Связывание CT ганглиозида GM1 было первоначально предположено, когда оказалось, что существует взаимосвязь между концентрацией ганглиозидов, количеством сайтов связывания для CT и результирующей чувствительностью кишечника к CT. ^[22] Эта гипотеза подтвердилась, когда было показано, что изолированный CT фиксируется и осаждается ганглиозидом, а не каким-либо из аналогичных ему гликолипидов. ^[23] Как только субъединицы B связывают 5 молекул GM1 (расположенных в плазматической мембране клеток слизистой оболочки), комплекс рецептор-токсин подвергается эндоцитозу и транспортируется в эндоплазматический ретикулум. Не все 5 субъединиц должны связываться с ганглиозидами GM1 для формирования комплекса и возникновения эндоцитоза: несмотря на снижение токсичности с уменьшением связывания, только один GM1 должен быть связан для CT, чтобы войти в клетку-хозяина ( Рисунок 6 ).Попав в ЭР, дисульфидная связь в субъединице А затем восстанавливается, в результате чего субъединица А отделяется от комплекса и попадает в цитоплазму, где она связывает фактор рибозилирования АДФ. ^[21] Этот процесс вызывает активацию аденилатциклазы, которая производит циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) из АТФ. ^[24]

Увеличение цАМФ изменяет трансмуральный поток ионов, вызывая секрецию Cl ^– кишечной железой в слизистой оболочке тонкой кишки, а также ингибирование поглощения нейтрального NaCl ворсинками кишечника. ^[25] Из-за этого выброса Cl ^– и неспособности кишечника реабсорбировать его объем кишечника достигает ненормального уровня, что приводит к водянистой диарее, характерной для холеры. Чрезмерная диарея заставляет инфицированного человека терять жидкость, богатую электролитами, и, таким образом, обезвоживаться. ^{[25] [26]}

Будущие направления в разработке вакцин

Холера была бременем для здоровья человека на протяжении веков, а за последние 200 лет распространилась по всему миру. ^[27] В течение последних 15 лет Всемирная организация здравоохранения призывала к разработке оральных вакцин против холеры. ^[28] Варианты включают вакцины с убитыми целыми клетками, которые вызывают иммунный ответ, но не вызывают заболевания, и живые ослабленные вакцины, которые представляют собой ослабленные бактерии, которые не могут вызывать полноценное заболевание, но могут вызывать иммунный ответ. В то время как ранее исследователи сосредоточились на создании вакцин с использованием инактивированной CT, теперь с помощью исследований на животных и людей стало понятно, что иммунитет против CT, развившийся в результате лечения вакциной, не так эффективен для защиты пациента от холеры.Наконец, можно использовать везикулы внешней мембраны, высвобождаемые V. cholerae , или синтетические липосомы для доставки антигенов холеры. ^[29] В следующие несколько десятилетий должны появиться дальнейшие разработки и клинические испытания этих различных вакцин.

