов . 1998. 212 (1): 79–87. [PubMed] [Google Scholar] 38. Хостник П. Модификация теста нейтрализации флуоресцентных антител (FAVN) для выявления антител к вирусу бешенства. Журнал ветеринарной медицины, серия B .2000. 47 (6): 423–427. [PubMed] [Google Scholar] 39. Мани Р.С., Мадхусудана С.Н., Махадеван А., Редди В., Беллуди А.Ю., Шанкар С.К. Утилита Taqman PCR в реальном времени для прижизненной и патологоанатомической диагностики человеческого бешенства. Журнал медицинской вирусологии . 2013 [PubMed] [Google Scholar] 40. Хантер М., Джонсон Н., Хеддервик С. и др. Иммуновирологические корреляты у людей, леченных бешенством в терапевтической коме. Журнал медицинской вирусологии . 2010. 82 (7): 1255–1265. [PubMed] [Google Scholar] 41. Ma X, Niezgoda M, Blanton JD, Recuenco S, Rupprecht CE.Оценка нового серологического метода выявления антител к вирусу бешенства после вакцинации. Вакцина . 2012. 30 (36): 5358–5362. [PubMed] [Google Scholar] 42. Neizgoda M, Rupprecht CE. Стандартная рабочая процедура прямого быстрого иммуногистохимического теста для обнаружения антигена вируса бешенства . Атланта: курс национальной сети лабораторной подготовки; Министерство здравоохранения и социальных служб США; Центры по контролю и профилактике заболеваний; 2006. [Google Scholar] 43.Мадхусудана С.Н., Субха С., Танкаппан У., Ашвин Ю.Б. Оценка прямого быстрого иммуногистохимического теста (dRIT) для быстрой диагностики бешенства у животных и людей. Virologica Sinica . 2012. 27 (5): 299–302. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Дюрр С., Наиссенгар С., Миндекем Р. и др. Диагностика бешенства для развивающихся стран. PLoS Забытые тропические болезни . 2008; 2 (3, статья e206) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45. Тао X-Y, Niezgoda M, Du J-L и др.Основное применение прямого экспресс-иммуногистохимического теста для диагностики бешенства в Китае. Чжунхуа Ши Ян Хэ Линь Чуанг Бин Ду Сюэ За Чжи . 2008. 22 (3): 168–170. [PubMed] [Google Scholar] 46. Дайер Дж. Л., Незгода М., Орчиари Л. А., Ягер П. А., Эллисон Дж. А., Рупрехт CE. Оценка непрямого экспресс-иммуногистохимического теста для дифференциации вариантов вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 2013; 190 (1-2): 29–33. [PubMed] [Google Scholar] 47. Кан Б, О Дж, Ли С. и др.Оценка набора для экспресс-иммунодиагностики вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 2007. 145 (1): 30–36. [PubMed] [Google Scholar] 48. Kasempimolporn S, Saengseesom W, Huadsakul S, Boonchang S, Sitprija V. Оценка экспресс-иммунохроматографической тест-полоски для обнаружения вируса бешенства в образцах слюны собак. Журнал ветеринарных диагностических исследований . 2011. 23 (6): 1197–1201. [PubMed] [Google Scholar] 49. Нишизоно А., Хавплод П., Ахмед К. и др. Простой и быстрый иммунохроматографический тест-набор для диагностики бешенства. Микробиология и иммунология . 2008. 52 (4): 243–249. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 50. Ахмед К., Вималаратне О., Дахал Н. и др. Оценка иммунохроматографического экспресс-теста на основе моноклональных антител для прямого обнаружения вируса бешенства в головном мозге людей и животных. Американский журнал тропической медицины и гигиены . 2012. 86 (4): 736–740. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 51. Сюй Г., Вебер П., Ху К. и др. Простой сэндвич-ELISA (WELYSSA) для обнаружения нуклеокапсида лиссавируса в образцах с подозрением на бешенство с использованием мышиных моноклональных антител. Биологические препараты . 2007. 35 (4): 297–302. [PubMed] [Google Scholar] 52. Сюй Г., Вебер П., Ху К. и др. WELYSSA: простой инструмент, использующий моноклональные антитела мыши для обнаружения нуклеокапсида лиссавируса в образцах с подозрением на бешенство. Разработки в области биологии . 2008. 131: 555–561. [PubMed] [Google Scholar] 53. Мадхусудана С.Н., Пол JPV, Абхилаш В.К., Суджа М.С. Быстрая диагностика бешенства у людей и животных с помощью иммуноферментного дот-блоттинга. Международный журнал инфекционных болезней .2004. 8 (6): 339–345. [PubMed] [Google Scholar] 54. Васант Дж. П., Мадхусудана С. Н., Абхилаш К. В., Суджа М. С., Мухамуда К. Разработка и оценка иммуноферментного анализа для быстрой диагностики бешенства у людей и животных. Индийский журнал патологии и микробиологии . 2004. 