Мастопатия представляет собой заболевание молочных желез, которое характеризуется различными изменениями в структуре тканей молочной железы, а также нарушениями тех или иных функций. Встречается у женщин в возрасте 35-45 лет, однако может наблюдаться и у молодых женщин репродуктивного возраста.

В настоящее время клиницисты выделяют следующие формы мастопатии:

1. Диффузная мастопатия, включающая в себя следующие варианты:
   • аденоз молочной железы и мезоплазия молочной железы;
   • фиброзная М.;
   • кистозная М.;
   • фиброзно-кистозная М.
2. Узловая мастопатия, включающая в себя два вида морфологических изменений:

Причины развития

Все точные механизмы развития мастопатии неизвестны, однако считается, что в основе патогенеза и изменения тканей железы лежит нарушение соотношения половых гормонов: эстрогенов и прогестерона. Низкая концентрация прогестерона и высокий уровень эстрогенов, воздействуя на рецепторный аппарат клеток молочных желез, приводит к следующей трансформации:

• эпителиальные клетки альвеол железы разрастаются в с увеличением объема тканей;
• активируется механизм увеличения массы соединительной ткани;
• увеличивается протоковой аппарат молочной желез.
• под действием повышенной концентрации пролактина усиливается функциональная активность молочных желез, увеличивается объем.

В результате этих изменений наблюдается задержка жидкости в тканях железы, усиление секреции и нарушение дренажной функции, что в конечном итоге формирует полостные структуры

Возникновению мастопатии способствуют следующие экзо- и эндогенные факторы:

• Ранее половое созревание.
• Различные органические заболевания репродуктивной системы.
• Заболевания эндокринной системы.
• Нарушения менструального цикла различного генеза.
• Отсутствие периода грудного вскармливания после родов (или же слишком кратковременное грудное вскармливание, сроком менее 3-х месяцев).
• Декомпенсированные заболевания организма.
• Стрессорные ситуации.
• Неблагоприятные условия внешней среды.
• Длительное использование внутриматочной контрацепции.
• Злоупотребление алкоголем.
• Курение.
• Наследственная предрасположенность.

Также стоит отметить, что основные нарушения со стороны баланса половых гормонов и пролактина могут быть при: 

• нарушениях со стороны гипоталамо-гипофизарной системы, 
• гипотиреозе, 
• синдроме поликистозных яичников, 
• нарушениях функции надпочечников, 
• тяжелых заболеваниях печени и почек,
•  вирусных инфекциях, 
• раннем климаксе. 

Кроме того, отмечено больший риск развития различных форм мастопатий у женщин, не имеющих регулярную половую жизнь, или же в ситуациях, когда половая жизнь не приносит удовлетворения, а также в случаях прерывания беременности, особенно на более поздних сроках, когда молочные железы находятся в состоянии изменения и подготовки к грудному вскармливанию.

Выступление онколога-маммолога С.М.Портного на телеканале «Россия 1» на тему рака груди и атером: лечение и профилактика болезни (маммография, УЗИ и самообследование).

Клиническая картина

Различные формы заболевания имеют те или иные специфические признаки, однако у большинства женщин, страдающих мастопатией, имеются общие признаки патологического процесса. Это – дискомфортные и болезненные ощущения в области молочных желез. Процесс может быть как односторонним, так и двухсторонним. Эти ощущения обычно усиливаются непосредственно перед менструацией. Пальпаторно можно ощутить физические изменения тканей железы – появление уплотнений диффузного характера или же очагов, имеющих плотную и твердую консистенцию.

Нередко заболевание протекает относительно скрыто, не имея выраженной клинической симптоматики. Поэтому и рекомендуются регулярные осмотры врачом-маммологом, не реже, чем 1 раз в год.

Диагностика различных форм мастопатий проводится следующим образом:

• Осмотр врача и пальпаторное исследование (рекомендуется выполнить сразу после менструации, обычно на 5-8 день цикла).
• Исследования гормонов крови.
• Ультразвуковая диагностика (является весьма информативной и не требует какой-либо подготовки). Также рекомендуется выполнять сразу после менструации.
• Маммография и другие рентгеновские исследования (выполняются только по назначениям врача, в Frau Klinik не проводятся).
• Цитологические исследование отделяемого из сосков молочных желез.
• Аспирационная биопсия патологических тканей молочной железы, выполняемая под УЗ контролем.

И весьма важное значение в раннем выявлении мастопатии, а также и других заболеваний имеет самообследование молочных желез.

• Онкомаммология

• Мастопатия

• Кистозные патологии

• Уплотнения, узлы

• Боли

Дополнительно

возможные причины, симптомы, методы диагностики и терапия

Ткани молочных желез регулярно подвергаются природным изменениям, которые обусловлены спецификой функционирования женской репродуктивной системы (телархе, беременностью, менархе, менопаузой, лактацией). Однако некоторые структурные видоизменения, происходящие в фиброзной (волокнистой) и железистой грудных тканях, могут быть патологическими и вызывать диффузные изменения молочных желез. Специалисты говорят о том, что подобные нарушения характерны для 45% женщин в репродуктивном периоде.

Причины данной патологии

Диффузные изменения молочных желез задевают:

• Паренхиму – главную функциональную железисто-эпителиальную грудную ткань с фибриллярными волокнами молочных протоков и альвеолами.
• Строму – волокнистую соединительную ткань, которая окружает протоки и делит дольки.
• Жировую ткань, защищающую паренхимую.

При увеличении количества тканевых клеток молочных желез или их уменьшении, а также при дисплазии (нарушение развития) можно говорить только о гормональном происхождении. Причины диффузных изменений молочных желез могут быть обусловлены:

Также следует учесть, что диффузные изменения молочных желез происходят и у здоровых женщин. Например, благодаря эстрогену обеспечивается развитие стромы, отложение клеток жира и рост протоков. Прогестерон при балансе эстрогенов позволяет расти железистой ткани и лобулярным структурам, способствует оформлению и альвеолярным секреторным изменениям. У женщин в репродуктивном возрасте при цикле менструаций (по завершении лютеиновой фазы) часть эпителиальных клеток альвеол и протоков молочных желез под влиянием прогестерона подвергается репликации и дальнейшему апоптозу (физиологическому естественному отмиранию). Однако повышенный уровень эстрогенов у женщин и недостаток прогестерона способны нарушить такой процесс и вызвать диффузно-фиброзное изменение.

При беременности плацентарный лактоген, хорионический гонадотропин и пролактин производят стимуляцию процесса секреции молока и лактации после родов. Если появляется гормональный дисбаланс, естественные процессы в женских грудных тканях нарушаются. Как отмечают врачи, чаще всего возникает патологическая пролиферация определенных клеток, они замещают другие. Такие тканевые структурные перестройки в маммологии определяются в качестве дисгормональных диффузных изменений молочных желез.

Об эстрогенах

Это собирательное название одной из групп женских половых гормонов. Они продуцируются в яичниках у женщин, в небольшом количестве образуются в яичках у мужчин, а также в печени и корковом веществе надпочечников (и мужчин, и женщин). Половые гормоны, в целом, обеспечивают репродуктивную функцию.

В организме женщины половые гормоны присутствуют всегда. Их уровень и соотношение зависит от периода ее жизни. Главные женские гормоны– эстрогены. У плода они отвечают за формирование гениталий по женскому типу, в детстве – поддерживают рост половых органов. В подростковом периоде количество эстрогенов в организме увеличивается. За счет их влияния формируются вторичные половые признаки.

Наибольший уровень эстрогенов отмечается у женщин репродуктивного возраста. В это время ее организм подвергается периодическим циклическим изменениям (менструальный цикл).

Симптомы изменений молочной железы

Самые первые симптомы подобных изменений могут проявляться в виде повышенного дискомфортного ощущения в груди, гиперчувствительности ее перед наступлением и во время критических дней. Многие женщины на это не обращают внимания, поскольку после завершения очередных менархе все неприятные признаки проходят.

Однако консультация маммолога не будет лишней.

Врачи называют такие самые характерные признаки диффузных изменений:

• Напряженность и тяжесть в молочных железах, которая зачастую сопровождается отечностью.
• Жжение молочной железы, зуд в зоне сосков, их повышенная чувствительность.
• Маленькие подвижные уплотнения в виде узелков в текстуре грудных тканей, которые могут сильнее ощущаться во время месячных.
• Различные по силе ноющие боли (интенсивные боли способны отдавать в зону лопаток, плеча или подмышки).
• Болезненность в области молочных желез.
• Выделения прозрачного цвета из сосков, если их сдавить.

Многие не чувствуют никаких признаков, из перечисленных выше, а уплотнение в груди случайно обнаруживается, так как проявления симптомов диффузных изменений молочных желез преимущественно периодические и обусловлены менструальным циклом.

Возможные осложнения

Могут быть такие осложнения, как образование разных по размеру доброкачественных опухолей. Самое опасное осложнение – это малигнизация данных опухолей.

Хотя у такой патологии доброкачественный характер, при наличии рака репродуктивной системы (молочных желез, яичников, матки) у кровных родственниц не исключены серьезные последствия, которые требуют медицинского вмешательства. В целом, при диффузных изменениях в молочной железе прогноз положительный. Однако нужно учесть возможность появления злокачественной опухоли, возникающей на фоне такой патологии гораздо чаще, чем тогда, когда она отсутствует.

Классификация форм диффузной мастопатии

В соответствии с клинико-рентгено-морфологическими тканевыми изменениями молочных желез, диффузные мастопатии классифицируются следующим образом:

• Аденоз — диффузная патология с преобладанием железистого компонента.
• Диффузная мастопатия, в которой преобладает компонент кистозный.
• Фиброаденоматоз – диффузная мастопатия, в которой преобладает фиброзный компонент.
• Склерозирующий тип аденоза.
• Фиброзно-кистозная смешанная форма мастопатии.

Когда определяют тот или другой клинический вариант, то исходят из пропорции жирового, железистого и соединительнотканного элементов на маммограммах.

Выделяют по степени присутствующих изменений незначительно выраженную, резко выраженную и умеренную диффузную мастопатию.

Диагностика диффузных изменений молочных желез

Диффузная мастопатия диагностируется на основании результатов исследования маммологом молочных желез, маммографического обследования, УЗИ, лабораторных анализов, биопсии и МРТ молочных желез.

При диффузной мастопатии внешние изменения молочных желез не определяются. При пальпаторном обследовании груди устанавливаются разные по величине и протяженности, болезненные, без четких границ уплотнения с дольчатой или зернистой поверхностью. При диффузной мастопатии уплотнения чаще всего размещаются в верхне-наружных квадрантах желез.

Стандартная эхографическая картина, определяемая с помощью УЗИ при диффузных изменениях молочных желез, отличается утолщением ткани железы, фиброзными переменами междольковых перегородок и протоков, изменением железистой эхоплотности, множественным формирование кист, несоответствием железистого типа строения возрасту, дуктэктазией.

Маммография (обзорная рентгенография) при диффузной мастопатии находит тканевую неоднородность желез с небольшими очагами уплотнения, плотной структурой или кистозными образованиями.

Благодаря маммографии можно исключить присутствие в железе опухолей и определить тип мастопатии.

Если есть выделения из сосков на фоне диффузной мастопатии, это может говорить о необходимости дуктографии, которая обычно определяет деформацию млечных протоков и кисты разной величины. Исследование мазка, полученного из соска, дает возможность дифференцировки диффузной мастопатии от прочих поражений – сифилиса, актиномикоза, туберкулеза молочных желез.

При сопутствующем генитальном и экстрагенитальном фоне назначаются анализ половых гормонов и гормонов щитовидной железы, ферментов печени, консультация эндокринолога-гинеколога, УЗИ малого таза.

Если данные предыдущей диагностики сомнительные, то проводят биопсию молочной железы, цитологический анализ биоптата, МРТ, определение в крови маркера СА 15 — 3.

Лечение патологии

Чтобы назначить курс терапии, требуется консультация маммолога.

При диффузной мастопатии назначается консервативное лечение и динамическое наблюдение. Советуют изменить пищевой рацион, включить в него больше молочных продуктов и растительной клетчатки, ограничить животные жиры. Если у пациентки есть кишечный дисбактериоз, который нарушает всасывание микроэлементов и витаминов, требуется лечение у гастроэнтеролога. Назначаются комплексы витаминов, йодид калия, гомеопатия, БАДы, адаптогены, фитопрепараты. Из негормональной терапии могут быть назначены препараты ферментативного, седативного и мочегонного типа.

При диффузной мастопатии рекомендуется увеличить физическую активность, подключить психотерапию и занятия ЛФК. Среди физиотерапевтических процедур практикуется применение электрофореза, лазеротерапии, гальванизации, магнитотерапии, бальнеолечения (грязелечение, климатотерапия, глинолечение, морские и минеральные целебные ванны).

При диффузной мастопатии регулирующая гормонотерапия направлена на ликвидацию гормональных дефектов и может включать назначение пациентке гестагенов (дидрогестерона, прогестерона и т.д.), гормонов щитовидной железы, правильный подбор методов контрацепции. Все эти средства помогут выровнять уровень эстрогенов. Что это, теперь понятно.

Чтобы уменьшить чувство напряжения и болезненность в молочных железах, наносят местно гель, содержащий прогестерон.

В каких случаях требуется хирургическое вмешательство?

Если медикаментозное лечение диффузных изменений молочных желез в течение полугода не дало эффекта, то прибегают к хирургическому вмешательству – удаляют уплотнения. При проведении операции могут использоваться следующие методики:

• Резекция. Под ней предполагается иссечение воспаленной области. Полученные ткани затем отправляют на гистологический анализ, чтобы исключить онкологию груди.
• Склерозирование. Применяется при кистозной форме диффузных изменений. Под таким методом понимается введение склерозирующего вещества, приводящего к заращиванию в молочной железе ее дефектов.
• Хирургическая (оперативная) терапия множественных формирований не осуществляется: удалить или иссечь ткань грудной железы посредством нуклеации возможно лишь при диагностировании онкологии. Если есть диффузные изменения, то назначаются мониторинг состояния желез и консервативное лечение. Пациентка ставится у маммолога на учет. Каждые полгода она проходит обследования.

Народная терапия

В числе народных методов, используемых при лечении патологических диффузно-фиброзных изменений молочной железы, можно выделить наружные средства и терапию травами в форме отваров, которые употребляются внутрь.

Первая категория включает в себя компрессы из настоев ряда лекарственных растений: красный клевер, донник, зверобой, манжетка и полынь. И хотя два первых растения содержат в себе фитоэстрогены, не совсем ясно, как они действуют в форме компрессов.

Кроме того, популярным стало народное лечение с помощью компрессов из капустных листьев, тертой сырой свеклы, прополиса со смальцем, алоэ с медом (компрессы принято накладывать на ночь на грудь).

Лечение травами содержит рекомендации к приему успокаивающего настоя валерианы (на 200 миллилитров кипятка пять граммов корней), отвара из смеси равных количеств перечной мяты и пустырника (на стакан воды столовая ложка смеси), отвара тмина и семян фенхеля (равное количество ингредиентов смешивают, берут 1 ст.л. на стакан воды) – два раза в день по 100 миллилитров. Фенхель чаще всего применяется при метеоризме и вздутии живота, а использование его при диффузной патологии груди может быть объяснено присутствием в плодах растения эфирных масел, которые состоят из жирных ненасыщенных кислот, включая олеиновую и линолевую. Плоды тмина, родственного фенхелю, применяются для улучшения пищеварения. Также они богаты терпеновыми соединениями, фенолкарбоновыми кислотами и маслами.

Насколько опасна мастопатия?

Могут ли диффузные изменения мастопатия вызвать рак груди? Такой вопрос очень сильно волнует женщин, столкнувшихся с подобной проблемой. Сама мастопатия не вызывает злокачественную трансформацию и не считается состоянием предракового типа. Однако факторы, провоцирующие появление данного заболевания, общие с патологиями онкологического характера. Имеется определенное сходство данных болезней и в морфологии. Существует статистика, которая показывает на сочетание доброкачественных формирований со злокачественными опухолями в половине всех случаев, но вероятность трансформации внепролиферативной формы мастопатии в рак составляет меньше одного процента.

Но диффузная мастопатия может перерасти в узловую, которая по своей сути является следующей стадией. При таком типе формирование узлов происходит постоянно. Оно не зависит от женского менструального цикла. Именно поэтому женщины с диагностированной диффузной мастопатией должны проходить обследования у маммолога раз в полгода. Нужно регулярно проверять уровень женских гормонов эстрогенов.

Профилактика и советы при диффузной мастопатии

Залогом эффективной профилактики и своевременного диагностирования диффузной мастопатии является периодическое прохождение осмотров врача-маммолога с осуществлением ряда инструментальных исследований. Необходимо вовремя лечить гинекологические заболевания и сопутствующие им генитальные патологии.

Важная роль принадлежит регулярному обследованию самой женщиной состояния своих молочных желез. Особое внимание при этом нужно обращать на появление уплотнений и болезненности, пятен на коже груди, изменение формы молочных желез, выделения из сосков. Желательно правильно подбирать бюстгальтер, чтобы он не сдавливал грудь, предохранять молочные железы от ударов, давления, травм. Во время грудного вскармливания нельзя допускать появления трещин сосков, мастита, лактостаза. Для профилактики мастопатии следует использовать современные контрацептивные методы и не допускать аборты.

Если имеется диффузная мастопатия, это является противопоказанием для маммопластики, использования локальных обертываний и горячих компрессов на грудь, посещения бань и саун, загара на солнце и в солярии.

Фиброзно-кистозная мастопатия | «СМ-Клиника»

Фиброзно-кистозная мастопатия (ФКМ) — это доброкачественное заболевание молочной железы, связанное с патологическим разрастанием ее тканей и нарушенным соотношением соединительно-тканного и эпителиального компонентов.

В настоящее время ФКМ является самым распространенным заболеванием молочной железы. Выделяют 2 формы мастопатии: диффузная и узловая.

Заболевание начинается с появления в молочных железах мелких узелков (или кист) размерами 1–2 мм, или тяжей (диффузная форма), в дальнейшем на этом фоне могут появляться более крупные узлы (узловая форма) и даже опухоли (фиброаденома, саркома, рак).

Основной причиной возникновения мастопатии считается нарушение гормонального фона. В анализах смотрятся показатели половых гормонов, гормонов щитовидной железы и гипофиза (пролактин). Важно знать, что некоторые гормоны сдаются в определенные дни менструального цикла. Нарушение функции печени и почек сопровождается более длительным нахождением гормонов в кровотоке, а значит, увеличивает их действие на молочную железу. Для исключения этих нарушений проводится биохимический анализ крови. При выявлении патологии лечение проходит совместно со смежными специалистами (гинеколог, эндокринолог, уролог, гастроэнтеролог).

Естественно, что лечение (гормональное или негормональное, в зависимости от результатов анализов) лучше начинать на начальных проявлениях мастопатии, когда достаточно сделать несколько корректировок, чтобы не допустить прогрессирования заболевания. На развитие мастопатии также оказывают влияние диета, алкоголь, курение, стресс, ожирение, сахарный диабет.

Что же делать, если вы уже заметили уплотнение в груди?

Такими «уплотнениями» могут быть:

• кисты;
• узловые формы мастопатии;
• доброкачественные опухоли — фиброаденома, липома;
• злокачественные опухоли — саркома, рак;
• нельзя исключать и воспалительные процессы, связанные с наличием инфекции.

• Анамнезе: сборе жалоб, времени появления, выяснении возможных причин возникновения (удары, травмы, воспалительные заболевания). Обязательно устанавливаются родственники, имеющие злокачественные образования и т.д.
• Осмотре и пальпации.
• УЗИ молочных желез и маммографии.
• Анализах крови, онкомаркерах.

Если узловая форма, то сначала устанавливается «природа» опухоли, т. е. какое это образование, злокачественное или доброкачественное. Для этого выполняется пункция образования молочной железы под УЗИ контролем. Процедура заключается в следующем: кожа молочной железы обрабатывается антисептиком, дальше с помощью аппарата УЗИ находится интересующее нас образование, врач-маммолог производит прокол кожи и подводит кончик иглы точно к опухоли, происходит забор материала. На место прокола накладывается асептическая наклейка. Вся процедура занимает в среднем не более 5 минут. Материал направляется в лабораторию, где врачи-цитологи исследуют клеточный состав, и через несколько дней выдается заключение.