47 (4): 574–578. [PubMed] [Google Scholar] 55. Mousli M, Turki I, Kharmachi H, Dellagi K. Генетически сконструированный колориметрический гибридный белок с одноцепочечным антителом для быстрой диагностики вируса бешенства. Разработки в области биологии .2008. 131: 483–491. [PubMed] [Google Scholar] 56. Crepin P, Audry L, Rotivel Y, Gacoin A, Caroff C, Bourhy H. Интравитамная диагностика человеческого бешенства с помощью ПЦР с использованием слюны и спинномозговой жидкости. Журнал клинической микробиологии . 1998. 36 (4): 1117–1121. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Даше Л., Рейнс Дж. М., Бучи П. и др. Надежный диагноз человеческого бешенства на основе анализа биоптатов кожи. Клинические инфекционные болезни . 2008. 47 (11): 1410–1417. [PubMed] [Google Scholar] 58.Надин-Дэвис С.А. Протоколы полимеразной цепной реакции для распознавания вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 1998. 75 (1): 1–8. [PubMed] [Google Scholar] 59. Маседо К.И., Карниели П., младший, Брандао П.Е. и др. Диагностика случаев бешенства у людей методом полимеразной цепной реакции образцов кожи шеи. Бразильский журнал инфекционных заболеваний . 2006. 10 (5): 341–345. [PubMed] [Google Scholar] 60. Бисвал М., Ратхо Р.К., Мишра Б. Роль полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы в диагностике бешенства человека. Индийский журнал медицинских исследований . 2012. 135 (6): 837–842. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 61. Нагарадж Т., Васант Дж. П., Десаи А., Камат А., Мадхусудана С. Н., Рави В. Предубойная диагностика человеческого бешенства с использованием образцов слюны: сравнение методов RT-PCR в реальном времени и традиционных. Журнал клинической вирусологии . 2006. 36 (1): 17–23. [PubMed] [Google Scholar] 62. Hayman DTS, Banyard AC, Wakeley PR и др. Универсальный анализ в реальном времени для обнаружения лиссавирусов. Журнал вирусологических методов . 2011; 177 (1): 87–93. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 63. Надин-Дэвис С.А., Шин М., Ванделер А.И. Разработка методов полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы в реальном времени для диагностики бешенства человека. Журнал медицинской вирусологии . 2009. 81 (8): 1484–1497. [PubMed] [Google Scholar] 64. Уэйкли П.Р., Джонсон Н., Макэлхинни Л.М., Марстон Д., Сойер Дж., Фукс А.Р. Разработка анализа обратной транскрипции TaqMan-ПЦР в реальном времени для обнаружения и дифференциации генотипов лиссавируса 1, 5 и 6. Журнал клинической микробиологии . 2005. 43 (6): 2786–2792. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. Hughes GJ, Smith JS, Hanlon CA, Rupprecht CE. Оценка анализа TaqMan PCR для обнаружения РНК вируса бешенства: влияние вариации последовательности и применение для количественной оценки вирусной нагрузки. Журнал клинической микробиологии . 2004. 42 (1): 299–306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Wacharapluesadee S, Sutipanya J, Damrongwatanapokin S, et al. Разработка TaqMan анализа RT-PCR в реальном времени для обнаружения вируса бешенства. Журнал вирусологических методов . 2008. 151 (2): 317–320. [PubMed] [Google Scholar] 67. Wacharapluesadee S, Hemachudha T. Амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот в быстрой диагностике бешенства. Ланцет . 2001. 358 (9285): 892–893. [PubMed] [Google Scholar] 68. Мулея В., Намангала Б., Мвине А. и др. Молекулярная эпидемиология и метод петлевой изотермической амплификации для диагностики инфекции вирусом бешенства в Замбии. Исследование вирусов . 2012. 163 (1): 160–168.[PubMed] [Google Scholar] 69. Болдбаатар Б., Иноуэ С., Сугиура Н. и др. Быстрое обнаружение вируса бешенства с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией. Японский журнал инфекционных болезней . 2009. 62 (3): 187–191. [PubMed] [Google Scholar] 70. Араужо Д.Б., Лангони Х., Алмейда М.Ф., Мегид Дж. Геминизированная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (hnRT-PCR) как инструмент для обнаружения вируса бешенства в хранимых и разложенных образцах. BMC Research Notes . 2008; 1, статья 17 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 71.Дэвид Д., Якобсон Б., Ротенберг Д., Дверес Н., Дэвидсон И., Страм Ю. Обнаружение вируса бешенства с помощью ОТ-ПЦР в разложенном, естественно инфицированном мозге. Ветеринарная микробиология . 2002. 87 (2): 111–118. [PubMed] [Google Scholar] 72. Джонсон Н., Фукс А.Р. Архивное исследование финского изолята от вспышки бешенства 1988/89 гг. Архив вирусологии . 2005. 150 (7): 1407–1414. [PubMed] [Google Scholar] 73. Майер Т., Швартинг А., Мауэр Д. и др. Ведение и результаты после нескольких трансплантаций роговицы и твердых органов от донора, инфицированного вирусом бешенства. Клинические инфекционные болезни . 2010. 50 (8): 1112–1119. [PubMed] [Google Scholar] 74. Райт Э., Темпертон, штат Нью-Джерси, Марстон Д.А., Макэлхинни Л.М., Фукс А.Р., Вайс Р.А. Изучение нейтрализации лиссавирусов антителами с использованием лентивирусных псевдотипов: межвидовое сравнение. Журнал общей вирусологии . 2008. 89 (9): 2204–2213. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Серват А, Фейссаге М., Бланшар I и др. Количественный непрямой ИФА для мониторинга эффективности вакцинации против бешенства домашних и диких плотоядных животных. Журнал иммунологических методов . 2007. 318 (1-2): 1–10. [PubMed] [Google Scholar] 76. Мухамуда К., Мадхусудана С.Н., Рави В. Разработка и оценка конкурентного ИФА для оценки нейтрализующих антител против бешенства после постконтактной вакцинации против бешенства у людей. Международный журнал инфекционных болезней . 2007. 11 (5): 441–445. [PubMed] [Google Scholar] 77. Мухамуда К., Мадхусудана С. Н., Рави В., Десаи А. Присутствие специфических для бешенства иммунных комплексов в спинномозговой жидкости может помочь в предубойной диагностике паралитического бешенства человека. Журнал клинической вирусологии . 2006. 37 (3): 162–167. [PubMed] [Google Scholar] 78. Фейсаге М., Даше Л., Одри Л. и др. Многоцентровое сравнительное исследование нового ELISA, PLATELIA ™ RABIES II, для обнаружения и титрования антител к гликопротеинам против бешенства и сравнения с быстрым тестом ингибирования флюоресцентного фокуса (RFFIT) на человеческих образцах от вакцинированных и невакцинированных людей. Вакцина . 2007. 25 (12): 2244–2251. [PubMed] [Google Scholar] 79. Кликет Ф., МакЭлхинни Л.М., Серват А. и др.Разработка качественного непрямого ИФА для измерения специфических антител к вирусу бешенства у вакцинированных собак и кошек. Журнал вирусологических методов . 2004. 117 (1): 1–8. [PubMed] [Google Scholar] 80. Серват А., Клике Ф. Совместное исследование по оценке нового теста ELISA для мониторинга эффективности вакцинации против бешенства у домашних хищников. Исследование вирусов . 2006. 120 (1-2): 17–27. [PubMed] [Google Scholar] 81. Уэлч Р.Дж., Андерсон Б.Л., Литвин К.М. Оценка двух коммерчески доступных ELISA и одной собственной референс-лаборатории ELISA для определения человеческих антител к вирусу бешенства. Журнал медицинской микробиологии . 2009. 58 (6): 806–810. [PubMed] [Google Scholar] 82. Нишизоно А., Ямада К., Хавплод П. и др. Оценка улучшенного теста быстрого обнаружения нейтрализующих антител (RAPINA) для качественного и полуколичественного обнаружения нейтрализующих антител против бешенства у людей и собак. Вакцина . 2012. 30 (26): 3891–3896. [PubMed] [Google Scholar] 83. Мадхусудана С.Н., Сарасвати С. Разработка и оценка теста латексной агглютинации на антитела к бешенству. Журнал клинической вирусологии .2003. 27 (2): 129–135. [PubMed] [Google Scholar] 84. Ян Л-М, Чжао Л-З, Ху Р-Л, Ши З-С, Лю В-Дж. Новый иммуноферментный сэндвич-анализ с двойным антигеном для измерения антител против вируса бешенства. Клиническая и вакцинная иммунология . 2006. 13 (8): 966–968. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85. Ниммагадда С.В., Аавула С.М., Бирадхар Н. и др. Иммуноферментный иммуносорбент на основе рекомбинантных диател для количественного определения гликопротеина вируса бешенства. Клиническая и вакцинная иммунология .2010. 17 (8): 1261–1268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 86. Венугопал А.К., Гантасала С.С., Сельван Л.Д. и др. Количественная протеомика для определения биомаркеров бешенства. Клиническая протеомика . 2013; 10 (1, статья 3) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 87. О’Салливан А., Уиллоуби Р. Э., Мищук Д. и др. Метаболомика спинномозговой жидкости людей, леченных от бешенства. Журнал протеомных исследований . 2013; 12 (1): 481–490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 88.Сильва С.Р., Кац И.С., Мори Э. и др. Достижения биотехнологии: взгляд на диагностику и исследование вируса бешенства. Биологические препараты . 2013. 41 (4): 217–223. [PubMed] [Google Scholar]