Фиброаденома — доброкачественная опухоль молочной железы. Лечение только оперативное. В условиях операционной выполняется удаление опухоли, накладываются швы на ткани молочной железы и внутрикожный шов на кожу. Как правило, нахождение в стационаре занимает не более суток. Пациентке проводятся реабилитационные мероприятия для скорейшего восстановления тканей. Швы с кожи снимаются на 7–10 сутки. Выполняется контрольное УЗИ молочных желез через 1, 3 и 6 месяцев.

Обследование у маммолога показано всем женщинам репродуктивного возраста (даже не имеющим жалоб) не менее 1 раза в год. Профилактические осмотры позволят выявить патологию на начальных стадиях и вовремя выработать тактику лечения.

Женская грудь – зеркало здоровья

26.09.2017

Что важно знать о состоянии молочных желез, как не упустить первые признаки рака и бывают ли проблемы с грудными железами у мужчин. На вопросы читателей «Комсомолки» в пресс-центре ответил врач Многопрофильной клиники РЕАВИЗ онколог-маммолог, пластический хирург высшей категории Максим Поворознюк

Добрый день, Максим Борисович. Меня зовут Ирина. Расскажите, почему возникает мастопатия?
— Мастопатия – это обобщающее название доброкачественных изменений молочных желез. И нужно понимать, что это абсолютно гормонозависимое состояние, видимый результат неправильной работы эндокринной или репродуктивной системы, стрессового состояния организма, гинекологических заболеваний. Поэтому, чтобы выявить причины возникновения мастопатии у конкретной пациентки, маммолог работает в тесной связи с другими специалистами.

Чаще всего мастопатия может быть в виде железистого, фиброзного или кистозного компонента, а также – в смешанной форме. Менее благоприятной формой мастопатии является узловая, когда на молочной железе появляются один или несколько узлов, представляющих собой аденому или фиброаденому. Наличие новообразований в молочной железе – это не стопроцентная вероятность онкологии. Но исследования показывают, что на фоне диффузной мастопатии риск рака молочной железы увеличивается в 10-40 раз.

Чтобы дать конкретные рекомендации именно вам, я приглашаю вас на консультацию ко мне, так как предметно можно говорить на основании анамнеза, инструментального осмотра, УЗИ. Только после получения этих данных можно будет делать выводы о состоянии вашего здоровья и давать рекомендации.

Добрый день, меня зовут Анна. Подскажите, как часто нужно выполнять маммографию, если у женщины в роду были случаи рака?
Согласно рекомендациям ВОЗ обследование молочных желез должно проводиться ежегодно у каждой женщины. Однако если у вас есть подтвержденная наследственная предрасположенность, лучше приходить на осмотр чаще. Первую маммограму нужно сделать в 35 лет, чтобы потом был материал для сравнения. После 40 лет ее необходимо делать раз в два года, и затем после 50 – раз в год. Но помните, что назначать проведение маммографии должен врач-онколог, который учтет множество факторов и сможет понять, даст ли это исследование результат. Маммография – это метод, позволяющий вовремя заметить новообразования в молочной железе, вовремя провести необходимое вмешательство. И это очень важно, ведь рак молочной железы до сих пор остается самым частым онкологическим заболеванием у женщин в европейской части мира.

Все ли новообразования в молочной железе приводят к раку? Ольга
Нет, не все новообразования могут переродиться в опухоль. Но сложность в том, что, не проведя исследования клеточной структуры этого уплотнения, мы не можем со 100% вероятностью ответить, что это. Однако, и удалять каждое новообразование – не выход. Поэтому крайне важно продолжать наблюдение у специалиста, если у вас нашли в молочной железе какие-то изменения.

Отмечу, сегодня рак молочной железы молодеет. Самая молодая пациентка, которой я удалял злокачественную опухоль – 23-летняя девушка. Почему сегодня опухоли появляются у молодых пациенток, до конца не понятно. Но есть множество факторов риска. Один из них – бесконтрольное потребление противозачаточных таблеток. Перед приемом любых средств необходимо проконсультироваться с врачом и не только с гинекологом, но и с маммологом.

Я подчеркну: чрезвычайно важно, чтобы женщина сама следила за здоровьем своей груди. После месячных потратьте несколько минут, встаньте перед зеркалом, посмотрите на форму груди, проведите пальпирование. Если вы делаете это регулярно, вы обязательно почувствуете любые изменения. И вот уже с этой информацией идите непременно к врачу.

Я давно хочу сделать операцию по увеличению груди. Но меня волнует, смогу ли я потом после рождения ребенка кормить его грудью? Евгения
В принципе операцию по маммопластике можно делать и нерожавшим женщинам. Все будет зависеть от того, через какое время вы планируете беременеть и рожать. Я рекомендую дать организму восстановиться после операции не меньше года, за это время сформируется рубцовая ткань. Мои пациентки, которые никогда не рожали, делали маммопластику, затем становились матерями, и никаких сложностей не было.

В многопрофильной клинике РЕАВИЗ можно сделать такую операцию, мы работаем с одними из лучших на рынке производителями имплантатов. Если в процессе подготовки к имплантации мы выявим какие-то проблемы с молочной железой, то сможем сразу удалить новообразования и поставить имплантат. Вам не придется ходить по разным учреждениям, несколько раз сдавать анализы. Наши пациенты признают – это крайне удобно.

А является ли болезнью опухание желез у мужчин?
Да, это гинекомастия. Ее проявления бывают у подростков в период полового созревания. У взрослых мужчин часто встречается у спортсменов после приема стероидов, или у людей с избыточным весом на фоне приема медикаментов. В этом случае мужчины могут испытывать дискомфорт, чувство набухания грудных желез. Это лечится, приходите на прием, выявим проблемы, проведем коррекцию. Хочу напомнить, что своевременное обращение к специалисту очень важно. У мужчин тоже может быть рак грудной железы, при этом проистекает он очень агрессивно и трудно поддается лечению.

Можно ли выявить рак груди на ранних стадиях? Вика
Конечно можно, для этого мы и работаем. Чтобы выявить изменения в молочной железе на ранних стадиях, необходимо регулярно проходить осмотр у маммолога-онколога, делать УЗИ и маммографию. Этой триады достаточно, чтобы диагностировать вовремя самые маленькие опухоли. Хотя, конечно, все зависит не только от качества оборудования, но и от глаз, которые смотрят на монитор. И повторюсь, для женщины очень важен систематический самоосмотр перед зеркалом. Ваше здоровье – в ваших руках.

Мне недавно делали УЗИ и написали в карточке: фиброзно-кистозная мастопатия. Посоветовали просто наблюдать, этого и правда достаточно? Анастасия
Сказать вам что-то без личной встречи и консультации с осмотром – невозможно. Только по результатам УЗИ диагноз не выставляется. Я приглашаю вас прийти на консультацию до 12 дня цикла, в этот период самые точные результаты исследования. И мы сможем уточнить диагноз и понять, какой путь лечения для вас подходит.

Добрый день, Максим Борисович. Меня зовут Надежда Павловна, мне 74-й год. Мне поставили диагноз кистозно-фиброзная мастопатия уже пятнадцать лет назад. Я каждый год делаю компьютерную маммографию. Нужно ли так делать?
Учитывая проблему, которую вы мне озвучили, вам показано ежегодное наблюдение на компьютерной маммографии. Я рекомендую с такой же периодичностью делать УЗИ и проходить обследование у врача-маммолога. Это сочетание будет максимально оптимальным для наблюдения за вашей проблемой. Чтобы дать вам более точные рекомендации, нужно сравнить показания текущей и предыдущей маммографии.

Фиброзно-кистозное изменение (груди) | Справочная статья по радиологии

Фиброзно-кистозное изменение груди (также известное как диффузная кистозная мастопатия) — доброкачественное изменение в терминальной долевой протоковой единице груди с фиброзом или без него. Это рассматривается как широкий спектр измененной морфологии женской груди от безвредных до тех, которые связаны с риском карциномы.

Очень частое заболевание (клинически наблюдается у 50% и гистологически у 90% женщин ⁶ ).До подросткового возраста фиброзно-кистозные изменения встречаются редко. Чаще всего они диагностируются в возрасте от 20 до 40 лет с пиком до или во время менопаузы.

По сравнению с общей популяцией, женщины с непролиферативными поражениями не имеют значительного повышения риска развития рака груди, в то время как женщины с пролиферативным заболеванием имеют больший риск.

• Боль в груди, усиливающаяся во время овуляции
• Нежные узелковые опухоли
• чаще всего мультифокальные и двусторонние

Гормональные изменения с преобладанием эстрогена над прогестероном считаются важным фактором.Наблюдаемые изменения подразделяются на:

• непролиферативный (простой) FCC, который включает простую кисту и / или фиброз молочной железы (наиболее часто)
• пролиферативные, в том числе

Аберрации нормального развития и инволюции груди (ANDI) включают в себя все изменения, связанные с нормальными вариациями паренхимы груди, связанные с изменениями уровня гормонов и старением, поэтому лучше классифицировать фиброзно-кистозные изменения в соответствии с ANDI, и это не должно быть рассматривать как патологию как таковую.

Маммография

• На груди видна неоднородная и обычно плотная паренхима
• Могут присутствовать частично ограниченные образования, отражающие кисты
• чашка чая, круглые кальцификаты низкой плотности с множеством долей

Ультразвук

На УЗИ могут быть обнаружены:

• выступающая фиброгландулярная ткань в области пальпируемого узелка; однако нет заметной массы
• маленькие кисты в зоне молочной железы

CRS00200

% PDF-1.4 % 156 0 объект > эндобдж 150 0 объект [/ CalGray>] эндобдж 149 0 объект [/ CalRGB>] эндобдж 148 0 объект > эндобдж 151 0 объект > поток Сб, 08 сен, 10:34:46 2007 PageGenie PDFGeneratorapplication / pdf

Интерстициальное заболевание легких: фиброз легких

Что такое интерстициальная болезнь легких?

Интерстициальное заболевание легких относится к группе из примерно 100 хронических заболеваний легких, характеризующихся воспалением и рубцеванием, которые затрудняют получение легкими достаточного количества кислорода.Рубцевание называется легочным фиброзом.

Симптомы и течение этих заболеваний могут варьироваться от человека к человеку. Общая связь между многими формами болезни заключается в том, что все они начинаются с воспаления.

• Бронхиолит: воспаление мелких дыхательных путей (бронхиол).
• Альвеолит: воспаление воздушных мешков, в которых происходит обмен кислорода и углекислого газа в крови (альвеолы).
• Васкулит: воспаление, которое затрагивает мелкие кровеносные сосуды (капилляры).

Фиброз приводит к необратимой потере способности ткани легких переносить кислород. Воздушные мешочки, а также легочная ткань вокруг воздушных мешочков и легочных капилляров разрушаются, когда образуется рубцовая ткань.

Заболевание может протекать постепенно или быстро. Люди, у которых он есть, могут заметить колебания симптомов от очень легких до умеренных и очень тяжелых. Состояние может оставаться неизменным долгое время или быстро меняться. Течение болезни непредсказуемо.Если болезнь прогрессирует, легочная ткань утолщается и становится жесткой, затрудняя дыхание.

Что вызывает интерстициальные заболевания легких?

Причина интерстициального заболевания легких неизвестна. Основные способствующие факторы включают:

• Курение
• Определенные лекарственные препараты или медикаменты
• Воздействие веществ на работе или в окружающей среде, таких как органическая или неорганическая пыль
• Определенные заболевания соединительной ткани или коллагена и саркоидоз
• Семейная история
• Лучевая терапия

Каковы симптомы интерстициальных заболеваний легких?

Каждый человек может испытывать интерстициальное заболевание легких по-разному, но наиболее частыми симптомами являются:

• Одышка, особенно при активности
• Сухой отрывистый кашель без выделения мокроты
• Сильная усталость и слабость
• Потеря аппетита
• Необъяснимая потеря веса
• Дискомфорт в груди
• Затрудненное дыхание, которое может быть частым и поверхностным
• Легкое кровотечение

Симптомы интерстициальных заболеваний легких могут быть похожи на другие заболевания легких или проблемы со здоровьем.Поговорите со своим врачом для постановки диагноза.

Как диагностируются интерстициальные заболевания легких?

В дополнение к полной истории болезни и физическому осмотру поставщик медицинских услуг может также запросить функциональные тесты легких. Эти тесты помогают измерить способность легких перемещать воздух в легкие и из них. Они могут включать:

Спирометрия

Спирометр — это устройство, используемое для проверки функции легких. Спирометрия — один из самых простых и распространенных тестов.Может использоваться для:

• Определите, насколько хорошо легкие получают, удерживают и перемещают воздух
• Ищите болезнь легких
• Посмотрите, как хорошо работает лечение
• Определить степень тяжести заболевания легких
• Определите, является ли заболевание легких ограничительным (снижение воздушного потока) или обструктивным (нарушение воздушного потока)

Контроль максимального расхода

Это устройство используется для измерения скорости выдувания воздуха из легких.Изменения, связанные с заболеванием, могут привести к медленному сужению крупных дыхательных путей в легких. Это замедлит скорость выхода воздуха из легких. Это измерение очень важно для оценки того, насколько хорошо или плохо контролируется болезнь.

Рентген грудной клетки

Этот тест позволяет сфотографировать внутренние ткани, кости и органы.

Анализы крови

Газ артериальной крови может быть выполнен для проверки количества углекислого газа и кислорода в крови. Другие анализы крови могут использоваться для поиска возможных инфекций.

КТ

В этом тесте используется комбинация рентгеновских лучей и компьютерных технологий для получения горизонтальных или осевых изображений (часто называемых срезами) тела. КТ более детализирована, чем обычные рентгеновские снимки.

Бронхоскопия

Это прямое исследование основных дыхательных путей легких (бронхов) с помощью гибкой трубки, называемой бронхоскопом. Бронхоскопия помогает оценить и диагностировать проблемы с легкими, проверить закупорку, взять образцы ткани или жидкости и помочь удалить инородное тело.Бронхоскопия может включать биопсию или бронхоальвеолярный лаваж.

Бронхоальвеолярный лаваж

Удаление клеток из нижних дыхательных путей для выявления воспаления и исключения определенных причин.

Биопсия легкого

Удаление небольшого кусочка ткани из легкого для исследования под микроскопом.

Как лечат интерстициальные заболевания легких?

Поскольку причин очень много, лечение будет различным. Некоторые интерстициальные заболевания легких неизлечимы.Лечение направлено на предотвращение дальнейшего рубцевания легких, устранение симптомов и помощь в поддержании активности и здоровья. Лечение не может исправить уже возникшее рубцевание легких.

Процедуры могут включать:

• Пересадка легкого
• Пероральные препараты, включая кортикостероиды для уменьшения воспаления и циклофосфамид (цитоксан) для подавления иммунной системы
• Кислородная терапия из переносных контейнеров
• Легочная реабилитация

Проконсультируйтесь с лечащим врачом относительно прививок от гриппа и пневмококка.Ежегодная прививка от гриппа может помочь предотвратить как грипп, так и пневмонию. Кроме того, пневмококковые бактерии могут вызывать незначительные проблемы, такие как ушные инфекции, но также могут перерасти в опасные для жизни заболевания легких (пневмония), покровов головного и спинного мозга (менингит) и крови (бактериемия). Пневмококковой инфекцией может заразиться кто угодно, но наибольшему риску подвержены дети младше 2 лет, взрослые в возрасте 65 лет и старше, люди с определенными проблемами со здоровьем и курильщики.

Основные сведения об интерстициальных заболеваниях легких

• Интерстициальная болезнь легких — это название группы из 100 заболеваний легких, которые вызывают воспаление или рубцевание легких.
• Причина неизвестна. Основными факторами, способствующими этому, являются курение и вдыхание загрязнителей окружающей среды или производственных помещений.
• Наиболее частыми симптомами являются одышка, особенно при физической активности, и сухой отрывистый кашель.
• Тесты, которые помогают измерить способность легких обменивать кислород и углекислый газ, используются для диагностики этого состояния.Анализы крови и визуализационные тесты также могут использоваться, чтобы увидеть, насколько серьезна проблема, и контролировать ее с течением времени.
• Целью лечения людей с этим заболеванием является предотвращение образования рубцов и устранение симптомов.

Следующие шаги

Советы, которые помогут вам получить максимальную пользу от визита к врачу:

• Знайте причину вашего визита и то, что вы хотите.
• Перед визитом запишите вопросы, на которые хотите получить ответы.
• Возьмите с собой кого-нибудь, кто поможет вам задать вопросы и запомнить, что вам говорит ваш лечащий врач.
• Во время посещения запишите название нового диагноза и любые новые лекарства, методы лечения или тесты. Также запишите все новые инструкции, которые дает вам врач.
• Узнайте, почему прописано новое лекарство или лечение и как они вам помогут. Также знайте, какие бывают побочные эффекты.
• Спросите, можно ли вылечить ваше состояние другими способами.
• Знайте, почему рекомендуется тест или процедура и что могут означать результаты.
• Знайте, чего ожидать, если вы не примете лекарство, не пройдете тест или процедуру.
• Если вам назначена повторная встреча, запишите дату, время и цель этого визита.
• Знайте, как вы можете связаться с вашим лечащим врачом, если у вас возникнут вопросы.

Жировые стволовые клетки при репаративном мастите молочной железы коз

Abstract

Мезенхимальные стволовые клетки широко используются при лечении различных хронических заболеваний. Целью этого исследования было оценить терапевтический и регенеративный потенциал стволовых клеток из жировой ткани (ASC) в восстановлении молочной продуктивности при восстановлении повреждений тканей у коз с маститом, получавших антимикробные препараты перед клеточной терапией.После диагностики мастита и лечения гентамицином восемь лактирующих коз были отобраны для клеточной и последующей терапии, физико-химического анализа молока, ультразвукового и гистопатологического исследований. ASC были взяты из подкожно-жировой клетчатки молодой козы, выращенной in vitro , маркированной Qdots-655 и введенной в левую молочную железу, которая является правой молочной железой, используемой в качестве контроля. Через 30 дней были повторены ультразвуковые и гистопатологические анализы, а в первый период лактации физико-химический анализ молока был повторен.Перед клеточной терапией физико-химическое качество молока было нарушено, а ультразвуковой и гистопатологический анализ выявил хронический воспалительный процесс и фиброзную ткань. Маркировка ASC с помощью Qdots позволяет отслеживать с помощью флуоресцентной микроскопии (BX41-OLYMPUS) в ткани молочной железы. При терапии ASC культуры показали высокую клеточность и характеристики, благоприятные для доклинических исследований; при терапии физико-химические параметры молока, жира, белка, температуры и pH показали значительные различия между группами; у пяти животных, получавших ASC, восстановилась функциональность железы и соединительной ткани, количество которых уменьшилось, и воспалительные инфильтратные клетки.ASC имеют потенциал для возможной регенерации поражений фиброзного мастита в молочной железе, однако необходимо увеличить время инъекции для гистопатологического анализа, поскольку восстановление ацинусов железы в течение оцениваемого периода не было завершено. ASC можно использовать для восстановления молочной продуктивности у коз с хроническим маститом, восстанавливая повреждения молочной железы, что может стать многообещающей клинической альтернативой реабилитации животных для повышения продуктивности.

Образец цитирования: Costa CRM, Feitosa MLT, Rocha AR, Bezerra DO, Leite YKC, Argolo Neto NM, et al.(2019) Жировые стволовые клетки при репаративном мастите молочной железы коз. PLoS ONE 14 (10): e0223751. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751

Редактор: Хуан Дж. Лоор, Университет Иллинойса, США

Поступила: 4 октября 2018 г .; Принята к печати: 29 сентября 2019 г .; Опубликовано: 22 октября 2019 г.

Авторские права: © 2019 Costa et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта публикация была поддержана Национальным советом по научному и технологическому развитию (CNPq-Brazil) под номерами грантов 552400 / 2011-4 и 311684 / 2012-2. Получатель гранта: Мария Аселина Мартинс де Карвалью.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Клеточная терапия является альтернативой лечению различных хронических и дегенеративных заболеваний.Стволовые клетки способны изменить патологическое состояние при различных заболеваниях практически во всех тканях организма [1, 2].

Мастит — это заболевание молочной железы, вызывающее необратимые изменения в железистой ткани, и не существует эффективных лекарств или методов лечения, которые могли бы полностью уменьшить характеристики поражений, которые напрямую влияют на выработку молока, причиняя большой вред производителям [ 3]. В результате воспалительного процесса большая часть ткани молочной железы замещается рубцовой соединительной тканью [4, 5].