Как диагностируют бешенство

Если вас укусило животное с подозрением на бешенство, ему могут пройти тест для диагностики бешенства. Вам также следует позвонить в местные органы по контролю за животными, чтобы безопасно поймать дикое или потенциально бешеное животное.

© Verywell, 2018

Испытания на животных

По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), летучие мыши, скунсы, еноты и лисы, кусающие людей, должны быть как можно скорее подвергнуты эвтаназии и проверены.

Для проведения теста животное необходимо усыпить и взять образцы ткани из головного мозга. В Соединенных Штатах результаты теста на бешенство обычно готовы в течение 24-72 часов с момента умерщвления животного. (Сам тест занимает два часа, но образец необходимо отправить в диагностическую лабораторию.)

Не все животные, кусающие или царапающие человека, подвергаются эвтаназии и тестируются. За животными, которые считаются менее подверженными бешенству (например, за здоровыми вакцинированными домашними кошками или собаками), можно наблюдать в течение 10 дней.

Поскольку бешенство — это неотложная медицинская проблема и потенциально смертельная инфекция, ваш лечащий врач и местный или государственный департамент здравоохранения часто быстро решают, нужна ли вам вакцинация от бешенства, в зависимости от типа животного и воздействия, а также информации об инфекциях животных в вашем районе. площадь.

Лаборатории и тесты

Для тех, кто проявляет симптомы, но не диагностирован, ни один тест не считается достаточным для диагностики бешенства у живого человека, но в некоторых ситуациях могут быть выполнены следующие тесты.

Люмбальная пункция

В некоторых случаях медицинские работники проверяют спинномозговую жидкость человека. Это предполагает использование люмбальной пункции, также известной как спинномозговая пункция. С помощью специальной иглы медицинские работники могут извлечь небольшое количество спинномозговой жидкости (CSF) из позвоночного канала, а затем отправить этот образец в лабораторию для анализа.

Хотя их часто делают в больницах, иногда люмбальные проколы делают прямо в офисе врача.Общая процедура занимает около 15 минут.

После использования местного анестетика для обезболивания кожи врач вставит тонкую иглу в нижнюю часть поясничного отдела позвоночника. Чтобы освободить достаточно места для иглы, вас могут попросить наклониться вперед, обычно сидя или лежа на боку.

После завершения спинномозговой пункции вам следует полежать не менее часа, а следующие 24 часа провести в отдыхе и питье большого количества жидкости. Во многих случаях пациентам необходимо оставаться в больнице или в офисе поставщика медицинских услуг до четырех часов.

Хотя люди редко испытывают серьезные осложнения после спинномозговой пункции, вы можете почувствовать некоторую боль при введении иглы. Через несколько часов (а иногда и дней) после процедуры некоторые пациенты также испытывают головные боли, тошноту, учащенное сердцебиение и / или низкое кровяное давление.

Если у вас возникло кровотечение или признаки воспаления после спинномозговой пункции, немедленно обратитесь к врачу.

Биопсии кожи

Биопсия кожи — это еще один тип лабораторных тестов, которые иногда используются для диагностики бешенства.После обезболивания этой области с помощью местного анестетика врач возьмет небольшой образец кожи на затылке. В лаборатории аналитики проверят образец на наличие белков вируса бешенства.

Другие тесты

Медицинские работники могут искать антитела к вирусу бешенства в образцах вашей слюны и сыворотки (то есть в жидкой части крови, которая остается после коагуляции). Наличие антител указывает на инфекцию.

Руководство по обсуждению для поставщика медицинских услуг по бешенству

Получите наше руководство для печати на прием к следующему врачу, которое поможет вам задать правильные вопросы.

Отправить руководство по электронной почте

Отправить себе или любимому человеку.

Зарегистрироваться

Это руководство для обсуждения с доктором было отправлено на адрес {{form.email}}.

Произошла ошибка. Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Изображения

Определенные визуализационные тесты могут помочь в диагностике бешеного энцефалита (т. Е. Острого воспаления головного мозга в результате инфекции бешенства). Эти визуализационные тесты включают МРТ головы и компьютерную томографию головы.

МРТ головы

«МРТ» означает «магнитно-резонансная томография» — процедура, которая включает использование магнитов и радиоволн для создания подробных изображений вашего мозга и окружающих его нервных тканей.

Перед выполнением МРТ головы вам могут дать специальный краситель (так называемый «контрастный материал»), который поможет рентгенологу улучшить четкость изображения. Этот краситель обычно вводится внутривенно через руку или предплечье. Хотя краситель очень безопасен, у некоторых людей могут возникать аллергические реакции. Более того, самый распространенный тип красителя (гадолиний) может быть вредным для людей с проблемами почек.

Обычно МРТ головы проводится в больнице или радиологическом центре и длится от 30 до 60 минут.Процедура безболезненна и не требует времени на восстановление.

Во время МРТ вы будете лежать на узком столе, который затем вставляется в туннельный сканер. Если вы страдаете клаустрофобией или чувствуете дискомфорт в тесноте, сообщите об этом своему врачу, прежде чем делать МРТ головы. Лекарства могут помочь уменьшить беспокойство во время процедуры.