Эти клетки представляют собой линию мезенхизомных клеток с обширной пролиферативной способностью, кроме того, они различаются в разных типах клеток [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]. Культура in vitro характеризуется адгезией клеток к пластику, колониеобразующей способностью, низким иммуногенным фенотипом и костимулирующими молекулами [12, 13].

ASC обладают большим потенциалом для ангиогенеза [14], поэтому при введении в молочную железу коз с хроническим маститом они могут восстановить свою функциональность, поскольку это орган с высокой васкуляризацией.Что касается терапии, ASC имеют другие благоприятные характеристики, так как они обладают стимулирующим регенеративным действием, многочисленны, доступны, легки в получении и обладают разнонаправленным дифференцирующим потенциалом, они экспрессируют на поверхности высокие уровни маркеров, среди которых наиболее часто упоминаются CD34, CD90, CD146, CD105 И CD73 [15, 16, 17]. ASC показали хорошие результаты в восстановительной терапии повреждения седалищного нерва, применяемой in vivo, в исследовании, проведенном DiMarino et al. [18].

Получение подкожной жировой ткани указано в литературе [19] как простой метод, кроме того, количество клеток, имеющихся в этих депо, является очень и, следовательно, лучшей альтернативой для клинического применения [20, 21].

Исследования с ASC были сосредоточены на его положительном потенциале, особенно в отношении процесса заживления, такого как восстановление сухожилия кролика [21], голосовой связки в модели собаки [10], нейродегенеративных состояний в модели мыши [22]. В молочных железах коз до сих пор не было обнаружено исследований с использованием этих клеток.

Характеристики мультипотентности и иммуномодуляции мезенхимальных стволовых клеток, связанные с предыдущими сообщениями об их эффективности в восстановлении соматических тканей, делают его многообещающей альтернативой для лечения мастита коз.Однако эта гипотеза до сих пор не подтверждена. По этой причине целью данного исследования было оценить терапевтический вклад ASCS в морфофункциональное восстановление молочной продуктивности молочных желез коз с хроническим спонтанным маститом.

Материалы и методы

Животные и этические аспекты

Все процедуры этого исследования были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Федерального университета Пиауи (№ 037/2012) в соответствии с правилами Национального колледжа контроля экспериментов на животных (файл S1).Коз со спонтанным маститом содержали в козоводном секторе, их кормили натуральными пастбищами и слоновой травой ( Pennisetum Purpureum Schum ), пересекаемой с травами, в дополнение к коммерческому рациону, гранулированному с 18% сырого протеина и ad libitum водой. После эксперимента все животные вылечились от клинического мастита и были реинтегрированы в стадо.

Подбор животных

Животные из козьего сектора Федерального университета Пиауи, факультет зоотехники.Первоначально было отобрано 30 коз ( Capra Hircus ) породы англонубиан (тот же период лактации), фаза, которая приходилась на сезон дождей (с февраля по май). Выбор производился следующим образом: тот же период лактации, от 4 до 6 лет, физиологические параметры (температура — 39 °, сердцебиение — 72, дыхательные движения — 30 в минуту и ​​движения рубца — 3 в 2 минуты), Калифорнийский мастит Положительный результат теста – CMT [23] и положительный результат по количеству соматических клеток (SCC) -> 1×10 ⁶ клеток мл ^–1 (Таблица 1).Для SCC использовали электронный метод (DeLaval Cell Count ^® — Direct Cell Countern Delaval), 0,6 мл молока отсасывали с помощью одноразовой кассеты и анализировали на считывающем оборудовании. Это испускает луч света, который пересекает кассету, и через 45 секунд выполняется подсчет отдельных клеток в SCC / мкл.

Отобранные животные также были подвергнуты обследованию для клинической характеристики мастита, где две половины молочной железы были проанализированы отдельно для каждого теста, предполагавшего в общей сложности 16 образцов: культивирование и выделение микробов — стандартные методы идентификации микробного рода [24 ]; тесты на чувствительность к антимикробным препаратам — агар Мюллера-Хинтона [25]; и физико-химический анализ молока перед предлагаемой обработкой — ультразвуковой метод (Ekomilk Total ^® Ultrasonic Milk Test Device.Eon Trading LLC, Болгария), в этом тесте для проверки качества молока оценивались жир, твердое нежирное молоко (MSNF), плотность, белок, температура, лактация, электрическая проводимость и pH; Ультрасонографический тест с линейным датчиком от 3,5 до 7 МГц (Chison Medical Imagine, модель D600VET digital. Серия D6V: 10008068) и гистопатологический анализ биоптатов.

Для физико-химического анализа молока ультразвуковым методом вымя продезинфицировали (водой и жидким мылом и высушили бумажным полотенцем), и первые три струи молока были отброшены, 200 мл молока доили отдельно из каждого вымени в стерильных условиях и идентифицировали. флаконы.В Лаборатории анализа молока Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de Alimentos (Ядро исследований, исследований и обработки пищевых продуктов) –NUEPPA / UFPI каждый образец оценивался в трех экземплярах.

При оценке с помощью ультразвукового исследования использовалось портативное устройство с высоким разрешением с линейным датчиком от 3,5 до 7 МГц (Chison Medical Imagine, модель D600VET digital. Серия D6V: 10008068), изображения были сделаны с глубиной 8 см, 5 МГц. частоты и зонд 5 МГц.Животных держали в вертикальном положении в контейнере, подвергали дезинфекции вымени водой с мылом и сушили бумажными полотенцами. После нанесения бесцветного проводящего геля датчик позиционировали и перемещали по поверхности кожи, позволяя формировать ультразвуковые диаграммы в верхней и нижней части каждой молочной железы.

Для выполнения процедуры биопсии молочной железы с целью охарактеризовать ткань молочной железы до и после лечения животным вводили седативные препараты кетамина гидрохлорид (5 мг / кг) и выполняли антисептическую процедуру с использованием 70% спирта, затем йодом повидоном и подкожной инфильтрацией. гидрохлорида лидокаина с сосудосуживающим средством в дозе 4 мг / кг выполняли в двух точках биопсии.Были выполнены два иссечения по 1 см ² , по одному в каждой железе, латеральной и медиальной областях, разделены ножницами с тупым концом Metzembaum , до визуализации паренхимы ткани молочной железы и удалены путем иссечения, два фрагмента по три грамма , к установке в Буэн и замораживании соответственно.

Фрагменты, зафиксированные в растворе Буэна, были отправлены в Лабораторию морфологии интегрального ядра морфологии и песка ком Células-Tronco (Лаборатория морфологии интегрированного ядра морфологии и исследования стволовых клеток (NUPCelt) для рутинной гистопатологической обработки и считывания. слайдов.После включения парафина делали срезы размером 5 мкм и готовили предметные стекла для окрашивания гематоксилин-эозином и трихромом Массона для обнаружения инфильтрата воспалительных клеток и фиброзных элементов и последующей оценки в оптическом микроскопе (Nikon Eclipse E200).

Анализ гистопатологических препаратов был проведен полуколичественным путем, при котором измерялась интенсивность идентифицированных поражений с учетом морфологических репрезентативных параметров. Для этого были установлены установленные шкалы для фиброза стромы, основанные на плотности внутрилобулярных и межлобулярных коллагеновых волокон, такие как 0 — отсутствие, 1 — легкое, 2 — умеренное и 3 — тяжелое.

Для анализа инфильтрата воспалительных клеток использовали методику Camperio et al. [26], 0- отсутствие поражений, отсутствие инфильтрата интерстициальных и / или альвеолярных воспалительных клеток и неповрежденной ткани, 1- очаговый или мультифокальный, легкий инфильтрат интерстициальных и / или альвеолярных воспалительных клеток и неповрежденная ткань, 2- умеренный интерстициальный и / или мультифокальный альвеолярный инфильтрат воспалительных клеток и неповрежденная ткань 3- интерстициальный и / или диффузный альвеолярный инфильтрат воспалительных клеток и очаговые области повреждения ткани, 4- интерстициальный и / или диффузный альвеолярный инфильтрат, тяжелые воспалительные клетки и обширные некротические области.

Индекс пролиферации и организации эпителиальных клеток в ткани мамария был установлен с помощью баллов, учитывающих клеточную колонизацию и плотность, например, 0 — отсутствие, 1 — легкое (новообразование ≤ 25%), 2 — умеренное (новообразование ≥ 25 ≤ 50). %, 3-интенсивный (> 50%). Также был проведен описательный анализ слайдов.

Замороженные ткани анализировали без окраски. Мониторинг ASC, маркированного нанокристаллами (ASC-nac), проводили с помощью флуоресцентной микроскопии (BX41-OLYMPUS).

Диагностические методы позволили выбрать восемь коз с хроническим маститом для терапии g-ASC. Антибиотикотерапия мастита проводилась гентамицином в дозе 4 мг / кг в день в течение десяти дней до лечения ASC.

Изоляция и расширение g-ASC

Стволовые клетки были получены из подкожной жировой ткани молодого козла (10 месяцев) породы англонубийские, оценены по весу (40 кг), физиологическим параметрам — температуре (39 °), сердцебиению (72 ударов в минуту), дыхательным движениям (30 ударов в минуту). ), рубца (3 за 2 мин) и пальпации поясничной и грудинной области (оценка 5) [27] для подтверждения здоровья, транспортировка в Центр доклинических исследований (CEPREC) Интегрированного ядра морфологии и Исследования со стволовыми клетками (NUPCelt).

Проведена трихотомия грудины (средостение грудной области 3-й стернебры), местная антисептика йодированным спиртом и предварительная анестезия гидрохлоридом кетамина (Dopalen ^® , Agribrands. Paulínia, SP, Бразилия) в дозе 8 мг / кг, связанное с мидазоламом (Dormire. ^® , Cristália Chemicals and Pharmaceuticals Products, Itapira / SP, Brazil) с 0,5 мг / кг внутримышечно и инфильтративная подкожная анестезия с 4 мг / кг гидрохлорида лидокаина (Cristália Chemicals и фармацевтические продукты, Итапира / СП, Бразилия).Было выполнено иссечение кожи на 1 см, ножницами с тупым концом разделили до подкожной жировой ткани и удалили трехграммовый фрагмент.

Жир был упакован в пробирки Falcon на 50 мл (Falcon; BD Pharmingen) с питательной средой DMEM / F12 (Gibco® Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12, Invitrogen, California, USA) и доставлен в лабораторию культуры стволовых клеток (LABCelt. ).

Для выделения и размножения g-ASC ткань трижды промывали PBS 0.15 M (PBS Gibco ^® , Invitrogen, Калифорния, США), содержащий пенициллин (100UI / мл) -стрептомицин (10 мкг / мл) в концентрации 4% (Sigma ^® , St Louis, MO, USA) для устранения любой вид загрязнения. В чашках Петри с культуральной средой DMEM-F12 (Gibco) жир фрагментировали скальпелем и добавляли 1 мг / мл коллагеназы типа I (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в разведении 1: 3 в культуральную среду без фетальной сыворотки. помещали в инкубатор при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 30 минут и в течение одного часа на водяной бане при 37 ° C, встряхивая пробирку каждые 10 минут.Суспензию фильтровали в пробирке на 50 мл с нейлоновой сеткой 100 мкм (сетчатый фильтр, BD-Biociences, США). Его центрифугировали (Excelsa ^® Model 280, FANEM, SP, Brazil) дважды при 462 g в течение 10 минут и осадок ресуспендировали в полной DMEM-F12. Клетки помещали в культуральные колбы из полистирола (Tecno Plastic Products, Швейцария), 25 см ² , в концентрации 2 × 10 ⁶ клеток и выдерживали в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO ₂ . Через 24 часа культуральную среду меняли.Их держали в культуре с последовательными субкультурами каждые три дня до шестого пассажа, а затем замораживали. Изображения клеток в культуре визуализировали с помощью инвертированной световой микроскопии (COLEMAN NIB – 100 ^® ).

Оценку роста g-ASC проводили, культивируя 1 × 10 ⁵ клеток / мл в 20 колбе для культивирования (25 см ² ). Каждые 24 часа флакон с ASC трипсинизировали и клетки подсчитывали в камере Нойбауэра (Improved, Labor-Optik, Германия).Способ выращивания остальных флаконов меняли каждые три дня. Подсчет клеток в световом инвертированном микроскопе (COLEMAN NIB– 100 ^® ) выполняли методом исключения с 0,4% трипановым синим (Sigma-Aldrich, США) [28], чтобы определить количество и жизнеспособность клеток в трех повторностях. . Использовалась формула для расчета количества клеток (Общее количество клеток x 2 (коэффициент разведения) x 10 ⁴ (количество квадрантов).

Характеристика g-ASC

Для дифференциации культуральные g-ASC отделяли с помощью подсчета трипсин-ЭДТА (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и повторно помещали (1×10 ⁴ ) в 6-луночный планшет с 2 мл культуральной среды при достижении конфлюэнтности 80. % среду заменяли коммерческой средой для индукции остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировки (StemPro ^® osteogenesis, StemPro Chondrogenesis и StemPro adipogenesis — набор для дифференциации — Gibco ^™ , Invitrogen, Калифорния, США), меняя среду каждые три дня. на 21 день.После получения морфологических характеристик, которые предполагают ожидаемые клоны, их окрашивали в соответствии с типом клеток: адипогенными (Oil Red O — Invitrogen Life Science Technologies, Карлсбад, Калифорния, США), остеогенными (Alizarin Red — Invitrogen Life Science Technologies, Карлсбад, Калифорния). , США), хондрогенный (Alcian Blue — Sigma-Aldrich).

Клетки также были охарактеризованы в соответствии с наличием маркеров мезенхизомных стволовых клеток (CD90) и отсутствием маркеров гемопоэтических стволовых клеток (CD14) с помощью метода проточной цитометрии.Для идентификации антигенов использовали следующие антитела: CD14 (Anti-CD14 FITC-Sigma, США, 1: 100, код C7673) и CD90 (Anti-CD90 APC-Abcam Cambridge, США, 1: 100, код 555596). . В дополнение к образцу отрицательного контроля только с клетками без использования антител.

Клетки шестого пассажа трипсинизировали и после проверки жизнеспособности клеток трипановым синим подсчитывали в камере Нойбауэра (Improved, Labor-Optik, Германия) и ресуспендировали в PBS, затем 2.5 x 10 ⁵ клеток распределяли в пробирки Falcon по 15 мл для каждого из анализируемых маркеров. В каждую пробирку помещали 1 мл FACS [DBPS] (фосфатный буферный раствор Dubelco), содержащего 0,1% BSA, 462g центрифугировали в течение 10 минут до промывания. Клетки инкубировали с конъюгированным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации клетки один раз промывали 1 мл буфера FACS для удаления избытка антител. Образцы анализировали с помощью проточного цитометра (FACScanto® II и программное обеспечение BD FACSDiva Software.Версия 6.1.3), получая 30 000 событий на каждый протестированный образец. Популяции оценивали по проценту клеток, экспрессирующих каждый из маркеров, по сравнению с общим количеством клеток, полученных с использованием программного обеспечения INFINICYT (версия 5.1). Результаты были нанесены в виде гистограммы.

Маркировка, трансплантация и отслеживание g-ASC-nac

g-ASC были помечены QDots-655 (Invitrogen, Life Technologies, США) для скрининга тканей ex vivo .Когда они достигли 80% слияния, при культивировании in vitro g-ASC были обработаны трипсином и центрифугированы при 462 g в течение 10 мин. Всего 3,5 × 10 ⁶ клеток были помечены QDots ^® — эмиссия (655 нм) и возбуждение (405-615 нм). Для маркировки компоненты A и B Qdots гомогенизировали и добавляли к g-ASC, их инкубировали в инкубаторе с CO ₂ при 37 ° C в течение 50 минут и перемешивали каждые 10 минут. Добавляли 1 мл половины Alpha-MEM (Gibco ^™ Minimum Essential Medium Eagle.Invitrogen, Калифорния, США), проанализировали жизнеспособность с помощью 0,4% трипанового синего (Sigma-Aldrich, США), клетки подсчитали и дважды центрифугировали, 462g в течение пяти минут, осадок ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора и поместили в шприц (1 мл), и инъекция выполнялась в пять областей (0,2 мл) непосредственно в левую молочную железу коз (24 часа натощак), предварительно обработанные (0,05 мг / кг ксилазина гидрохлорида, внутримышечно, через 15 минут под анестезией) с ассоциацией 8 мг / кг кетамина и 0.5 мг / кг малеат мидазолама внутривенно). В правую молочную железу вводили физиологический раствор фосфатного буфера (PBS Gibco ^® , Invitrogen, Калифорния, США) в качестве контроля. Общее количество клеток, инъецированных каждому животному, составляло 3,5 × 10 ⁶ .

Для отслеживания ASC через 30 дней после инъекции клеток отбирали ткань для биопсии из правой и левой молочных желез (латеральная и медиальная области), козлов анестезировали по тому же протоколу, который был описан ранее.Были собраны ткани для включения в парафин и для замораживания в жидком азоте. Гистологический анализ парафинированных тканей без окраски проводили под флуоресцентным микроскопом (BX41-OLYMPUS) для отслеживания маркировки клеток с помощью Qdots, а тканей, окрашенных гематоксилином-эозином и трихромом Массона, под световым микроскопом (Nikon Eclipse E 200 ^® , Япония. ) для описания структуры ткани молочной железы через 30 дней после инъекции клеток.

Замороженные ткани без окраски были проанализированы после 90 дней замораживания во флуоресцентном микроскопе (BX41-OLYMPUS).

Оценка животных после клеточной терапии g-ASCs-nac

После 30 дней клеточной терапии, сонографические исследования были повторены, и был проведен новый сбор ткани молочных желез, следуя тем же процедурам, которые были описаны перед клеточной терапией.

В первый период лактации после инъекции клеток был проведен физико-химический анализ молока тем же ультразвуковым методом, который уже описан (устройство для ультразвукового тестирования молока Ekomilk Total ^® .Eon Trading LLC, Болгария).

Для анализа физико-химических результатов были сформированы три группы: клинически здоровые животные, контрольная (CTR), животные с хроническим маститом и без лечения ASC (M-ASC) и животные с хроническим маститом, получавшие ASC (M + ASC).

Статистический анализ

Статистические данные для гистологического полуколичественного анализа были получены путем сравнения вариабельного фиброза, воспалительного процесса инфильтративных клеток и пролиферации клеток между стадией ASC до и после инъекции в молочную железу козы с использованием критерия хи-квадрат.

В физико-химических результатах был проведен дисперсионный анализ (ANOVA) с целью выявления статистически значимых различий между независимыми группами с последующим сравнением множественного критерия Тьюки, когда был обнаружен эффект лечения. Уровень отклонения гипотезы недействительности составил 5% (P ≤ 0,05). Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SAS (система статистического анализа, версия 9.3).

Результаты

В культуре in vitro g-ASC продемонстрировали высокую клеточность в течение 24 часов и жизнеспособность выше 95% (рис. 1A).Через пять дней наблюдались изолированные клетки веретенообразной морфологии, образующие монослой прикрепленных клеток (рис. 1B).

Рис. 1. Микрофотография культуры клеток g-ASCs, выделенной из подкожной жировой ткани коз.

(A) Стромальная фракция жировой ткани в культуральной среде DMEM-F12, 24 часа изоляции, 10 × 10. (B) Клетки с фибробластоидной морфологией, прикрепленной к пластику, пять дней, 10 × 10. (C) Клетки через 20 дней культивирования, 80% конфлюэнтности, 10 × 10. (D) Культура клеток g-ASC, после четырех дней оттаивания, 90% конфлюэнтности, 10 × 10.(E) Кривая роста (20 дней) g-ASC, культивируемых in vitro.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751.g001

Среда DMEM-F12 способствовала быстрому размножению клеток. Через 20 дней культура приобрела 80% -ное слияние и характерный фибробластоидный вид. Расширение культуры, достигающее 80%, позволило гомогенности клеточной популяции и поддержать индифференцировку (рис. 1C). После криоконсервации g-ASC сохраняли свою жизнеспособность, полностью слившись в течение пяти дней культивирования (рис. 1D).

Анализ кривой роста g-ASC показал, что они быстро размножаются, и представил очень короткую лаг-фазу, три дня. Фаза регистрации началась на четвертый день выращивания. С девятого дня пролиферация клеток увеличивалась с геометрической скоростью, что характеризует последовательные митотические деления. Фаза стабильности, плато, наблюдалась на тринадцатый и четырнадцатый день, непрерывно снижаясь в последующие дни. После достижения слияния клетки подвергались ингибированию роста (рис. 1E).

g-ASC продемонстрировали способность дифференцироваться в другие линии мезенхимальных клеток, доказав их пластичность. Хондрогенная дифференцировка показала, что g-ASC увеличивались в объеме и добавлялись, образуя четко выраженную клеточную массу, представляющую собой типичные сфероидные тела и начинающие синтезировать хрящевой матрикс (рис. 2D).

Рис. 2. Тесты дифференциации in vitro и фенотипические профили g-ASC с помощью проточной цитометрии.

(A, B, C) Контроли дифференциации: хондрогенный, остеогенный и адипогенный соответственно.(D) Предполагаемая совокупность хондробластических клеток с образованием сфероидных тел и отложением хрящевого матрикса, 10 × 20. (E) Остеобласты вокруг кальцинированного костного матрикса, окрашенные ализариновым красным 10 × 40. (F) Жировые клетки с внутриклеточным отложением липидов, окрашенных Oil Red O, 10 × 20. (G, H, I, J) Анализ экспрессии клеточных маркеров по скорости потока цитометрии. (G, H) Контрольные флуорохромы CD14, FITC и CD90, APC. (I, J) CD14, FITC и CD90, APC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751.g002

Остеогенная дифференцировка показала узелковые агрегаты клеток, образующие колонию клеток вокруг кальцинированного костного матрикса. Внеклеточный матрикс окрашивали ализариновым красным, подтверждая дифференцировку g-ASC в клетки остеогенного происхождения (рис. 2E). Таким образом, g-ASC при стимуляции in vitro претерпевают морфологические и функциональные изменения, давая начало другим типам зрелых клеток. Адипогенная дифференцировка характеризовалась наличием уплощенных морфологических клеток и была подтверждена маркировкой Oil Red O, потому что через 14 дней культивирования с адипогенной индуцирующей средой жировые капли наблюдались в цитоплазме клеток, а через 21 день — там. были дифференцировки в жировые клетки (рис. 2F).

Что касается фенотипического профиля g-ASC по данным проточной цитометрии, результаты продемонстрировали гетерогенность культуры, около 30% клеток экспрессировали CD90, индикатор мезенхимальных клеток. Что касается CD14, как и ожидалось, не было никакой маркировки, исключая возможность гематопоэтических клеток (рис. 2I и 2J).

Для характеристики мастита результаты бактериальной изоляции (таблица 2) показали, что изолированным микроорганизмом с наибольшей распространенностью был вид Staphylococcus , также были обнаружены грибы типа Candida Sp .Инфекции были двусторонними.

SCC коз показал соответствие с микробной изоляцией, представив значения выше 10 ⁶ во всех образцах.

При УЗИ наблюдали разницу между эхогенностью здоровой ткани молочной железы (рис. 3A и 3B) по сравнению с тканью с хроническим маститом (рис. 3C и 3D). Эта неоднородная экотекстура ткани молочной железы была подтверждена у всех животных с маститом. Воспаление вызвало изменения в эхогенности органов и произошла инволюция альвеол молочных желез (рис. 3C и 3D).В начале периода лактации после трансплантации g-ASC образовывались альвеолы ​​молочных желез (рис. 3E и 3F).

Рис. 3. Ультрасонографическое изображение молочной железы коз.

(A, B) (Группа CTR) Железа в фазе лактации, верхняя и нижняя, стрелки (альвеола молочной железы — белая стрелка, цистерна — желтая стрелка). (C, D) (Группа M-ASC) Молочная железа с хроническим маститом, инволютивными альвеолами (зеленая стрелка). (E, F) (Группа M + ASC) Молочная железа после трансплантации и ASC, начало лактации, с увеличением альвеолы ​​молочной железы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751.g003

Физико-химические параметры молока, представленные в таблице 3, показывают значительную разницу между группами (CTR, M-ASC и M + ASC) на твердое нежирное молоко в правой и левой железах; а также жир и температура в левой железе (таблицы S1 – S7).

Параметры сравнивали между группами с помощью теста Тьюки и показали, что в левой железе разница в количестве жира наблюдалась среди животных из M-ASC и M + ASC, также была разница в температуре между тремя экспериментальными группами.

При гистопатологической оценке были выявлены изменения в паренхиме молочных желез у животных, клинически пораженных маститом, до и после клеточной терапии, при этом основными поражениями были инфильтрация воспалительных клеток и фиброз, небольшое уменьшение которых наблюдалось после применения ASC. , хотя статистически значимой разницы не было. Полуколичественный анализ гистопатологических слайдов также демонстрирует снижение фиброза и интенсивности воспаления и увеличение пролиферации клеток (рис. 4).

Рис. 4. Гистопатологическая оценка перед инъекцией и после инъекции ASC в правую и левую молочные железы коз с хроническим маститом на основании параметров фиброза, инфильтрата воспалительных клеток и пролиферации клеток.

(таблицы S8 – S12).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751.g004

До терапии ASC изменения заключались в образцах с железой в процессе инволюции, с обилием соединительной ткани и уменьшением эпителиальных и альвеолярных областей (рис. 5B). ), хотя у животных фаза лактации.Фиброз характеризовался обилием междольковых и внутрилобулярных коллагеновых волокон (рис. 5C). Интерстициальная инфильтрация воспалительных клеток была смешанной, от легкой до тяжелой интенсивности, состоящей из лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов и редких нейтрофилов (рис. 5D и 5E). В образцах с тяжелым интерстициальным воспалением преобладающим типом клеток были лимфоциты (рис. 5E). В просвете некоторых акцино и протоков обнаружены нейтрофилы и клетки десквамации эпителия. Также наблюдалась дегенерация ацинарного эпителия.

Рис. 5. Паренхима молочной железы козы.

(A) Контроль, обычная железа в период лактации, TM (B) Хронический мастит, предварительное лечение ASC: пораженная молочная железа, соединительная ткань (звездочка), выводной проток (стрелка) H-E. (C) Внутридольковый фиброз (стрелка). (D) инфильтрат смешанных воспалительных клеток средней степени тяжести с преобладанием лимфоцитов, внутрилобулярным фиброзом и дезорганизацией ацинарного рисунка (острие стрелки) TM. (E) узор. хронический мастит, после лечения ASC: легкое смешанное интерстициальное воспаление, состоящее из лимфоцитов (стрелка), плазматических клеток (стрелка) и макрофагов (звездочка), H-E.(F) То же животное из D, уменьшение воспаления и внутрилобулярного фиброза, accini с обычным контуром accini, TM. (G) Внутрилобулярные протоки с секретом в просвете (стрелка). (H) нормальные секреторные альвеолы ​​в молочной железе, H-E.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751.g005

После клеточной терапии G-Ascs те же самые поражения визуализировались, однако в целом, с меньшей интенсивностью. Наблюдалось уменьшение фиброза с умеренной интенсивностью, с небольшим количеством внутрилобулярной соединительной ткани, акцино с правильным контуром и очевидным уменьшением воспалительных инфильтративных клеток (рис. 5F).Наблюдались образцы внутрилобулярных протоков с секрецией в просвете, а также пролиферация ацинарных и канальцевых эпителиальных клеток, которая варьировала от легкой до умеренной (рис. 5G), и образцы лактирующих желез с хорошо развитыми акцино (рис. 5H) помимо пролиферации. ацинарных и канальцевых эпителиальных клеток, которая варьировала от легкой до умеренной.

g-ASC были помечены Qdots и через 30 дней (фиг. 6) клеточной инъекции в молочную железу они были подвергнуты скринингу. Флуоресцентные сигналы визуализировали на образцах тканей, залитых в парафин ex vivo (Фиг.6B и 6C) и замороженных (Фиг.6E и 6F) под флуоресцентной микроскопией (BX41-OLYMPUS).G-ASC вводили в левую молочную железу, однако флуоресцентные признаки Q-точек были визуализированы в двух железах, подтверждая миграцию контралатеральных клеток. Нанокристаллические частицы оставались яркими в ткани при анализе, проведенном на предметных стеклах с 30, 60 и 90 днями подготовки.

Рис. 6. Микрофотография молочной железы коз без окрашивания после 30 дней терапии g-ASC.

(A) Парафинированная ткань без маркировки Qdot (контроль), 10 × 20.(B, C) Парафинат ткани правой молочной железы (без инъекции g-ASCS) и левой (с инъекцией g-ASCS), соответственно, 10×20. (D) Замороженная ткань без маркировки Qdot (контроль), 10 × 20. (E, F) Замороженная ткань правой молочной железы (без инъекции g-ASCS) и левой (с инъекцией g-ASC), соответственно, 10×20 .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223751.g006

Обсуждение

Жировая ткань оказалась важным источником стромальных клеток, малоинвазивным собиранием большого количества клеток.Эти клетки были первоначально получены Zuk et al. [29] и имеют благоприятные характеристики для клеточной терапии [12, 14, 15, 2, 8, 10, 11]. Эти преимущества были описаны при выделении, расширении и характеристике ASC у лошадей, людей и крыс [6, 13, 30, 8].

В первые два дня культивирования наблюдалась характерная гетерогенность первичной культуры. С 10-го дня культура становилась более однородной с преобладанием прикрепленных клеток, образуя монослой с удлиненной веретенообразной морфологией.Когда культура достигла 100% слияния, в этот момент из-за высокой клеточности с насыщением по плотности культура достигла предела, даже если среда была изменена на подачу питательных веществ, пространство является ограничивающим фактором, который может привести к гибели клеток. Согласно Dominici et al [31], это первый критерий для характеристики мезенхимальных стволовых клеток. Карвалью и др. получил такие же результаты на лошадях [32].

ASC демонстрируют способность к дифференцировке в остеогенных, хондрогенных и адипогенных линиях, что является еще одним важным требованием для их характеристики согласно Dominici et al.[31].

Отсутствие разметки для CD14 обнаруживается, когда оцениваемые клетки являются мезенхимальными, поскольку эти маркеры специфичны для гемопоэтических клеток [33]. Что касается экспрессии специфических маркеров мезенхимальных клеток, таких как CD90, популяция клеток экспрессировала 30% поверхностных маркеров, результаты показали гетерогенность популяции.

Что касается ультразвуковых изображений молочной железы до клеточной терапии, наблюдались изменения в эхогенности, связанные с маститом, показывающие разницу между здоровой тканью молочной железы и хроническим маститом, главным образом в отношении преобладания фиброзного твердого компонента.

Исследования на животных с маститом выявили структуры с различной эхогенностью, включая фиброз, внутрипросветные обструкции и атрезию, и могут характеризовать мастит [34]. Feliciano et al. [4] также смогли визуализировать изменения в молочной железе мелких животных, вызванные воспалением, с помощью ультразвуковых изображений.

После терапии наблюдались изменения в тканевой организации молочной железы, они относятся к началу развития альвеол молочной железы и наличию жидкости.

В левой молочной железе физико-химические результаты жира показали различия между группами (M-ASC и M + ASC) и по температурному параметру между тремя оцениваемыми группами. Это позволяет нам сделать вывод о прогрессе в функциональности железы (M + ASC), представляющем количество жира в пределах стандарта [35], у животных с хроническим маститом может наблюдаться увеличение средней концентрации жира. в молоке. Аналогичные результаты с повышенным содержанием жирных кислот во время инфекционных процессов мастита наблюдали Ogola et al.[36]. По словам Лейтнера и др. [37], этот более высокий процент жира у инфицированных животных объясняется уменьшением объема молока.

Важным аспектом, подтверждающим прогресс в функциональности железы, является то, что инъекция клеток была произведена в левую железу, и, хотя миграция произошла вправо, ее наблюдали, отслеживая отмеченные клетки с помощью Qdots, это Предполагается, что пул g-ASC в левой железе больше, чем в правой, поэтому лучший ответ на терапию при местной инъекции.Можно подчеркнуть, что жир является наиболее важным компонентом молока, но он также отличается большей вариабельностью [36].

Параметр MSNF показал значимый результат, в правой железе этот параметр включает все компоненты молока, кроме жира, таким образом, хотя белки и лактоза не показали статистической разницы, результат добавления этих компонентов был существенный. Zafalon et al. [38] указали, что изменения этого параметра связаны с вариациями содержания лактозы и молочного белка.

Лучшие результаты можно было бы получить при оценке физико-химического качества молока, если бы период анализа после терапии был более длительным, и, таким образом, для подтверждения более значительных функциональных изменений молочной железы.

Гистопатологический, ультрасонографический, проверка физико-химических параметров результатов молока, а также с учетом восстановления функции молочной железы животного, они показывают важный биологический результат в доклинических исследованиях терапии мезенхимальными клетками.Терапевтический потенциал этих клеток был подробно продемонстрирован в экспериментальных исследованиях регенерации мышечной атрофии [39], ишемии миокарда [40], заболевания печени [1], цирроза печени [41], регенерации ткани пародонта [42], поражений роговицы [ 43], ишемия [44] среди других, с различной эффективностью.

Согласно гистопатологическим данным, в ткань молочной железы были введены воспалительные клетки как в ацинусной, так и в интерстициальной ткани, а также в разрастание волокнистой соединительной ткани.Обычно это наблюдается при хроническом мастите, вызывающем дегенерацию эпителия молочных желез [45].

Согласно Чжао и Лакассе [46] изменения в ткани молочной железы изначально вызываются микроорганизмами. Бактерии продуцируют токсины, которые разрушают клеточные мембраны, вызывая повреждение ткани, производящей молоко, в то время как другие бактерии могут проникать в эпителий и размножаться в нем, прежде чем вызвать гибель клеток, и в этих обстоятельствах мастит характеризуется притоком соматических клеток. В этих условиях ацинусы и пораженные протоки начинают инвертироваться и прекращают секрецию молока [47].

Фиброз вызывается реакцией на хемотаксические факторы, выделяемые самими поврежденными клетками, поэтому окружающая соединительная ткань набухает, затем увеличивается в количестве и отложениях в перигландулярной и перидуктальной областях, таким образом облитерируя просвет, ацинусы и даже цистерну. васкуляризация молочной железы с продвижением фиброзной ткани нарушается, что способствует атрофии и нарушению функции железы [48].

После клеточной терапии воспалительный инфильтрат клеток все еще наблюдался, однако следует рассмотреть некоторые аспекты, чтобы понять результаты.30-дневного периода после терапии для наблюдения за морфологическими изменениями в ткани молочной железы, возможно, было недостаточно, чтобы продемонстрировать большую эволюцию в процессе восстановления железы.

Barreira et al. [49] при гистологической оценке поражений тендинита лошадей, обработанных мезенхимальными стволовыми клетками через 48 дней после индукции, обнаружили уменьшение воспаления с пролиферацией клеток, но возникла необходимость в увеличении периода оценки после терапии.

Таким образом, подтверждая результаты Barreira et al [49], считается, что процесс реорганизации ткани молочной железы не завершился полностью через 30 дней, но эти результаты являются удовлетворительными, с перспективами использования ASC в терапии. .Beheregaray et al [50] также оценили активность мезенхимальных стволовых клеток, применяемых в воспалительной и пролиферативной фазах заживления ран у мышей в течение семи дней, использование ASC увеличивало васкуляризацию, образование грануляционной ткани, отложение коллагена и увеличивало количество волосяные фолликулы всего за семь дней оценки, время нанесения клеток не повлияло на существенные различия в воспалительной и пролиферативной фазах заживления ран кожи.

Интенсивность пролиферации эпителиальных клеток в ткани молочной железы, связанная с хорошим состоянием здоровья животных с характерной морфологией молочной железы после терапии, являются важными показательными аспектами потенциального восстановления ткани.По словам Blanpain, Horsley, Fuchs [51], большинство эпителиальных тканей естественным образом обновляются в течение взрослого возраста из-за присутствия мультипотентных стволовых клеток, и с помощью инъекции ASC результаты многообещающие, что касается обновления и восстановления тканей.

На основании баллов, используемых для анализа характеристик фиброза, воспалительных инфильтратных клеток и клеточной пролиферации, изменения наблюдались до и после терапии. Рассматривая более описательный анализ, было замечено, что после терапии наблюдалась тенденция к снижению интенсивности фиброза и увеличению клеточной пролиферации, что характеризует процесс новообразования резидентной ткани (незрелой ткани молочной железы), развиваемой стволовыми клетками, не наблюдавшейся до клеточной терапия.

Оценка пролиферации клеток была связана с интенсивностью альвеолярного образования и организацией ткани молочной железы.

Введенные стволовые клетки высвобождают факторы роста и обладают иммуномодулирующей функцией, которая стимулирует резидентные клетки к прогрессу в клеточном цикле от G0 к G1 и от этого к S, что приводит к пролиферации клеток [15, 16]. Таким образом, вмешательство с инъекцией стволовых клеток при хроническом воспалении важно ограничить повреждение ткани, вызванное замещением паренхимы фиброзной тканью.

Маркировка g-ASC полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами (Qdots) для скрининга в клинических испытаниях терапии позволила преодолеть проблемы, связанные с традиционным окрашиванием, и дает возможность вводить эти наночастицы непосредственно внутрь живых клеток. Oliveira et al [52] и Rosen et al. [53] удовлетворительно использовали Qdots для маркировки и отслеживания ячеек. Он кажется подходящим для визуализации стволовых клеток, введенных в живые ткани, благодаря их фотостабильности и обозначению долговечности как в парафинированных, так и в замороженных тканях.Отмеченные g-ASC, введенные в левую молочную железу коз, мигрировали вправо, они были видны по-другому, с интенсивной яркостью в обеих железах. Маркировка Qdot стабильна, таким образом, маркировка не включается резидентными тканевыми клетками.

Заключение

Лечение коз с хроническим маститом стволовыми клетками, полученными из жировой ткани, восстановило молочную продуктивность с физико-химическими свойствами, подходящими для потребления человеком. Трансплантация стволовых клеток жировой ткани для восстановления ткани молочной железы при хроническом мастите возможна благодаря полученным физиологическим результатам, помимо того, что она потенциально безопасна для животных, без отторжения и поскольку это малоинвазивный метод.

Полученные результаты открывают новые перспективы лечения хронических заболеваний молочной железы молочных животных с учетом восстановления молочной продуктивности и возможного регенеративного потенциала стволовых клеток из жировой ткани. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше установить протокол для будущих клинических применений и прояснить все механизмы для улучшения результатов после терапии.

Точная идентификация субпопуляций ASC, участвующих в процессе репарации, — еще один важный вопрос, требующий изучения, чтобы узнать больше о биологии этих клеток и их терапевтическом применении.

Благодарности

Мы благодарим Интегрированное ядро ​​морфологии и исследований со стволовыми клетками и Лабораторию иммуногенетической клеточной биологии Федерального университета Пиауи за сотрудничество, предложенное в этой работе.