Вы также должны сообщить своему врачу, если у вас есть:

• зажимы для аневризмы головного мозга
• клапаны искусственного сердца
• дефибриллятор или кардиостимулятор сердца
• имплантаты внутреннего уха (кохлеарные)
• заболевание почек или диализ
• недавно установленный искусственный сустав
• стент кровеносного сосуда
• аллергия на йод , который используется в контрастном материале

Кроме того, обязательно сообщите своему врачу, работали ли вы в прошлом с листовым металлом.

Чтобы подготовиться к МРТ головы, вас, скорее всего, попросят ничего не есть и не пить в течение 4-6 часов. Однако вы можете вернуться к своей обычной диете, физической активности и приему лекарств сразу после теста.

КТ головы

При компьютерной томографии (КТ) головы рентгеновские лучи используются для создания изображений вашей головы. Как и МРТ головы, компьютерная томография головы проводится в больницах и радиологических центрах.

При прохождении компьютерной томографии головы вы будете лежать на узком столе, который скользит по центру компьютерного томографа.Пока вы находитесь внутри сканера, рентгеновский луч аппарата будет вращаться вокруг вас. Полное сканирование обычно занимает от 30 секунд до нескольких минут.

Как и в случае с некоторыми МРТ головы, некоторые исследования КТ требуют использования специального красителя, вводимого внутривенно через руку или предплечье. Перед приемом красителя сообщите своему врачу, если у вас проблемы с почками, или вы принимаете лекарство от диабета метформин.

Хотя КТ головы безболезненна, контрастное вещество может вызвать несколько побочных эффектов, в том числе:

• ощущение легкого жжения.
• металлический привкус во рту.
• теплая промывка кузова.

В редких случаях краситель может вызвать анафилаксию (опасный для жизни аллергический ответ). Если во время теста у вас возникнут проблемы с дыханием, немедленно сообщите об этом оператору сканера. Сообщите врачу, если на вашем теле есть какие-либо металлические предметы, и не входите в кабинет МРТ с металлическими предметами.

Дифференциальная диагностика

Если вас обследуют на предмет возможного бешенства, при постановке диагноза также могут быть учтены следующие условия:

Ваш лечащий врач будет использовать диагностические критерии для каждого из них, чтобы подтвердить или исключить диагноз.

Часто задаваемые вопросы

• Каковы симптомы бешенства у человека?

  Симптомы бешенства у людей включают боль или покалывание в месте укуса или царапины, утомляемость, головную боль, лихорадку, мышечные спазмы, раздражительность, спутанность сознания, паралич, слюноотделение, затрудненную речь, затрудненное глотание и двоение в глазах.

• Через сколько времени проявляются симптомы бешенства после укуса инфицированного животного?

  Симптомы бешенства могут проявляться через несколько дней, но обычно проявляются только через несколько недель или месяцев.Однако, как только инфекция становится симптоматической, ее трудно лечить, поэтому важно лечиться, если вы считаете, что могли заразиться бешенством.

Диагностика бешенства | Бешенство — Бюллетень

Даже при наличии признаков заболевания, весьма характерных для бешенства, таких как изменения в поведении или затруднения при глотании, клиническое наблюдение и осмотр не могут исключить бешенство или подтвердить диагноз и, следовательно, могут привести только к подозрению на бешенство.Таким образом, обнаружение вируса или некоторых его конкретных компонентов с помощью стандартных лабораторных тестов, рекомендованных ВОЗ и МЭБ, является единственным способом поставить надежный диагноз бешенства.

Ткань головного мозга является предпочтительным образцом для посмертной диагностики как у людей, так и у животных. Хотя внутрижизненная диагностика бешенства у животных настоятельно не рекомендуется, это единственный способ подтвердить наличие инфекции у пациента, у которого есть подозрение на это заболевание. Внутривитаминная диагностика у подозреваемых людей основана на обнаружении вируса или вирусной РНК в слюне, в образцах биопсии иннервируемой кожи или волосяных фолликулах.Однако из-за периодического выделения вируса в слюне и различной диагностической чувствительности применяемых методов достоверны только положительные результаты.