Ссылки

1. 1. Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, Chen CT, Shih YRV, Fang SCY и др. Терапия стволовыми клетками при заболеваниях печени: параметры, определяющие успех использования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Гастроэнтерология.2008; 134: 2111–21. pmid: 18455168
2. 2. Арнхольд С., Вениш С. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани, для восстановления опорно-двигательного аппарата в ветеринарии. Am J Stem Cells. 2015; 4: 1–12. pmid: 25973326
3. 3. Алнакип М.Э., Квинтела-Балуджа М, Боме К., Фернандес-Но I, Каамано-Антело С., Кало-Мата П. и др. Иммунология молочной железы молочных жвачных между здоровыми и воспалительными состояниями. J Vet Med. 2014; 2014: 1–31.
4. 4. Фелисиано МАР, Оливейра МЭФ, Висенте WRC.Ultrassonografia na Reprodução Animal. Med Vet. 2013; 24.
5. 5. Лопес К., Гарсия Дж. Дж., Сьерра М., Диез М. Дж., Перес С., Саагун А. М. и др. Системное распределение энрофлоксацина и молочных желез у здоровых овец после интрамаммарного введения. BMC Vet Res. 2015; 11: 1–7.
6. 6. Kingham PJ, Kalbermatten DF, Mahay D, Armstrong SJ, Wiberg M, Terenghi G. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, дифференцируются в фенотип шванновских клеток и способствуют росту нейритов in vitro.Exp Neurol. 2007; 207: 267–74. pmid: 17761164
7. 7. Lin G, Lin MG, Ning H, Banie L, Guo Y, Lue TF и ​​др. Определение стволовых клеток и клеток-предшественников в жировой ткани. Stem Cells Dev. 2008; 17: 1053–64. pmid: 18597617
8. 8. Томита К., Мадура Т., Сакаиа И., Яно К., Теренги Г., Хосокава К. Глиальная дифференцировка стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека: последствия для трансплантационной терапии на основе клеток. Неврология. 2013; 236: 55–65. pmid: 23370324
9. 9.Хасегава Т., Сакамото А., Вада А., Фукаи Т., Лида Н., Икеда С. Клетки-предшественники кератиноцитов находятся в подкожной жировой ткани человека. PLoS One. 2015; 10: e0118402. pmid: 25714344
10. 10. Hu R, Ling W, Xu W., Han D. Фибробластоподобные клетки, дифференцированные из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для заживления ран голосовых складок. PLoS One. 2014; 9: e92676. pmid: 24664167
11. 11. Сиван У, Джаякумар К., Кришнан Л.К. Построение ниши на основе фибрина для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жирового происхождения в кератиноциты in vitro.Биоресурсы в открытом доступе. 2014; 3: 339–47. pmid: 25469318
12. 12. Loebinger MR, Janes SN. Стволовая клетка при заболевании легких. Грудь. 2007; 132: 279–85. pmid: 17625088
13. 13. Freitas ALP. Экспериментальная модель получения жировой ткани, выделения мезенхимальных стволовых клеток и распределения в хирургических лоскутах у крыс. Acta Cir Bras. 2014; 29: 29–33.
14. 14. Кастейла Л., Планат-Бенар В., Лахарраг П., Кузен Б. Стромальные клетки, полученные из жировой ткани: их идентичность и использование в клинических испытаниях, обновление.Стволовые клетки мира J. 2011; 26 апреля; 3: 25–33. pmid: 21607134
15. 15. Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter H, Bieback K. Сравнительный анализ мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга, пуповинной крови или жировой ткани. Стволовые клетки. 2006; 24: 1294–301. pmid: 16410387
16. 16. Циммерлин Л., Донненберг В.С., Пфейфер М.Э., Мейер Е.М., По Б., Рубин Дж. П. и др. Предшественники стромальных сосудов в жировой ткани взрослого человека. Cytometry A. 2010; 77: 22–30. pmid: 19852056
17. 17.Ren Y, Wu H, Zhou X, Wen J, Jin M, Cang M и др. Выделение, размножение и дифференциация стволовых клеток, полученных из козьего жира. Res Vet Sci. 2012; 93: 404–11. pmid: 21945802
18. 18. Ди Марино AM, Каплан AI, Бонфилд TL. Мезенхимальные стволовые клетки в восстановлении тканей. Фронт Иммунол. 2013; 4: 201. pmid: 24027567
19. 19. Алвес ЭГЛ, Серакидес Р., Росадо И.Р., Боэлони Дж. Н., Окарино Н.М., Резенде CMF. Isolamento e cultivo de Células Tronco Mesenquimais extraídas do tecido adiposo e da medula óssea de cães.Бюстгальтеры Cienc Anim. 2017; 18: 1–14.
20. 20. Raposio E, Bertozzi N, Bonomini S, Bernuzzi G, Formentini A, Grignaffini E, et al. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, добавляют в богатую тромбоцитами плазму для лечения хронических язв кожи. Раны. 2016; 28: 126–131. pmid: 27071140
21. 21. Oh JH, Chung SW, Kim SH, Chung JY, Kim JY. Премия Нира: Эффект стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для улучшения жировой дегенерации и заживления вращающей манжеты на модели кролика. J Shoulder Elbow Surg.2014; 22: 35–36.
22. 22. Yan Y, Ma T, Gong K, Ao Q, Zhang X, Gong Y. Транстонтация мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани способствует нейрогенезу взрослых в мозге мышей с болезнью Альцгеймера. Neural Regen Res. 2014; 9: 798–805. pmid: 25206892
23. 23. Шальм О.В., Норландер Д.Д. Эксперименты и наблюдения, приведшие к разработке Калифорнийского теста на мастит. J Am Vet Med Assoc, 1957; 130: 199–204. pmid: 13416088
24. 24. Куинн П.Дж., Картер М.Э., Марки Б.Клиническая ветеринарная микробиология. 1-е изд. Лондон: Вулф; 1994.
25. 25. Бауэр А.В., Кирби В.М., Шерис С.К., Терк М. Тестирование чувствительности к антибиотикам стандартным методом с одним диском. Am J Clin Pathol. 1966; 45: 493–96. pmid: 5325707
26. 26. Camperio C, Armas F, Biasibetti E, Frassanito P, Giovannelli C, Spuria L et al. Модель мастита у мышей для изучения эффектов интрамаммарной инфузии пищевого штамма Lactococcus lactis. PlosOne. 2017; 12: 9.
27. 27. Ribeiro SDA. Caprinocultura: criação racional de caprinos. Сан-Паулу: Нобель, 1998. 318p
28. 28. Каруана Г., Бертоцци Н., Боски Е., Пио Гриеко М., Гриннаффини Е., Рапозио Е. Роль стволовых клеток, полученных из жировой ткани, в заживлении хронических кожных ран. Ann Ital Chir. 2015; 86: 1–4. pmid: 25818696
29. 29. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, Ugarte DAD, Huang JI, Mizuno H, et al. Жировая ткань человека является источником мультипотенциальных стволовых клеток. Mol Biol Cell.2002; 13: 4279–95. pmid: 12475952
30. 30. Видор С.Б., Террачано П.Б., Валенте Ф.С., Ролим В.М., Куль С.П., Эйрес Л.С. и др. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, улучшают трансплантаты кожи на всю толщину на модели крыс. Res Vet Sci. 2018; 28: 336–344.
31. 31. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS и др. Минимальные критерии для определения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Заявление о позиции международного общества целлюлярной терапии. Цитотерапия.2006; 8: 315–17. pmid: 16923606
32. 32. Карвалью А.М., Алвес А.Л.Г., Голим М.А., Мороз А.А., Хусни К.А., Оливейра П.Г.Г. и др. Выделение и иммунофенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани лошадей. Vet Immunol Immunopathol. 2009; 132: 303–06. pmid: 19647331
33. 33. Бакопулу А., Папахристоу Э., Буснаки М., Хаджихристу С., Контонасаки Э., Теохариду А. и др. Матрицы дентина, обработанные человеком, в сочетании с биокерамическими каркасами на основе цинка и магния и стволовыми клетками пульпы зуба человека для целевой регенерации дентина.Dent Mater. 2015; 32: 159–75.
34. 34. Рамбабу К., Маккена Срину Р.В., Суреш К., Рао TSC. Ультрасонография вымени и сосков буйволов. Буффало Бык. 2009; 28: 5–10.
35. 35. Фошьера Дж. Л. [Молочная промышленность, индустриализация молока, анализ, производство молочных продуктов] Издатель: Suliani Editografia Ltda, Porto Alegre-RS, 2004.
36. 36. Огола Х., Шитанди А., Нануа Дж. Влияние маститов на состав молока. J Vet Sci. 2007; 8: 237–242.pmid: 17679769
37. 37. Leitner G, Chaffer M, Caraso Y, Ezra E, Kababea D., Winkler M, et al. Инфекция вымени и количество соматических клеток в молоке, активность NAGase и состав молока (жир, белок и лактоза) у израильских овец Ассаф и Авасси. Исследования мелких жвачных животных. 2003; 49: 157–164.
38. 38. Зафалон Л.Ф., Надер Филхо А., Карвалью MRB, Лима ТМА. [Влияние субклинического мастита крупного рогатого скота на белковые фракции молока.] Arq Inst Biol. 2008; 75: 135–140.
39. 39.Ким MJ, Ким ZH, Ким SM, Чой Ю.С. Кондиционированная среда, полученная из мезенхимальных стволовых клеток пуповины, регенерирует атрофированные мышцы. Тканевая клетка. 2016; 48: 533–543. pmid: 27457384
40. 40. Ямагути С., Сибата Р., Ямамото Н., Нисикава М., Хиби Н., Танигава Т. и др. Кондиционированная среда, полученная из стволовых клеток пульпы зуба, уменьшает повреждение сердца после ишемии-реперфузии. Sci Rep.2015; 5: 16295. pmid: 26542315
41. 41. Санг В., Ли Б., Ли К., Лу Ю. Терапевтическая эффективность и безопасность трансплантации мезенхимальных стволовых клеток пуповины при циррозе печени в китайской популяции: метаанализ.Клин Рес Гепатол Гастроэнтерол. 2018; 48: 193–204.
42. 42. Yu X, Ge S, Chen S, Xu Q, Zhang J, Guo H и др. Мезенхимальные стромальные клетки человека, происходящие из десны, способствуют регенерации пародонта у гончих собак. Клетки Тканевые Органы. 2013; 198: 428–437. pmid: 24777155
43. 43. Holan V, Trosan P, Cejka C, Javorkova E, Zajicova A, Hermankova B, et al. Сравнительное исследование терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток и лимбальных эпителиальных стволовых клеток для реконструкции поверхности глаза.Стволовые клетки Transl Med. 2015; 4: 1052–63. pmid: 26185258
44. 44. Кадзигучи М., Кондо Т., Идзава Х., Кобаяси М., Ямамото К., Синтани С. и др. Безопасность и эффективность трансплантации аутологичных клеток-предшественников для терапевтического ангиогенеза у пациентов с критической ишемией конечностей. Circ J. 2007; 71: 196–201. pmid: 17251666
45. 45. Кастро-Алонсо А., Родригес Ф., Де ла Фе С., Эспиноза де Лос Монтерос Дж., Поведа Дж. Б., Андрада М., Херрас П. Корреляция иммунного ответа с клинико-патологическим течением стойкого мастита, экспериментально вызванного Mycoplasma agalactiae у молочных коз.Исследования в области ветеринарии. 2009; 86: 274–280. pmid: 18703207
46. 46. Чжао X, Лакасс П. Повреждение ткани молочной железы при мастите крупного рогатого скота: причины и меры борьбы. J Anim Sci. 2008; 86: 57–65.
47. 47. Эль-Махди ММ, Фатма МД, Омния FHB, Ид РА. Патологические, бактериологические и паразитологические исследования поражений лимфатических узлов крупного рогатого скота. Egypt J Comp & Clinic Path. 2002; 15: 47–67.
48. 48. Томас Л.Х., Хайдер В., Хилл А.В., Кук Р.С. Патологические данные экспериментально индуцированной инфекции Streptococcus uberis в молочной железе коров.Am J Vet Res. 1994; 55: 1723–1728. pmid: 7887517
49. 49. Barreira APB, Alves ALG, Salto ME, Arnorint RL, Kohayagawa A, Menarim BC, et al. Аутологичный имплант мононуклеарных клеток костного мозга как лечение индуцированного тендинита лошадей. Междунар. J Appl Res Vet Med. 2008; 6: 46–54.
50. 50. Бехерегарай В.К., Джанотти Г.К., Оливейра Ф., Террачано П., Бьянки С., Видор С. и др. Мезенхимальные стволовые клетки применяются в воспалительной и пролиферативной фазах заживления ран.Arq Bras Med Vet Zootec. 2017; 69: 1591–1600.
51. 51. Blanpain C, Horsley V, Fuchs E. Эпителиальные стволовые клетки: новые листья. Клетка. 2007; 28: 445–458.
52. 52. Oliveira DM, Almeida BO, Marti LC, Sibov TT, Pavo LF, Malheiros DMAC и др. Маркировка мезенхимальных стволовых клеток человека квантовыми точками позволяет отслеживать трансплантированные клетки, привитые в инфарктное сердце свиньи. Эйнштейн. 2009. 7: 284–289.
53. 53. Rosen AB, Kelly DJ, Schuldt AJT, Potapova IA, Doronin SV, Robichaud KJ, et al.Поиск флуоресцентных игл в сердечном стоге сена: отслеживание мезенхимальных стволовых клеток человека, меченных квантовыми точками, для количественного анализа трехмерной флуоресценции in vivo. Стволовая клетка. 2007; 25: 2128–2138.

Острый мастит — обзор

Микробиом груди

Ткань груди имеет собственный микробиом. ³¹ Недавно были проведены исследования, изучающие, существует ли бактериальная популяция в нормальной неинфицированной груди и изменяется ли микробиом ткани у женщин с инфекцией или раком. ^30,32,33 Неудивительно, что оба верны. Исследователи обнаружили большее количество бактерий, способных вызывать повреждение ДНК, и меньшее количество Lactobacillus у пациентов с раком груди. ³¹ Helicobacter pylori, , известный инициатор образования канцерогенов, был обнаружен в образцах грудного молока 4/66. ³⁴ Есть свидетельства того, что некоторые бактерии «создают подходящую микросреду для роста опухолевых клеток». ³⁵

Грудь является одной из тканей, «открытых» для окружающей среды у женщин (как и носоглотка, шейка матки и мочевой пузырь), поэтому нет ничего удивительного в обнаружении бактерий и вирусов (а иногда и паразитов). ) в воздуховодах.Однако его микробиом отличается от кишечника, рта или вышележащей кожи. В настоящее время считается, что мастит возникает из-за дисбактериоза или дисбаланса микробиома груди, а не из-за простого вторжения бактерий. ³⁶ Острый мастит вызывается патологическими организмами (обычно стафилококком или стрептококком). Чаще всего это происходит в начале грудного вскармливания, когда ранее неиспользуемые протоки должны расширяться, а ацинусы и дольки должны сокращаться и выводить молозиво и вырабатываемое молоко. (Этот ранний риск может быть частично причиной того, что молозиво состоит в основном из иммунных клеток и иммуноглобулинов.) Острый мастит часто не лечится и проходит спонтанно. В тяжелых случаях обычно лечат пероральными антибиотиками. Недавно было показано, что острый мастит можно лечить с помощью перорального биотика pro , содержащего Lactobacillus salivarius CECT 5713 или Lactobacillus gasseri CECT 5714. Без какого-либо другого лечения, кроме продолжения кормления грудью, группа пробиотиков полностью вылечилась. 14 дней. ³⁷ Во втором исследовании сравнивали Lactobacillus fermentum CECT 5716 и L.salivarius CECT 5713 с антибиотиками. Группы пробиотиков показали как значительное снижение патогенных бактерий в молоке, так и лучшее уменьшение боли по сравнению с антибиотиками. ³⁸ Другое исследование предотвратило мастит путем предварительной обработки L. salivarius на поздних сроках беременности. ³⁹ Как оральные пробиотики попадают в грудь? Это может быть то же самое, что и микробиом груди: через иммунные клетки из кишечника, которые переносят живые бактерии через кровоток в ECM и доставляют их в просвет ацинусов и протоков. ³⁵ Завершая петлю связи между микробиомом груди и фиброзно-кистозными изменениями, лечение H. pylori в кишечнике оказалось успешным в разрешении симптомов FCC в груди. ³²

Гораздо менее распространенное заболевание, «мастит плазматических клеток» ⁴⁰ , как полагают, вызвано хроническим раздражением протоков секреторными продуктами, которые могут вызывать аутоиммунную реакцию с инфильтрацией плазматических клеток. ⁴¹ Поскольку это чаще всего наблюдается у повторнородящих женщин, это может быть иммунная реакция на антигены, наблюдаемая в предыдущих эпизодах лактации.Известно, что свободные жирные кислоты вызывают заметную воспалительную реакцию при травме груди, имитируя рак в виде твердой спикулированной массы с микрокальцификациями на маммограмме. Макрофаги, нагруженные жиром, отличают его микроскопический вид от рака (что также считается отклонением процесса заживления примерно на ⁴² ).

Эти «открытые» каналы для внешнего мира (ротоглотка, шейка матки, прямая кишка / задний проход и мочевой пузырь / простата) защищены локально увеличенными лимфатическими сосудами; метаплазией пограничного эпителия; по йоду ⁴³ ; а в груди — лактопероксидазой, лизоцимом и рядом белков, секретируемых с молоком. ⁴⁴ Дисбиоз груди, как и кишечника, ⁴⁵ является вероятным источником воспалительных сигналов ³² , которые могут вызывать изменения фибробластов внеклеточного матрикса, ^18,46 вызывая как фиброзно-кистозные изменения, так и потенциально рак . Поскольку фиброз (реакция ткани на воспаление) почти повсеместно обнаруживается в груди (если верить исследованиям вскрытия), похоже, что фиброзно-кистозные изменения являются нормальной или, по крайней мере, общей реакцией на степень воспаления в окружающей среде.

Существует ряд дополнительных защитных механизмов для предотвращения проникновения инфекции извне в организм через систему протоков. Концы протоков у соска часто закупорены слущенными эпителиальными клетками, образующими пробку. При удалении грудным младенцем или во время секса более вероятно проникновение бактерий полости рта и изменение микробиома. Свойства молока (лактоферрин, лейкоциты [лейкоциты], различные йодсодержащие белки и иммуноглобулины) действуют как антибактериальные агенты в протоках и в вырабатываемом молоке.Если это не удается, инфекция протока может вызвать окислительный стресс, повреждение тканей, рубцевание протока и, в конечном итоге, кисты и фиброз.

Металлопротеиназы при идиопатическом фиброзе легких

Реферат

В этой статье мы описываем текущее состояние знаний о балансе между производством коллагена и его деградацией при идиопатическом фиброзе легких (IPF). Нарушение регуляции действия металлопротеиназ, участвующих в IPF, может играть центральную роль в патогенезе IPF.Следовательно, ингибирование металлопротеиназ в IPF может иметь терапевтический потенциал, но наши знания об их патофизиологической роли сдерживаются ограниченными моделями на животных и отсутствием специфических ингибиторов.

ФИБРОЗ ЛЕГКИХ: РАЗЛИЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ С ФИБРОТИЧЕСКИМ КОНЕЧНЫМ ТОЧКОМ

Диффузное интерстициальное заболевание легких (ILD) характеризуется различной степенью воспаления и фиброза, что приводит к нарушению газообменных единиц легкого. Отличительным признаком этих заболеваний является аномальное отложение коллагена.Многие ILD имеют известную этиологию, , т.е. , воздействие органических (, например, легкое фермера) или неорганических (, например, асбестоз) частиц, вызванных лекарственными средствами (, например, амиодарон), или связанных с ревматологическим заболеванием, таким как системный склероз. и ревматоидный артрит. Около половины ILD имеют неизвестную этиологию и классифицируются как идиопатические интерстициальные пневмонии [1]. Безусловно, наиболее распространенным является идиопатический фиброз легких (IPF), прогноз которого хуже, чем у многих видов рака.

Текущие данные свидетельствуют о том, что IPF является результатом аномальной реакции на неустановленное в настоящее время повреждение альвеолярного эпителия. Теории предполагают, что IPF является результатом аномального заживления ран в ответ на множественные микроскопические участки повреждения и активации альвеолярных эпителиальных клеток (рис. 1). Считается, что это приводит к постоянно аномальному восстановлению эпителия, которое способствует пролиферации фибробластов, создавая сеть активированных фибробластов и коллагена, которая постепенно реструктурирует архитектуру легких [2].В дополнение к этому наблюдается усиление апоптоза эпителиальных клеток и их потеря, особенно в непосредственной близости от очагов фибробластов. При IPF аберрантно активированные альвеолярные эпителиальные клетки синтезируют почти все, если не все, медиаторы, которые провоцируют и поддерживают фиброзную реакцию, вероятно, посредством двунаправленной аберрантной связи между эпителиальными и мезенхимальными клетками [3]. Клетки фибробластного типа возникают также за счет привлечения фиброцитов из кровообращения и, возможно, в процессе эпителиально-мезенхимальной трансформации [4].

Механизмы интерстициального фиброза легких (ИПФ). Этиология IPF не установлена. Предполагается, что все, что запускает IPF, приводит к повреждению эпителия и что последующая активация эпителия приводит к основным чертам обычной интерстициальной пневмонии (UIP), а именно хаотическому восстановлению эпителия, пролиферации фибробластов и отложению коллагена, которые становятся самовоспроизводящимися.

Помимо образования очага миофибробластов и повреждения эпителиальных клеток, существуют различные свидетельства воспаления, о чем свидетельствуют увеличение количества макрофагов и нейтрофилов [5], внутриальвеолярная коагулопатия [6] и образование новых кровеносных сосудов в легком IPF [5]. 7].Кроме того, аномальный ангиогенез был связан с развитием фиброзных заболеваний легких [7]. Вместе эти изменения приводят к увеличению проницаемости альвеолярного капиллярного барьера, что может быть обнаружено клинически по увеличению клиренса диэтилентриаминпентауксусной кислоты [8]. Повышенная проницаемость альвеолярного капиллярного барьера также может быть связана с ранней смертностью при ИЛФ [9].

Следовательно, существуют по крайней мере два различных клеточных пути — воспалительный путь, представленный большинством ILD, и эпителиальный путь, как видно из IPF, — которые приводят к развитию фиброза легких [10].В этой статье мы сосредоточимся на важности металлопротеиназ в патофизиологии IPF.

КОЛЛАГЕН И ПАТОФИЗИОЛОГИЯ IPF

Существует много различных видов коллагена, но типы I и III преобладают как в здоровых, так и в фиброзных легких [11]. Фибриллярные коллагены секретируются в виде растворимых предшественников (несущих пропептиды с большим удлинением как на амино, так и на карбоксильных концах), которые самоассоциируются с образованием нерастворимых фибрилл с тройной спиралью. Конформация тройной спирали фибрилл коллагена делает молекулу устойчивой к протеолитической атаке со стороны большинства ферментов, за исключением металлопротеиназ, биология которых была изложена в первой статье этой серии [12].

Существуют убедительные доказательства того, что выработка коллагена как I, так и III типа увеличивается при IPF. В большинстве исследований, посвященных продукции типа I или III, изучались карбоксиконцевые пропептиды проколлагена (PICP и PIIICP, соответственно). Они использовались в качестве суррогатных маркеров увеличения выработки коллагена, поскольку сам коллаген нерастворим и поэтому не может быть взят пробы напрямую без инвазивной биопсии.

При IPF было обнаружено, что как PICP, так и PIIICP повышены в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF), но не в сыворотке крови пациентов.Уровни PICP в ЖБАЛ и жидкости эпителиальной выстилки имели значительную отрицательную корреляцию с диффузионной способностью легких по монооксиду углерода на единицу альвеолярного объема [13]. В иммуногистохимических исследованиях или исследованиях in situ мРНК на легочной ткани, коллаген типа III преобладает в утолщенных альвеолярных перегородках и интерстиции, тогда как коллаген типа I, по-видимому, является основным коллагеном на более поздних стадиях течения заболевания [14]. Проколлаген I типа в основном присутствует в виде внутриклеточных пятен во вновь образованном фиброзе при обычной интерстициальной пневмонии (UIP), в то время как проколлаген типа III экспрессируется внеклеточно под метапластическим альвеолярным эпителием [15].Также присутствует увеличение других составляющих внеклеточного матрикса, включая коллагены V, VI и VII типов, фибронектин, эластин и протеогликаны [10].

ДЕГРАДАЦИОННАЯ СРЕДА В ILD

Повышенный уровень продукции проколлагена не обязательно означает повышенное отложение коллагена, поскольку деградация коллагена — это динамический процесс, регулируемый матриксными металлопротеиназами (ММП) и их ингибиторами. Чтобы оценить, откладывается ли чистый коллаген в легких, также необходима некоторая оценка деградации коллагена.

Несколько ранних исследований указали на аномалии деградации коллагена в фиброзном легком. В 1979 г., используя зимографические методы, Gadek et al. [16] продемонстрировал повышенную активность коллагеназы в гомогенатах легких у 15 из 21 пациентов с IPF, но ни у одного из нормальных контролей или пациентов с саркоидозом. Напротив, существуют доказательства того, что коллагенолиз снижается при гиперчувствительном пневмоните, экспериментальном силикозе и индуцированном блеомицином легочном фиброзе у животных [17].Кроме того, иммуногистохимические исследования продемонстрировали высокие уровни экспрессии тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП) в легком IPF. ТИМП-1 был обнаружен в интерстициальных макрофагах, а ТИМП-2 — в очагах фибробластов. ТИМП-3 выявил интенсивное окрашивание, в основном украшающее эластичную пластинку сосудов. ТИМП-4 экспрессировался в легких IPF эпителиальными и плазматическими клетками [18]. Дополнительно Montano и др. . [19] обнаружили, что активность ингибирования коллагеназы была намного выше в образцах биопсии от пациентов с IPF и гиперчувствительным пневмонитом, чем в образцах от контрольных субъектов.Учитывая, что фибробласты, происходящие из легочной ткани IPF, экспрессируют профибротический секреторный фенотип (сниженная коллагеназа и повышенная экспрессия TIMP), эти ранние исследования показали, что при ILD может преобладать нерасщепляющееся фибриллярное микроокружение коллагена [18–20].

В то время как изначально предполагалось, что дефект коллагенолиза ведет к избыточному отложению внеклеточного матрикса при фиброзе легких, сейчас эта точка зрения кажется чрезмерно упрощенной. В нескольких исследованиях было высказано предположение, что в IPF наблюдается увеличение количества ММП, а не их потеря (рис.2) [9]. Сообщалось о повышенных уровнях MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8 и MMP-9. MMP-12 и MMP-13 также участвовали в экспериментальном фиброзе. Здесь обсуждаются их роли и потенциальное значение.

Уровни матричной металлопротеиназы (ММП) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), выраженные в виде диаграммы разброса. Данные BALF были объединены из исходной и последующей бронхоскопии (n = 28). График разброса показывает, что большая часть белка MMP BALF представляет собой MMP-7, MMP-8 и MMP-9.Уровни MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8 и MMP-9 в ЖБАЛ были значительно повышены по сравнению с нормальным контролем. Воспроизведено из [9].

ММП-1

MMP-1 был повышен в некоторых, но не во всех исследованиях BALF у пациентов с IPF, при этом одно исследование также показало повышенные уровни в плазме [9, 21]. Данные микроматрицы предполагают, что мРНК MMP-1 значительно повышена в цельной легочной ткани пациентов с IPF по сравнению с гиперчувствительным пневмонитом [22], а также в нормальном контрольном легком [23].Экспрессия MMP-1 также выше у пациентов с семейным заболеванием по сравнению со спорадической IPF [24]. Интересно, что полиморфизм промотора гена MMP-1 чаще встречается у курильщиков с IPF, что свидетельствует о предполагаемом взаимодействии генов с окружающей средой при этом заболевании [25].

Наблюдение, что MMP-1 активируется в IPF, состоянии, связанном с накоплением коллагена как I, так и III типа, на первый взгляд парадоксально, особенно потому, что оно также было вовлечено в патогенез хронической обструктивной болезни легких, при которой потеря эластичной ткани — это особенность.Одно из возможных объяснений состоит в том, что экспрессия MMP-1 происходит в первую очередь в реактивном эпителии, а не в интерстициальном компартменте, где накапливается коллаген [10]. Альтернативно, активность MMP-1 может уравновешиваться тканевыми ингибиторами, что приводит к только слабой активности. Однако биологические роли MMP-1, помимо деградации коллагена, включают процессинг цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF) -α, регуляцию миграции клеток и, возможно, рост клеток [26].Эти множественные биологические функции MMP-1, наряду с клиническими данными, предполагают важную роль в патогенезе IPF.

ММП-2

MMP-2 (желатиназа A) широко экспрессируется в фиброзных легких, особенно в областях гиперпластических эпителиальных клеток, покрывающих внутриальвеолярный фиброз, а также мезенхимальными клетками в очагах фибробластов [18]. Сообщалось, что в ЖБАЛ MMP-2 повышен, но в другом исследовании вестерн-блоттинг для активного MMP-2 показал только слабую активность (особенно по сравнению с облитерирующим бронхиолитом, организующим пневмонию (BOOP)) [9, 27].MMP-2 разрушает широкий спектр матричных и нематричных субстратов, особенно коллаген IV типа и другие белки базальной мембраны. Кроме того, MMP-2 обычно активируется в экспериментальных моделях фиброза легких, и предполагается, что его сверхэкспрессия, так же как и MMP-9, участвует в разрушении базальной мембраны [28]. Это может быть важно, потому что структурная целостность альвеолярной стенки зависит от базальной мембраны, и известно, что разрушение субэпителиальной базальной мембраны может предшествовать развитию альвеолярного фиброза.Разрыв базальной мембраны потенциально обеспечивает больший доступ экссудативных факторов и интерстициальных клеток к альвеолярному пространству, способствуя дальнейшему разрушению тканей и прогрессирующему фиброзу [9, 29].

ММП-3

Уровни MMP-3 (стромелизина 1) повышены в ЖБАЛ у пациентов с ИЛФ и наблюдались выше у тех, кто умер в течение 3 лет после постановки диагноза [9]. MMP-3 может быть важным фактором фиброза, поскольку экспрессия MMP-3 в эпителиальных клетках трансгенных мышей стимулирует развитие фиброза и последующее образование опухоли.Дальнейшее воздействие MMP-3 на эпителиальные клетки молочных желез вызывает эпителиально-мезенхимальный переход, при котором клетки приобретают миофибробластоподобные характеристики, и этот процесс зависит от генерации клеточных активных форм кислорода. Данные культуральных моделей, в которых MMPs индуцибельно экспрессируются в линиях клеток легких человека, и моделей трансгенных мышей, в которых MMPs индуцибельно экспрессируются в альвеолярных эпителиальных клетках легких, предполагают, что аналогичные процессы, вероятно, происходят в легких [30, 31].MMP-3 также участвует в высвобождении антиангиогенных продуктов распада коллагена, таких как эндостатин, которые могут способствовать апоптозу альвеолярного эпителия, который, как полагают, является важным фактором продолжающегося фиброза [32, 33].

ММП-7

MMP-7, также известный как матрилизин, считается одним из генов, наиболее часто повышенных в фиброзных легких. Экспрессия MMP-7 не различается между семейной и спорадической IPF [34, 35]. В легких IPF повышенный иммунореактивный белок экспрессируется в основном аномальным альвеолярным эпителием, а активный белок был продемонстрирован зимографией тканей в легких IPF [34].В BALF уровни MMP-7 связаны с тяжестью нарушения функции легких при IPF [9]. Недавно также было показано, что повышенные уровни MMP-7 также могут быть обнаружены при неспецифической интерстициальной пневмонии и саркоидозе [36], предполагая, что повышенная экспрессия MMP-7 не специфична для IPF.

ММР-7 описана как профибротическая металлопротеиназа [10]. Некоторые направления исследований предполагают, что MMP-7 может способствовать фиброзному ответу посредством регулирующего воздействия на восстановление эпителия и высвобождение латентного трансформирующего фактора роста (TGF) -β.MMP-7 нулевые мыши относительно защищены от индуцированного блеомицином фиброза, что позволяет предположить, что эта MMP является центральным драйвером тканевого ответа при фиброзе. ММП-7 имеет широкое сродство к субстрату с компонентами внеклеточного матрикса, включая коллаген IV типа, ламинин, фибронектин, желатин, эластин и остеопонтин. MMP-7 также обладает способностью обрабатывать многочисленные биоактивные субстраты, такие как лиганд Fas (FasL), β ₄ -интегрин, E-кадгерин, про-TNF-α, про-α-дефенсин, эндостатин, синдекан и α _{. 2} -макроглобулин.MMP-7 может также активировать протеазы, в том числе про-MMP-1, про-MMP-2 и про-MMP-9. Высвобождение предварительно сформированного TGF-β из внеклеточного матрикса с помощью MMP-7 является основным регулятором биоактивности TGF, который может способствовать росту фибробластов, выживанию и синтезу коллагена. Таким образом, роль MMP-7 в легочном фиброзе, вероятно, является плейотропной из-за своей разнообразной биологической роли, связанной с апоптозом, воспалением, фибропролиферацией и врожденным иммунитетом [10].

ММП-8

ММР-8 (коллагеназа-2 или нейтрофильная коллагеназа) происходит из нейтрофилов и, в меньшей степени, из фибробластов, эндотелиальных, эпителиальных и плазматических клеток.Уровни MMP-8 повышены в ЖБАЛ от пациентов с ИЛФ и коррелируют с коллагенолитической способностью ЖБАЛ [37]. Уровни MMP-8 в ЖБАЛ у пациентов с IPF наиболее высоки у пациентов с быстро прогрессирующим заболеванием и плохой выживаемостью, а альвеолярные уровни не снижаются при комбинированной терапии (преднизолон, азатиоприн и N -ацетилцистеин (NAC)) [9]. Таким образом, повышенные уровни MMP-8, по-видимому, связаны с неблагоприятным исходом при IPF.

Нейтрофильный альвеолит характерен для пациентов с ИЛФ, и степень нейтрофилии в ЖБАЛ была связана со смертностью в одной большой серии исследований [5], поэтому интересно предположить, что нейтрофилия управляет обновлением матрикса через MMP-8, при по крайней мере у некоторых пациентов.Альтернативно, MMP-8 участвует в миграции и возвращении фиброцитов. Фиброциты представляют собой уникальные мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга, которые определяются характеристиками их роста и поверхностным фенотипом, поскольку они экспрессируют маркеры, совместимые с лейкоцитами, гематопоэтическими клетками-предшественниками и фибробластами. Фиброциты были обнаружены в легких у пациентов с IPF, а уровни циркулирующих фиброцитов являются маркером плохого прогноза при IPF [38, 39]. Ослабление движения фиброцитов на моделях мышей также напрямую коррелирует со снижением легочного фиброза.Очевидно, что потенциально важная роль, которую MMP-8 может играть в этом очевидно важном процессе, требует дальнейшего изучения.

ММП-9

MMP-9 (желатиназа B) широко изучалась у пациентов с IPF, где она преимущественно экспрессируется альвеолярными макрофагами, нейтрофилами и эпителиальными клетками. В нормальном легком MMP-9 не продуцируется резидентными клетками, но при различных формах стимуляции эпителиальные клетки бронхов, клетки Клары, альвеолярные клетки типа II, фибробласты, клетки гладких мышц и эндотелиальные клетки могут продуцировать MMP-9 [40] .Было обнаружено, что экспрессия гена и белка MMP-9 повышена как при фиброзе легких у человека, так и при экспериментальном фиброзе легких [41, 42]. Фибробласты и альвеолярные макрофаги, извлеченные из легких пациента с IPF, продуцировали повышенное содержание MMP-9 по сравнению с нормальными клетками [19, 41].

Уровни MMP-9 в ЖБАЛ и активность MMP-9 наиболее высоки в образцах из быстро прогрессирующих случаев IPF [9, 43]. Неизвестно, является ли повышение уровня MMP-9 маркером активированных нейтрофилов или связано с повреждением альвеол у этой подгруппы пациентов.Однако повышение уровня MMP-9 в ЖБАЛ у пациентов с BOOP превышает таковое при IPF [44], что предполагает связь с нейтрофилами, а не с гистологией легких.

Исследования на животных с использованием мышей с нокаутом MMP-9 показывают некоторые противоречивые результаты о роли этой металлопротеиназы. После установки блеомицина у MMP-9-нулевых мышей развивается фиброз, аналогичный тому, который развивается у животных дикого типа, хотя в легких мышей с дефицитом MMP-9 наблюдается минимальная альвеолярная бронхиолизация, что свидетельствует о том, что MMP-9 облегчает миграцию клеток Clara. и другие бронхиолярные клетки в области повреждения альвеол [45].С другой стороны, было показано, что сверхэкспрессия ММР-9 в макрофагах ослабляет фиброз, вызванный блеомицином [46]. Снижение уровня профибротических медиаторов, таких как TIMP-1 и белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP) -3, у трансгенных мышей MMP-9 был идентифицирован как потенциальный механизм ослабления фиброзного ответа. Эти данные трудно согласовать, но они предполагают, что MMP-9 может способствовать или уменьшать фиброзный ответ. Кажется вероятным, что общий ответ зависит от того, какая клетка продуцирует ММР-9, местных уровней тканевого ингибитора и доступных целевых молекул / субстратов.

ММП-12

MMP-12 (эластаза макрофагов) участвовал в фиброзном ответе в исследованиях фиброза на животных с использованием FasL. У мышей, получавших Fas-активирующее антитело, повышалась активация каспазы-3 в клетках альвеолярной стенки и повышалось общее содержание коллагена в легких на 21 день после воздействия. Профили экспрессии генов показали последовательную активацию совместно регулируемых профибротических генов, включая заметную активацию MMP-12. Нацеленная делеция MMP-12 защищала мышей от Fas-индуцированного легочного фиброза, даже несмотря на то, что воспалительные реакции в легких были аналогичны таковым у мышей дикого типа [47].

Данных об уровнях или экспрессии MMP-12 у пациентов с IPF немного. В одном небольшом исследовании MMP-12 был обнаружен только в BALF у трех из 18 пациентов с IPF и составлял только 0,022% от общих уровней MMP IPF BALF, по данным Luminex array [48]. Важно понимать, что уровни MMP-12 в ЖБАЛ не обязательно четко отражают тканевые уровни из-за сложной регуляции MMP местными ингибиторами. Таким образом, текущие данные не подтверждают четкую роль MMP-12 в фиброзе легких человека, связанном с IPF.

ММП-13

MMP-13 был вовлечен в тяжесть воспаления и фиброза при экспериментальном повреждении легких, вызванном асбестом, наряду с MMP-2, MMP-9 и MMP-12. Использование общего ингибитора ММП, GM6001, уменьшало как воспаление, так и степень фиброзной реакции [49]. Мыши с нокаутом MMP-13 также уменьшали острое воспаление и фиброз при воздействии радиации [50].

Напротив, при фиброзе легких, индуцированном у крыс паракватом и гипероксией, Ruiz et al .[28] продемонстрировали снижение уровня коллагеназ MMP-8 и MMP-13 с увеличением TIMP-1 и TGF-β. Таким образом, аналогично результатам на животных моделях MMP-9, описанных ранее, результаты для MMP-13 противоречивы. Мало что известно о роли MMP-13 в IPF человека, хотя MMP-13 не обнаруживается в IPF BALF (Д. Р. Тикетт, неопубликованные наблюдения). Эти данные подтверждаются иммуногистохимией и ОТ-ПЦР легких IPF [18].

МЕМБРАННЫЕ И ДРУГИЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ В IPF

Подмножество MMPs, мембранного типа (MT) -MMPs, участвует в активации про-MMP-2 с образованием MMP-2.Было показано, что эти MT-MMP присутствуют в легочной ткани IPF. MT1-MMP и MT2-MMP были обнаружены в альвеолярных эпителиальных клетках, MT3-MMP в фибробластах из фибробластных очагов и альвеолярных эпителиальных клетках, а MT5-MMP в базальных бронхиолярных эпителиальных клетках и в областях плоской метаплазии. В фибробластах легких TGF-β1 индуцировал сильную активацию MT3-MMP как на уровне гена, так и на уровне белка [51].

Растущее разнообразие известной биологии ММП означает, что многие потенциально важные ММП остаются плохо изученными в IPF.Например, исследования микроматриц предполагают повышенное содержание ММР-10 и ММР-28 в ткани IPF, но их клеточные источники, субстраты и функция плохо охарактеризованы. MMP-28 может представлять особый интерес, поскольку предполагается, что он играет роль в эпителиальной мезенхимальной трансформации и протеолитическом расщеплении TGF-β [52]. Дальнейшая работа по разъяснению важности этих новых MMP продолжается.

ВЛИЯНИЕ ТЕКУЩЕГО ЛЕЧЕНИЯ IPF НА ЭКСПРЕССИЮ ММП В ЛЕГКОМ

Текущее лечение IPF остается неудовлетворительным, и имеется мало доказательств того, что фиброз, наблюдаемый в картине UIP при биопсии легкого, когда-либо регрессирует с лечением.Однако недавнее исследование показало, что лечение преднизолоном, азатиоприном и NAC замедляет прогрессирование [25], но неясно, снижает ли это лечение аберрантный обмен коллагена. Единственное исследование, посвященное уровням ММП до и после лечения у одного и того же человека, продемонстрировало, что комбинированная лекарственная терапия не оказывает никакого подавляющего действия на иммунореактивность ММП ЖБАЛ [9]. Это несмотря на тот факт, что предыдущее исследование показало, что лечение стероидами снижает продукцию MMP-9 у пациентов с IPF [26]; однако в этом исследовании пациенты не изучались индивидуально последовательно до и после лечения.