Обнаружение антигена бешенства

Наиболее широко используемый тест для первичной диагностики бешенства у животных и людей, флуоресцентный тест на антитела (FAT). Этот тест основан на обнаружении антигена и рекомендован ВОЗ и МЭБ в качестве золотого стандарта для диагностики бешенства. Мазки-слепки, полученные из составного образца ткани мозга, обрабатывают сывороткой против бешенства или глобулином, меченным флуоресцеинизотиоцианатом (FITC).Специфические агрегаты антигена вируса бешенства обнаруживают по их флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа в отраженном (падающем) свете. FAT является точным, чувствительным и быстрым, т.е. результаты часто можно получить в течение 1-2 часов после получения образца. В качестве альтернативы, особенно в тех случаях, когда флуоресцентная микроскопия недоступна, был разработан прямой экспресс-иммуногистохимический тест (dRIT) с такой же чувствительностью и специфичностью, что и FAT. Принцип аналогичен FAT, за исключением того, что dRIT использует окрашивание стрептавидин-биотинпероксидазой.

Устройства с боковым потоком (LFD) для быстрого обнаружения антигена вируса бешенства в полевых условиях были разработаны, однако лишь частично соответствуют ожиданиям с точки зрения тестовых характеристик (чувствительности и специфичности). По-прежнему требуется адекватная валидация в соответствии с международными стандартами, чтобы они могли быть полезны в ситуациях надзора, в которых отсутствуют ресурсы для использования рекомендованных тестов.

Обнаружение репликации вируса бешенства: инокуляционные тесты

Другая группа доступных методов направлена ​​на обнаружение репликации вируса на живых субстратах, например.грамм. клетки. Выделение вируса может быть необходимо для подтверждения неубедительных результатов по FAT / dRIT и для характеристики штамма вируса. В клетках нейробластомы вирус бешенства обычно растет без цитопатического эффекта; еще раз необходимо использовать FAT для подтверждения наличия вируса бешенства. После внутричерепного применения бешенство вызывает у мышей клинические признаки, которые являются относительно типичными, но должны быть подтверждены FAT. Поскольку клеточная культура так же чувствительна, как и тест на прививку мышей, в лабораториях должны быть созданы единицы для замены тестов на прививку мышей, поскольку они позволяют избежать использования живых животных, дешевле и дают более быстрые результаты.

Обнаружение РНК вируса бешенства

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскриптазой (RT) используется для амплификации определенного фрагмента вирусного генома (вирусной РНК). Совсем недавно была разработана ПЦР в реальном времени для повышения чувствительности и еще более быстрого получения результатов. Эти техники обладают высочайшим уровнем чувствительности

RT-PCR может использоваться в качестве подтверждающего теста и особенно полезен для диагностики in vitam у людей. Требуется стандартизация и очень строгий контроль качества.Поскольку ПЦР может давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты, ее следует использовать только в сочетании с другими традиционными методами.

Серологические тесты

Серологические тесты не подходят для диагностики инфекций бешенства у людей и животных, поскольку вирус-специфические антитела в сыворотке, как правило, появляются только относительно поздно после появления клинических признаков, если вообще появляются. В основном они используются для оценки иммунного ответа на вакцины против бешенства человека и животных.

Золотым стандартом является тест на нейтрализацию вирусов. Титры нейтрализующих вирусов антител напрямую соответствуют уровню защиты. Анализы нейтрализации вирусов также являются предписанными тестами для международной торговли и путешествий с домашними животными. И FAVN (тест нейтрализации флуоресцентных антител), и RFFIT (тест быстрого ингибирования флюоресцентного фокуса) одобрены для определения титра вируснейтрализующих антител.

ELISA

обеспечивает быстрый серологический тест, который позволяет избежать необходимости работать с живым вирусом бешенства.Эти тесты выявляют антитела, которые могут специфически связываться с антигенами вируса бешенства, в первую очередь с гликопротеином и нуклеопротеином вируса бешенства.

Для получения дополнительной информации см. План эпиднадзора за бешенством и Руководство МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных

.