Пирфенидон — новый антифибротический агент, который, как было показано, снижает отложение коллагена на различных моделях животных in vivo . Испытания на пациентах с IPF [53] показывают, что он снижает скорость снижения функции легких, что привело к недавней рекомендации Европейского агентства по лекарственным средствам лицензировать пирфенидон для использования в IPF в Европе. Хотя механизм действия пирфенидона остается неясным, несколько опубликованных доклинических исследований предполагают, что может иметь место модуляция активности ММП.В модели фиброза печени антифибротический эффект пирфенидона в основном был обусловлен сниженной экспрессией проколлагена и TIMP-1, скорее всего, за счет подавления мРНК TGF-β1 и MMP-2 [54]. У мышей, которым вводили интратрахеальный липополисахарид, пирфенидон снижает MMP-9 из-за снижения рекрутирования нейтрофилов [55], тогда как низкие дозы пирфенидона подавляют TGF-β1 и TIMP-1 и защищают крыс от фиброза легких, вызванного блеомицином, но не влияют на экспрессия MMP-13 [56].

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ КАК БИОМАРКЕРЫ В IPF

Обнаружение повышенных уровней металлопротеиназ в легких IPF и сообщенная связь с серьезностью снижения функции легких или прогрессирующего заболевания на BALF вызвали интерес к вопросу о том, есть ли потенциал для MMP в качестве панели биомаркеров для использования при IPF.Биомаркер BALF имел бы ограниченное применение, учитывая логистику бронхоальвеолярного лаважа, различные эффекты разведения и широкую биологическую вариабельность индивидуальных уровней ММП.

Недавно панель из 49 белков плазмы была измерена в плазме пациентов с IPF, чтобы определить сигнатуру из пяти белков, которая отличала пациентов от контроля. MMP-7 и MMP-1, два белка плазмы, уровни которых были наиболее увеличены у пациентов с IPF по сравнению с контролем, были ключевыми компонентами этой сигнатуры (MMP-7, MMP-1, MMP-8, IGFBP1 и член суперсемейства рецепторов TNF 1А).Панели было достаточно, чтобы отличить пациентов от контроля с чувствительностью 98,6%. Эти результаты были дополнительно подтверждены в когорте пациентов с ИЛФ, семейным фиброзом легких и субклиническими интерстициальными заболеваниями легких, а также в контрольной группе пациентов, прошедших независимую валидацию [57]. Учитывая, что эти белки плазмы можно измерить в одном анализе Luminex, эта панель маркеров имеет некоторый потенциал, особенно потому, что уровни были повышены у пациентов с субклиническим заболеванием, идентифицированным с помощью компьютерной томографии высокого разрешения.Однако о связи между этой панелью и прогрессированием заболевания не сообщалось. В клинической практике нам нужен больше биомаркер активности заболевания, чем диагностическая панель.

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ КАК ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ЦЕЛИ В IPF

Повышение активности ММП при раке и воспалительных заболеваниях сделало их привлекательными мишенями для разработки лекарств за последние 20 лет. Можно ли ожидать, что ингибиторы ММП будут эффективны у пациентов с ИЛФ, у которых избыточное отложение коллагена является характерным патологическим признаком?

Растущее признание сложности биологических функций металлопротеиназ с точки зрения заживления ран, ангиогенеза и их эффектов на высвобождение цитокинов, хемокинов и факторов роста предполагает, что существует возможность ингибирования модулировать аберрантное ремоделирование альвеол, наблюдаемое при IPF.Индуцированный блеомицином легочный фиброз ослабляется неспецифическим ингибитором ММП антибиотиком доксициклином [58]. Это действие связано с уменьшением легочного воспаления и снижением активности ММП в ЖБАЛ [59]. Кроме того, небольшое открытое исследование терапии доксициклином у семи пациентов с IPF не зафиксировало какого-либо снижения форсированной жизненной емкости легких, несмотря на> 17 месяцев ежедневного использования доксициклина. Такое отсутствие прогрессирования было бы необычным для типичной когорты пациентов с IPF, но качество исследования не позволяет сделать какие-либо выводы об эффективности терапии доксициклином у пациентов с IPF [60].

Энтузиазм по поводу ингибирования металлопротеиназы должен быть сдержан неудачей ранних испытаний с использованием ингибиторов широкого спектра действия при раке, а также опасениями по поводу потенциальных побочных эффектов, которые терапевтическое уменьшение деградации коллагена может иметь при фиброзирующем заболевании. В идеале ингибиторы ММП для использования в IPF должны обладать специфичностью для отдельных MMP. Поэтому перед исследователями в этой области стоит задача определить, является ли какой-либо отдельный MMP ключевым механистическим драйвером IPF.Такой работе препятствует использование таких моделей, как повреждение, вызванное блеомицином, которые не могут правильно моделировать заболевание человека [61].

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

IPF — разрушительное заболевание, и текущая / новая терапия неудовлетворительна из-за токсичности и ограниченной эффективности. Современные теории патогенеза IPF предполагают, что повреждение альвеолярного эпителия провоцирует миграцию и пролиферацию мезенхимальных клеток с образованием фибробластных очагов. Патологически это приводит к участкам чрезмерного отложения коллагена в некоторых частях легких с потерей эпителиальных структур и образованием сот.Несмотря на наблюдаемое прогрессирующее рубцевание, появились доказательства увеличения выработки металлопротеиназ. Роль этих ферментов в настоящее время неясна, поскольку они оказывают плейотропное действие как на внеклеточный матрикс, так и на процессинг хемокинов, цитокинов и факторов роста. Следовательно, возможно, что усиленная деградация матрикса является механистической движущей силой прогрессирующего фиброза при IPF. Исследования в этой области затруднены из-за отсутствия хороших моделей IPF на животных, но лучшее понимание патофизиологии IPF и обмена коллагена должно выявить новые терапевтические цели для этого разрушительного заболевания.

Сноски

• Предыдущие статьи в этой серии: No. 1: Löffek S, Schilling O, Franzke C-W. Биологическая роль матриксных металлопротеиназ: критический баланс. Eur Respir J 2011; 38: 191–208. No. 2: Elkington PT, Ugarte-Gil CA, Friedland JS. Матричные металлопротеиназы при туберкулезе. Eur Respir J 2011; 38: 456–464. No. 3: Gaggar A, Hector A, Bratcher PE, et al. Роль матриксных металлопротеиназ при муковисцидозе легких. Eur Respir J 2011; 38: 721–727. № 4: Дэйви А., Маколи Д.Ф., О’Кейн К.М. Матричные металлопротеиназы при остром повреждении легких: медиаторы повреждения и факторы восстановления. Eur Respir J 2011; 38: 959–970. No. 5: Vandenbroucke RE, Dejonckheere R, Libert C. Терапевтическая роль ингибиторов матриксной металлопротеиназы при заболеваниях легких? Eur Respir J 2011; 38: 1200–1214.

• Заявление о заинтересованности

  Заявление о заинтересованности для D.Р. Тикетта можно найти на сайте www.erj.ersjournals.com/site/misc/statements.xhtml

• Получено 9 февраля 2011 г.
• Принято 30 апреля 2011 г.

Артесунат подавляет пролиферацию эпителиальных клеток путем подавления сигнальных путей NF-κB и AKT у крыс с доброкачественной гиперплазией молочной железы — Li

Введение

Гиперплазия — доброкачественное заболевание молочной железы, которое обычно клинически скрыто. Клинические проявления гиперплазии молочной железы неспецифичны, включая боль и локальное уплотнение.Как правило, гиперплазия чаще всего встречается у женщин в возрасте> 35 лет, и ее можно обнаружить у женщин всех возрастных групп (1). Хотя доброкачественная гиперплазия не является злокачественным новообразованием, она разделяет ряд активированных сигналов с раком груди. Кроме того, как и в большинстве случаев рака, доброкачественный эпителий молочной железы постоянно растет; не было обнаружено эффективных агентов, которые могут контролировать пролиферацию клеток, и обычно показано хирургическое лечение. Дисбаланс уровней гормонов и аномальная экспрессия рецепторов гормонов в тканях молочной железы являются основными причинами гиперплазии молочной железы, вызывая аномальную активацию клеточной сигнализации и вызывая пролиферацию клеток (1).

Артесунат (АРТ) является важным производным артемизинина, и его метаболит дигидроартемизинин чаще всего используется при лечении малярии (2). В последние годы соответствующие исследования показали, что АРТ оказывает определенное влияние на лечение опухолей (3). Его механизм в основном включает апоптоз опухолевых клеток, антииммуносупрессию, опосредованное железом образование свободных радикалов, блокировку клеточного цикла, антиангиогенез (4), изменение лекарственной устойчивости и восстановление химиочувствительности (5,6). В настоящее время проводится большое количество исследований противоопухолевой активности АРТ.Ли и др. обнаружил, что АРТ может воздействовать на карциному носоглотки, ингибируя путь AKT / mTOR (7). Xiao et al. также обнаружил, что АРТ может лечить плоскоклеточный рак ротовой полости путем ингибирования AKT (8). Кроме того, было продемонстрировано, что АРТ регулирует ядерный фактор-κB NF-κB (9), а также имеет потенциал в лечении рака груди (10). Однако применение АРТ для лечения гиперплазии груди еще не изучалось.

Хотя гиперплазия молочной железы не является воспалительным заболеванием, постоянно растущая масса обычно вызывает боль при отеке и покалывание в исходном месте.Некоторые пациенты могут даже страдать от зуда и жара в груди. Предполагается, что циклооксигеназа-2 (ЦОГ-2) вырабатывает простагландины, которые могут вызывать жар, боль и воспаление (11). Исследования Visscher et al. подтвердили, что ЦОГ-2 связан с пролиферацией клеток груди (12) и риском рака груди (13). Кроме того, NF-κB влияет на провоспалительные сигнальные пути, регулируя гены COX-2 (14). Brantley et al. подтвердил, что NF-κB играет важную роль в регуляции пролиферации, ветвления и поддержания нормальной эпителиальной структуры эпителия молочных желез (15).Однако вопрос о том, имеет ли NF-κB потенциальную ценность в лечении гиперплазии груди, все еще требует дальнейшего изучения.

Протеинкиназа B или Rac, теперь известная как AKT, участвует в NF-κB и регулирует биологические процессы в опухолях (16,17) и является разновидностью серин / треонин-протеинкиназы (18,19). Он рекрутируется на плазматическую мембрану как неактивный цитозольный белок. Кроме того, AKT может быть активирован посредством фосфорилирования серина 473 и треонина 308 в ответ на цитокины или факторы роста через фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP ₃ ) и фосфатидилинозитол-3-киназный (PI3K) путь (20).Фосфорилированный AKT блокирует некоторые проапоптотические белки, такие как Bcl-2-ассоциированный агонист клеточной смерти (Bad) и Bcl-2-ассоциированный X-белок (Bax) (21). Более того, подавление апоптоза, вызванного AKT, может подавлять гиперплазию молочных желез (22).

Это исследование было направлено на изучение влияния АРТ на пролиферацию эпителиальных клеток груди in vitro и in vivo .

Мы представляем следующую статью в соответствии с контрольным списком отчетов ARRIVE (доступен по адресу http: // dx.doi.org/10.21037/atm-21-1447).

Методы

Культивирование и лечение клеток

Иммортализованные нераковые эпителиальные клетки молочной железы человека (MCF-10A), приобретенные из Американской коллекции типовых культур (ATCC) (стандарты LGC, Миддлсекс, Великобритания), культивировали с использованием модифицированных Дульбекко. Среда Игла (DMEM) 1640 (без фенолового красного) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5% стрептомицина и 0,5% пенициллина в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% CO ₂ при 37 ° C.Чтобы определить влияние АРТ на индуцированную эстрадиолом пролиферацию груди, клетки голодали, используя среду DMEM 1640, не содержащую FBS, в течение 24 часов и обрабатывали эстрадиолом в течение различных периодов времени либо с АРТ, либо без нее.

Химические вещества и антитела

Антитела против ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), COX-2, pNF-κB, NF-κB, AKT, pAKT и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) были предоставлены Santa Cruz Biotechnology (Даллас) , Техас, США). АРТ была предоставлена ​​медицинской группой Куньмин (Куньмин, YN, Китай).Эстрадиол был приобретен у Tocris Bioscience (Миннеаполис, Миннесота, США). Остальные антитела, используемые в данной работе, были предоставлены компанией Cell Signaling Technology (Данверс, Массачусетс, США).

Животные

Мы создали модель гиперплазии молочной железы на крысах. Всего 12 крыс были разделены на 4 группы по 3 крысы в ​​каждой группе. В группе А крысам вводили физиологический раствор (0,1 мг / кг) один раз в день в течение 30 дней. В группе B крысам вводили физиологический раствор (0.л мг / кг) и АРТ 1 раз в сутки в течение 30 дней. В группе C бензоат эстрадиола (0,5 мг / кг) вводили внутримышечно один раз в день в течение 25 дней, а затем внутримышечно вводили прогестерон (4 мг / кг) один раз в день в течение 5 дней. В группе D бензоат эстрадиола (0,5 мг / кг) вводили внутримышечно один раз в день в течение 25 дней, а затем прогестерон (4 мг / кг) вводили внутримышечно один раз в день в течение 5 дней. АРТ вводили внутримышечно в течение 30 дней, один раз в день в одно и то же время. Ткани молочной железы были взяты через 1 месяц после вмешательства для последующих анализов.Крыс содержали в утвержденном помещении для содержания животных. Исследователи не знали о групповом распределении. Эксперименты проводились в соответствии с лицензией на проект (№: JDF-IRB-2014036302), предоставленной Комитетом по уходу и использованию животных больницы Дунфан Пекинского университета китайской медицины, в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных.

Вестерн-блоттинг

Буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) использовали для лизиса клеток и тканей, и анализ вестерн-блоттингом проводили в соответствии с предыдущим описанием (4).Клетки сначала инкубировали с первичными антителами против GAPDH (1: 10 000, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) или COX-2 (1: 500, R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США), а затем инкубировали с белком хрена. (HRP) -конъюгированные вторичные антитела против мыши или кролика (1: 5,000, ICN Amersham Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси, США). Для визуализации использовалась система усиленной хемилюминесценции (Amersham Pharmacia).

Окрашивание по Массону и иммуногистохимия (ИГХ)

Собранные ткани молочной железы фиксировали нейтральным забуференным формалином и разрезали на 5 мкм срезы.Были выполнены гистопатологическое окрашивание, окрашивание трихромом по Массону и анализ ИГХ. Затем срезы блокировали с использованием кроличьей сыворотки (амфирегулин) или козьей сыворотки (СОХ-2 и EP2). Анти-коллаген I, анти-коллаген III и анти-COX-2 (Cayman Chemical, R&D Systems) добавляли для инкубации. Позже для проявления цвета были добавлены 3,3V-диаминобензидин (DAB) и комплексный реагент Vectastain авидин-биотин.

Денситометрический анализ

Полуколичественный анализ различных белков был выполнен ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).Интенсивность полосы (плотность) определялась на основе значения пикселя полосы и площади. Количественные результаты были представлены в виде отношения целевого белка к контролю нагрузки (домашний белок).

Статистические методы

Для статистического анализа использовалось программное обеспечение SPSS 22.0 (IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США). Значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение (m ± SD) и проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Тест Тьюки использовался для сравнения нескольких средних значений, а тест Стьюдента t использовался для определения неоднородности 2 групп.Значения P <0,05 указывают на статистическую значимость.

Результаты

ART блокирует пролиферацию и воспаление эпителиальных клеток молочной железы

Учитывая, что пролиферация и воспаление часто связаны с гиперплазией молочной железы, мы протестировали уровни экспрессии COX-2 и PCNA в клетках MCF-10A. Эпителиальные клетки подвергали воздействию фосфатно-солевого буфера (PBS), 100, 200 и 400 мкМ ART в среде для культивирования 10% сыворотки. Как показано на фигуре 1A , , лечение ART снижало экспрессию COX-2 и PCNA дозозависимым образом, и наиболее заметный эффект снижения наблюдался при 400 мкМ (фигура 1B , C , ЦОГ-2: 400 vs. 0 мкМ = 0,82 против 3,42, P <0,001; PCNA: 400 против 0 мкМ = 1,99 против 2,85, P <0,05).

Рисунок 1 ART подавляет пролиферацию клеток и воспаление в эпителиальных клетках молочной железы. (A) Типичные полосы вестерн-блоттинга COX-2 и PCNA при различных концентрациях ART (0, 100, 200, 400 мкМ) в течение 36 часов. (B) Статистические результаты экспрессии СОХ-2 при различных концентрациях АРТ (0, 100, 200, 400 мкМ) в течение 36 часов. (C) Статистические результаты экспрессии PCNA при различных концентрациях ART (0, 100, 200, 400 мкМ) в течение 36 часов.Каждый белок был количественно определен в соответствии с денситометрией и нормализован на основе GAPDH. Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 6). * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001 по сравнению с ART = 0. АРТ, артесунат; ЦОГ-2, циклооксигеназа-2; PCNA, ядерный антиген пролиферирующих клеток; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; SD, стандартное отклонение.

ART ослабляет фосфорилирование NF-κB, индуцированное эстрадиолом в MCF-10A

Эстрадиол может вызывать гиперплазию груди, и пути AKT и NFκB играют важную роль.Кроме того, AKT и NFκB также могут регулироваться АРТ. Чтобы дополнительно подтвердить действие и механизм АРТ на гиперплазию молочной железы, вызванную эстрадиолом, мы обработали клетки MCF-10A эстрадиолом и АРТ. Как показано на фиг. 2A , , , низкие уровни экспрессии COX-2 и PCNA были обнаружены в контрольной группе, в то время как обработка эстрадиолом значительно повышала уровни экспрессии этих белков. Введение АРТ подавляло экспрессию белка дозозависимым образом, и 200 мкМ давали наиболее очевидное ингибирование (, рис. 2В, C , COX-2: 200 vs. 0 мкМ против Контроль = 1,56 против 6,32 против 1,04, P <0,001; PCNA: 200 против 0 мкМ против Контроль = 2,18 против 4,72 против 1,01, P <0,001). Обработка эстрадиолом увеличивала фосфорилирование NF-κB, которое подавлялось 200 мкМ ART (, фиг. 2D, ). Более того, АРТ уменьшала активацию путей NF-κB в эпителиальных клетках молочной железы ( Рисунок 2E , pNF-κB: 200 vs. 0 мкМ vs. Контроль = 1,48 против 5,74 против 1,01, P <0,001).

Рис. 2 ART подавляет фосфорилирование NF-κB в вызванном эстрадиолом MCF-10A. (A) Типичные полосы вестерн-блоттинга COX-2 и PCNA при эстрадиоле и различных концентрациях ART (0, 50, 100, 200 мкМ) в течение 24 часов. (B) Статистические результаты экспрессии СОХ-2 при эстрадиоле и различных концентрациях АРТ (0, 50, 100, 200 мкМ) в течение 24 часов. (C) Статистические результаты экспрессии PCNA при эстрадиоле и различных концентрациях АРТ (0, 50, 100, 200 мкМ) в течение 24 часов.(D) Типичные полосы вестерн-блоттинга pNF-κB и NF-κB при эстрадиоле и различных концентрациях АРТ (0, 50, 100, 200 мкМ) в течение 24 часов. (E) Статистические результаты экспрессии pNF-κB и NF-κB при эстрадиоле и различных концентрациях АРТ (0, 50, 100, 200 мкМ) в течение 24 часов. Каждый белок был количественно определен в соответствии с денситометрией и нормализован на основе GAPDH. Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 6). * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001 по сравнению с АРТ и эстрадиолом. NF-κB, ядерный фактор-каппа B; MCF-10A, иммортализованный нераковый эпителиальный слой молочной железы человека; АРТ, артесунат; ЦОГ-2, циклооксигеназа-2; PCNA, ядерный антиген пролиферирующих клеток; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; SD, стандартное отклонение.

АРТ снижает пролиферацию клеток и фиброз при эстрадиол-индуцированной гиперплазии молочной железы

Чтобы определить влияние АРТ на гиперплазию молочной железы in vivo, мы создали модель гиперплазии молочной железы на животных с использованием крыс. Мы впервые подтвердили, что экспрессия ЦОГ -2 был значительно увеличен в модели гиперплазии молочной железы крыс (MGH), в то время как лечение АРТ снижало экспрессию COX-2 на 50% ( Рисунок 3A, B , COX-2: NC + физиологический раствор vs. NC + ART против MGH + физиологический раствор против MGH + ART = 1,07 против 0,62 против 6,92 против 3,46, P <0,001). Затем мы исследовали уровни экспрессии Bax в тканях молочной железы. Уровень Bax значительно снижается при гиперплазии груди. Было показано, что АРТ может обратить вспять экспрессию Bax (, фиг. 3A, C ).

Рис. 3 ART ослабляет пролиферацию и гиперплазию гиперпластической груди.(A) Типичные полосы вестерн-блоттинга COX-2 и Bax молочных желез в каждой группе. (B) Статистические результаты экспрессии СОХ-2 в молочных железах в каждой группе. (C) Статистические результаты экспрессии PCNA молочных желез в каждой группе. (D) Результаты окрашивания по Массону молочных желез в каждой группе. (E) Результаты окрашивания IHC-COX-2 молочных желез в каждой группе. (F) Результаты окрашивания молочных желез IHC-Col-1 в каждой группе. (G) Результаты окрашивания молочных желез IHC-Col-2 в каждой группе. Каждый белок был количественно определен в соответствии с денситометрией и нормализован на основе GAPDH.Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 6). * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001. Bax, белок X, связанный с Bcl-2; NF-κB, ядерный фактор-каппа B; АРТ, артесунат; ИГХ, иммуногистохимический; ЦОГ-2, циклооксигеназа-2; PCNA, ядерный антиген пролиферирующих клеток; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; SD, стандартное отклонение.

Синие фибриллы в основном присутствовали в интерстициальных канальцах молочной железы, согласно результатам трихром-положительного окрашивания по Массону. Как правило, гиперплазия протока, сопровождающая циркулярные изменения, служит отличительным признаком, отличающим от обычного и диффузного увеличения и округления ядер при гормональной терапии (указана черная стрелка).Количество фибрилл заметно увеличивалось в ткани груди у крыс с гиперплазией молочной железы и уменьшалось после введения АРТ (, фиг. 3D, ). Полуколичественный анализ ИГХ показал, что площадь ЦОГ-2 в канальцах молочной железы увеличилась примерно в 8 раз по сравнению с контрольными тканями молочной железы; кроме того, введение АРТ значительно подавляло экспрессию ЦОГ-2 до 50% ( Рисунок 3E , NC против MGH против MGH + ART = 1,09 vs. 3,90 по сравнению с 2,23, P <0,01). Чтобы изучить влияние АРТ на накопление внеклеточного белка после введения эстрадиола и прогестерона, уровни экспрессии коллагена I и III были определены с помощью ИГХ. Согласно фиг. , фиг. 3F, G , , , базовая экспрессия коллагена I и III была обнаружена в контрольной группе, и они были существенно повышены после лечения эстрадиолом и прогестероном. Лечение АРТ значительно изменило уровни экспрессии коллагена I и III (Col-1: NC vs. MGH vs. MGH + ART = 1,07 vs. 3.38 vs. 2.03, P <0,05; Столбец 3: NC против MGH против MGH + ART = 1,10 против 4,36 против 1,92, P <0,05).

АРТ ингибирует фосфорилирование AKT и NF-κB при гиперплазии молочной железы

Вышеупомянутые эксперименты подтвердили, что АРТ может подавлять индуцированную эстрадиолом гиперплазию груди как in vitro, , так и in vivo. Для дальнейшего изучения механизма этого явления мы исследовали экспрессию AKT и NF-κB в молочных железах крыс в каждой группе.Как показано на фиг.4A, B, C , , фосфорилированные белки AKT и NF-κB незначительно экспрессировались в ткани молочной железы, обработанной PBS, с / без лечения АРТ, и уровни их экспрессии повышались при гиперплазии молочной железы, вызванной эстрадиол и прогестерон. Однако введение АРТ ингибировало индуцированное эстрадиолом фосфорилирование AKT молочной железы и NF-κB. Кроме того, ни гормон, ни лечение АРТ не влияли на уровни экспрессии общего AKT и общего NF-κB.

Рис. 4 ART подавляло фосфорилирование AKT и NF-κB отдельно в гиперпластической груди.(A) Типичные полосы вестерн-блоттинга NF-κB, pNF-κB, AKT и pAKT молочных желез в каждой группе. (B) Статистические результаты pNF-κB / NF-κB молочных желез в каждой группе. (C) Статистические результаты pAKT / AKT молочных желез в каждой группе. Каждый белок был количественно определен в соответствии с денситометрией и нормализован на основе GAPDH. Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 6). ** P <0,01 и *** P <0,001. NF-κB, ядерный фактор-каппа B; АРТ, артесунат; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; SD, стандартное отклонение.

Обсуждение

Доброкачественная гиперплазия груди — это заболевание груди, вызванное чрезмерным разрастанием тканей молочной железы. По оценкам, 8 из 10 женщин подвержены этому заболеванию. Гормональный дисбаланс считается независимым риском гиперплазии молочной железы и способствует развитию и прогрессированию боли в груди. Чрезмерное образование железистой ткани и эпителия в груди — типичный патологический признак. Хотя АРТ эффективна для подавления экспрессии ЦОГ-2, а также пролиферации и миграции клеток рака молочной железы, ее роль в доброкачественной гиперплазии молочной железы остается неизвестной.В этом исследовании мы продемонстрировали, что АРТ блокирует передачу сигналов AKT и NF-κB и ингибирует пролиферацию в гиперпластической молочной железе. Введение АРТ также ослабляло интерстициальный фиброз молочных канальцев и внеклеточное отложение у крыс с гиперплазией молочных желез. Эти данные позволяют предположить, что АРТ является потенциальным ингибитором гиперплазии груди.

Несколько китайских пациентов с гиперплазией молочной железы хорошо осведомлены о потенциальных побочных эффектах синтетических лекарств. В результате они предпочитают альтернативные методы лечения, такие как традиционная китайская медицина.Препарат АРТ представляет собой разновидность противомалярийного средства, выделенного из растения полынь полынная Artemisia Annua . Производное ART, сесквитерпеновый лактон (соединение, состоящее из 3 единиц изопрена, связанных с циклическими органическими сложными эфирами), получают путем дистилляции цветков Artemisia Annua или высушенных листьев (23). Это растение обладает жаропонижающими (жаропонижающими) эффектами, которые были первоначально обнаружены в 4 веке нашей эры китайскими врачами, и это растение затем называлось Цинхао и использовалось как естественное средство под названием чай Цинхао.С одной стороны, средство Цинхао обычно используется для лечения малярии и геморроя. С другой стороны, было доказано, что АРТ подавляет различные виды рака, включая рак груди (24). Простагландин E ₂ (PGE2) служит индикатором боли, а также является основным эйкозаноидом, продуцируемым посредством пути COX-2 в молочной железе (25). ЦОГ-2 играет жизненно важную роль в развитии груди на ранней стадии (26). Инъекция эстрадиола вызывает сверхэкспрессию ЦОГ-2, что, в свою очередь, вызывает гиперплазию молочных желез у людей и мышей.Хотя считается, что повышенное развитие эпителиальных клеток молочной железы связано с гиперплазией молочной железы, обсуждается вопрос о том, является ли это воспалительным заболеванием. Наши результаты показали значительное увеличение экспрессии ЦОГ-2 в груди самок крыс, вызванной чрезмерным воздействием гормонов. Механизм, лежащий в основе гиперактивации воспалительной передачи сигналов, способствующей гиперплазии молочных желез, требует дальнейшего изучения. Использовали нормальную линию эпителиальных клеток молочной железы человека, которая показала, что чрезмерная обработка эстрадиолом резко увеличивает пролиферацию клеток в красной среде, не содержащей фенола.Между тем, ингибирование активации NF-κB в молочных железах у мышей приводило к снижению лобулоальвеолярной пролиферации во время беременности (27), а между тем повышение активности NF-κB приводило к гиперплазии молочной железы in vivo (1) . Наши результаты показали, что АРТ подавляет активность передачи сигналов NF-κB in vitro (, фиг. 2, ). Дополнительные анализы in vivo показали, что экспрессия pNF-κB была значительно увеличена у крыс с гиперплазией молочной железы, получавших эстроген, по сравнению с нормальным контролем (, фиг. 3, ).В заключение, результаты этого исследования позволили предположить, что АРТ подавляет фосфорилирование NF-κB, уменьшая пролиферацию клеток и подавляя гиперплазию молочных желез. Тем не менее, NF-κB служит многофункциональным фактором транскрипции, и путь передачи сигналов NF-κB перекрестно взаимодействует с множеством других путей в регуляции гиперплазии молочных желез. Необходимы дополнительные эксперименты, чтобы проиллюстрировать подробные механизмы АРТ в облегчении гиперплазии молочных желез.

Было показано, что путь PI3K / AKT играет роль в регуляции генеза опухоли.PI3K служит важным регулятором активации AKT, многие киназы и стимулы (например, эстроген) могут способствовать пролиферации сигнального пути AKT. В результате активируется путь AKT, что в конечном итоге способствует выживанию и росту клеток. Мутационная активация и амплификация компонентов пути AKT участвуют в патогенных причинах многих видов рака. И Bad, и Bax принадлежат к семейству белков BCL-2. Сверхэкспрессия Bax ускоряет апоптоз клеток. Активация факторов роста в пути передачи сигнала PI3K / AKT достигает пика, когда Bad фосфорилируется, таким образом подавляя апоптоз и ускоряя выживаемость клеток (28).AKT был идентифицирован как многообещающая терапевтическая мишень, и в текущем исследовании было обнаружено, что экспрессия AKT с фосфором отрицательно коррелирует с гиперплазией молочной железы. Кроме того, также измерялась эффективность ингибиторов AKT в качестве монотерапии или в сочетании с АРТ при лечении животных моделей с гиперплазией молочной железы. Сложный механизм, следующий за подавлением AKT, показал, что для предотвращения резистентности и улучшения клинического ответа следует использовать больше препаратов в комбинации.Необходимы дальнейшие исследования для определения более рациональных комбинаций для повышения эффективности ингибитора AKT за счет стимулирования апоптоза или воздействия на компенсаторный механизм. Идентификация чувствительных биомаркеров необходима для разработки новых методов лечения.

Пролиферативная ткань связана с канцерогенезом; поэтому гистология молочной железы была проанализирована у 8-недельных крыс для изучения аномальных морфологических изменений. На основании окрашивания по Массону молочных желез у крыс по сравнению с контрольной группой из одного помета наблюдались прекращение протокового эпителия и легкая очаговая гиперплазия.В возрасте 2 месяцев ни у одной из крыс не развились опухоли. Фибробласты часто возникают рядом с опухолями и способствуют развитию злокачественных новообразований; однако предыдущее исследование показало, что пролиферация фибробластов и миоэпителия очень мало влияет на стромальные ткани (27). Это означает, что фиброз может играть важную роль в доброкачественном патогенезе гиперплазии молочной железы. Более того, эстроген использовался в качестве сильного индуктора фиброза в клетках. В этом исследовании мы обнаружили, что окрашенные в синий цвет фибриллы коллагена резко откладываются в строме груди, что позволяет предположить, что избыточная фиброзная передача сигналов, индуцированная эстрадиолом, может быть заблокирована лечением АРТ (, рис. 3, ).Wen et al. обнаружил, что АРТ уменьшала фиброз и воспаление тубулоинтерстициального нефрита у крыс, получавших субтотальную нефрэктомию 5/6 через сигнальный путь NF-κB (29). Таким образом, АРТ может подавлять фиброз стромы молочной железы и внеклеточное накопление, подавляя активацию пути NF-κB. Наше исследование не было без ограничений: механизмы, с помощью которых АРТ влияет на фиброз молочной железы, еще предстоит изучить, в то же время необходимо увеличить размер выборки эксперимента в дальнейшем исследовании.

Выводы

В заключение, наши результаты сначала продемонстрировали, что АРТ ослабляет гиперплазию молочной железы, подавляя пути AKT и NF-κB in vitro и in vivo . Наши результаты показали, что АРТ может иметь терапевтический потенциал для лечения фиброза протоков.

Благодарности

Финансирование: Это исследование было поддержано проектом талантов «1166» для молодых и средних экспертов больницы Дунфан Пекинского университета китайской медицины (040204001001002025).

Контрольный список для отчетности: Авторы заполнили контрольный список для отчетности ARRIVE. Доступно на http://dx.doi.org/10.21037/atm-21-1447

Заявление о совместном использовании данных: Доступно на http://dx.doi.org/10.21037/atm-21-1447

Конфликты представляющих интереса: Все авторы заполнили единую форму раскрытия информации ICMJE (доступна по адресу http://dx.doi.org/10.21037/atm-21-1447). Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Этическое заявление: Авторы несут ответственность за все аспекты работы, гарантируя, что вопросы, связанные с точностью или целостностью любой части работы, должным образом исследованы и решены.Крысы содержались в утвержденном помещении для животных, эксперименты на животных проводились в соответствии с лицензией на проект (№: JDF-IRB-2014036302), выданной Комитетом по уходу и использованию животных больницы Дунфан Пекинского университета китайской медицины, в соответствии с руководящими принципами учреждения. по уходу и содержанию животных.

Заявление об открытом доступе: Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 4.0 Международная лицензия (CC BY-NC-ND 4.0), которая разрешает некоммерческое копирование и распространение статьи со строгим условием, что не будут вноситься никакие изменения или исправления, а оригинальная работа будет должным образом процитирована (включая ссылки на официальные публикация через соответствующий DOI и лицензию). См. Https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/.

Ссылки

1. Sun L, Guo DH, Liu F, et al. Мышиная модель гиперплазии молочной железы, вызванной пероральным введением гормона.Afr J Tradit Complement Altern Med 2017; 14: 247-52. [Crossref] [PubMed]
2. Sagara I, Beavogui AH, Zongo I, et al. Безопасность и эффективность повторного лечения пиронаридина-артесунатом у африканских пациентов с малярией: дополнительное исследование рандомизированного исследования WANECAM. Lancet Infect Dis 2016; 16: 189-98. [Crossref] [PubMed]
3. Эфферт Т., Ли П.С., Конкималла В.С. и др. От традиционной китайской медицины до рациональной терапии рака. Тенденции Мол Мед 2007; 13: 353-61. [Crossref] [PubMed]
4. Zhang LX, Liu ZN, Ye J, et al.Артесунат оказывает антииммуносупрессивное действие на рак шейки матки, подавляя продукцию PGE2 и экспрессию Foxp3. Cell Biol Int 2014; 38: 639-46. [Crossref] [PubMed]
5. Jeong DE, Song HJ, Lim S, et al. Переназначение противомалярийного препарата артесунат в качестве нового терапевтического средства для лечения метастатической почечно-клеточной карциномы из-за его ослабления роста опухоли, метастазирования и ангиогенеза. Oncotarget 2015; 6: 33046-64. [Crossref] [PubMed]
6. Муканганьяма С., Наик Ю.С., Видерстен М. и др.Предлагаемый восстановительный метаболизм артемизинина трансферазами глутатиона in vitro. Free Radic Res 2001; 35: 427-34. [Crossref] [PubMed]
7. Li Q, Ni W, Deng Z и др. Нацеливание на рак носоглотки с помощью артесуната путем ингибирования Akt / mTOR и индукции окислительного стресса. Fundam Clin Pharmacol 2017; 31: 301-10. [Crossref] [PubMed]
8. Сяо К., Ян Л., Ху Х и др. Артесунат нацелен на плоскоклеточный рак полости рта посредством митохондриальной дисфункции-зависимого окислительного повреждения и ингибирования Akt / AMPK / mTOR.Журнал Bioenerg Biomembr 2020; 52: 113-21. [Crossref] [PubMed]
9. Verma S, Kumar VL. Ослабление повреждения слизистой оболочки желудка артесунатом у крыс: модуляция окислительного стресса и передачи сигналов, опосредованной NFκB. Chem Biol Interact 2016; 257: 46-53. [Crossref] [PubMed]
10. Гриншилдс А.Л., Фернандо В., Хоскин Д.В. Артезунат против малярии вызывает остановку клеточного цикла и апоптоз трижды отрицательных MDA-MB-468 и HER2-обогащенных клеток рака молочной железы SK-BR-3. Exp Mol Pathol 2019; 107: 10-22. [Crossref] [PubMed]
11. Уильямс К.С., Манн М., Дюбуа Р.Н.Роль циклооксигеназ в воспалении, раке и развитии. Онкоген 1999; 18: 7908-16. [Crossref] [PubMed]
12. Visscher DW, Pankratz VS, Santisteban M, et al. Связь между экспрессией циклооксигеназы-2 при атипичной гиперплазии и риском рака груди. J Natl Cancer Inst 2008; 100: 421-7. [Crossref] [PubMed]
13. Ферианкова М., Вальтер И., Зингер К.Ф. и др. Экспрессия ЦОГ-2, p16 и Ki67 в диапазоне от нормальной ткани груди до рака груди. Новообразование 2020; 200731N798.
14. Li B, Lu Y, Yu L и др. miR-221/222 способствует свойствам раковых стволовых клеток и росту опухоли рака молочной железы посредством нацеливания на PTEN и устойчивой активации Akt / NF-κB / COX-2. Химико-биологические взаимодействия 2017; 277: 33-42. [Crossref] [PubMed]
15. Брантли Д.М., Чен С., Кук Р. и др. Ядерный фактор-B (NF-B) регулирует пролиферацию и ветвление в эпителии молочных желез мышей. Mol Biol Cell 2001; 12: 1445-55. [Crossref] [PubMed]
16. Ghoneum A, Said N. Пути PI3K-AKT-mTOR и NFκB при раке яичников: значение для целевой терапии.Раки (Базель) 2019; 11: 949. [Crossref] [PubMed]
17. Shang Z, Yu J, Sun L, et al. LncRNA PCAT1 активирует передачу сигналов AKT и NF-κB при устойчивом к кастрации раке простаты, регулируя комплекс PHLPP / FKBP51 / IKKα. Nucleic Acids Res 2019; 47: 4211-25. [Crossref] [PubMed]
18. Хигучи М., Масуяма Н., Фукуи Ю. и др. Akt опосредует регулируемую Rac / Cdc42 подвижность клеток в клетках, стимулированных фактором роста, и в инвазивных клетках, нокаутированных по PTEN. Текущая биология 2001; 11: 1958-62. [Crossref] [PubMed]
19. Manning BD, Cantley LC.Сигнализация AKT / PKB: навигация вниз по течению. Cell 2007; 129: 1261-74. [Crossref] [PubMed]
20. Хваджа А., Родригезвица П., Веннстром С. и др. Как адгезия матрикса, так и трансформация Ras активируют пути выживания клеток как фосфоинозитид-3-ОН-киназы, так и протеинкиназы B / Akt. EMBO J 1997; 16: 2783-93. [Crossref] [PubMed]
21. Datta SR, Dudek H, Tao X и др. Akt-фосфорилирование сигналов выживания пар BAD к машине внутренней смерти клетки. Cell 1997; 91: 231-41. [Crossref] [PubMed]
22. Дебнат Дж., Уокер С.Дж., Брюгге Дж. С..Активация Akt нарушает ацинарную архитектуру молочных желез и усиливает пролиферацию mTOR-зависимым образом. J. Cell Biol. 2003; 163: 315-26. [Crossref] [PubMed]
23. Bridgford JL, Xie SC, Cobbold SA и др. Артемизинин убивает паразитов малярии, повреждая белки и подавляя протеасомы. Нац Коммуна 2018; 9: 3801. [Crossref] [PubMed]
24. Сингх Н.П., Лай Х. Селективная токсичность дигидроартемизинина и голотрансферрина в отношении клеток рака груди человека. Life Sci 2001; 70: 49-56. [Crossref] [PubMed]
25. Чанг Ш., Лю Ч., Конвей Р. и др.Роль простагландин E2-зависимого ангиогенного переключателя в индуцированном циклооксигеназой 2 прогрессировании рака молочной железы. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 591-6. [Crossref] [PubMed]
26. Гош М., Ай Й., Нарко К. и др. PPARdelta является про-туморогенным в мышиной модели рака молочной железы, индуцированного ЦОГ-2. Простагландины Other Lipid Mediat 2009; 88: 97-100. [Crossref] [PubMed]
27. Nimmo JS, Plummer JM. Ультраструктурные исследования фиброаденоматозной гиперплазии молочных желез 2 кошек. J Comp Pathol 1981; 91: 41-50.