Список литературы

^[1] Reidl, J. and K.E. Klose, Холерный вибрион и холера: из воды в организм хозяина. Fems Microbiology Reviews, 2002. 26 : p. 125-139.
^[2] Али, М., et al., Глобальное бремя холеры. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения, 2012 г. 90 : с. 209-218.
^[3] Sack, D.A., et al., Cholera. Lancet, 2004. 363 : с. 223-233.
^[4] Yu, R.R., and V.J. DiRita, Анализ ауторегуляторной петли, контролирующей ToxT, холерный токсин и выработку ворсинок, регулируемых токсинами, у Vibrio cholerae. Journal of Bacteriology, 1999. 181 : p. 2584-2592.
^[5] Zhu, J. and J.J. Mekalanos, Биопленки, зависимые от кворума, усиливают колонизацию холерного вибриона. Developmental Cell, 2003. 5 : p. 647-656.
^[6] Фонг, J.C.N., et al., Роль генов полисахаридов вибрионов (vps) в продукции VPS, формировании биопленок и патогенезе холерных вибрионов. Microbiology, 2010. 156 : с. 2757-2769.
^[7] Zhang, L., et al., Плейотропные эффекты системы транслокации двойного аргинина на образование, колонизацию и вирулентность биопленок в Vibrio cholerae. Биомед Центральная микробиология, 2009. 9 : стр. 1-13.
^[8] Camilli, A. and B.L. Bassler, Бактериальные низкомолекулярные сигнальные пути. Science, 2006. 311 : с. 1113-1116.
^[9] Miller, M.B., et al., Системы распознавания параллельных кворумов сходятся, чтобы регулировать вирулентность холерного вибриона. Cell, 2002. 110 : стр. 303-314.
^[10] Хиггинс Д.А. и др., Главный аутоиндуктор холерного вибриона и его роль в производстве фактора вирулентности. Nature, 2007. 450 : с. 883-886.
^[11] Zhu, J., et al., Регуляторы, воспринимающие кворум, контролируют экспрессию гена вирулентности в Vibrio cholerae. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2002. 99 : p. 3129-3134.
^[12] Craig, L., et al., Структура ворса IV типа и патогенность бактерий. Nature Reviews Microbiology, 2004. 2 : p. 363-378.
^[13] Craig, L., et al., Структура и сборка пилина IV типа: рентгеновский и ЭМ-анализ пилина, корегулируемого токсином Vibrio cholerae, и пилина Pseudomonas aeruginosa PAK. Molecular Cell, 2003. 11 : стр. 1139-1150.
^[14] Thelin, K.H. и Р.К. Taylor, Пилус, корегулируемый токсином, но не чувствительный к маннозе гемагглютинин, необходим для колонизации Vibrio cholerae биотипа O1 El Tor и штамма O139. Инфекция и иммунитет, 1996. 64 : с. 2853-2856.
^[15] Херрингтон, Д.A., et al., Токсин, пили, регулируемые токсином, и регулон toxR важны для патогенеза холерного вибриона у людей. Journal of Experimental Medicine, 1988. 168 : p. 1487–1492.
^[16] Taylor, R.K., et al., Использование слияния генов phoA для идентификации фактора колонизации пилуса, координируемого с помощью холерного токсина. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1987. 84 : p. 2833-2837.
^[17] Спринц, Х., et al., Биопсия тонкой кишки тайцев с особым упором на выздоровление от азиатской холеры и синдрома кишечной мальабсорбции. Американский журнал клинической патологии, 1962. 38 : p. 43-51.
^[18] Lee, S.H., et al., Регуляция и временные паттерны экспрессии генов вирулентности Vibrio cholerae во время инфекции. Cell, 1999. 99 : p. 625-634.
^[19] Nielsen, A.T., et al., Бистабильный переключатель и контроль анатомического сайта экспрессии гена вирулентности Vibrio cholerae в кишечнике. Публичная научная библиотека патогенов, 2010. 9 : e1001102.
^[20] Lonnroth, I. and J. Holmgren, Субъединичная структура холерного токсина. Журнал общей микробиологии, 1973. 76 : с. 417-427.
^[21] Jobling, M.G., et al., Для связывания холерного токсина с клетками и завершения пути интоксикации достаточно одного сайта связывания нативного ганглиозида GM1. mBio, 2012. 3 : e00401-12.
^[22] Холмгрен, Дж., et al., Взаимодействие холерного токсина и мембранного ганглиозида GM1 тонкой кишки. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1975. 72 : p. 2520-2524.
^[23] Holmgren, J., et al., Тканевый рецептор экзотоксина холеры: предполагаемая структура из исследований с ганглиозидом GM1 и родственными гликолипидами. Инфекция и иммунитет, 1973. 8 : p. 208-214.
^[24] Van Heyningen, W.E., et al., Дезактивация холерного токсина ганглиозидом .Журнал инфекционных болезней, 1971. 124 : с. 415-418.
^[25] Field, M., et al., Влияние энтеротоксина холеры на перенос ионов через изолированную слизистую оболочку подвздошной кишки. Journal of Clinical Investigation, 1972. 51 : p. 796-804.
^[26] Speelman, P., et al., Дисфункция толстой кишки во время инфекции холеры. Гастроэнтерология, 1986. 50 : с. 1164-1170.
^[27] Sack, D.A., et al., Серьезно относиться к холере. Медицинский журнал Новой Англии, 2006. 355 : p. 649-651.
^[28] Холерные вакцины. Еженедельный эпидемиологический отчет, 2001. 76 : 117-124.
^[29] Vibrio cholerae: уроки по созданию вакцины для слизистых оболочек. Expert Review Vaccines, 2011. 10 : p. 79-94.

Отредактировала Тина Солвик, студентка Сюзанны Керн по специальности BIOL168L (микробиология) в научном отделении Кека колледжей Клермонта, весна 2015 г.

Передача холеры: динамика хозяина, возбудителя и бактериофага

Диарейные заболевания, включая холеру, являются ведущей причиной заболеваемости и второй по частоте причиной смерти среди детей в возрасте до 5 лет во всем мире ^1,2 . Трудно определить точную заболеваемость и смертность от холеры, поскольку системы эпиднадзора во многих развивающихся странах находятся в зачаточном состоянии, а многие страны не решаются сообщать о случаях холеры в ВОЗ из-за потенциального негативного экономического воздействия этой болезни на торговлю и туризм.Сегодня реальное бремя холеры оценивается в несколько миллионов случаев в год, преимущественно в Азии и Африке ³ . При оптимальной доставке пероральная регидратационная терапия может снизить уровень летальности с> 20%, наблюдавшихся ранее ^4,5,6 до <1% ⁷ . Еще предстоит проделать большую работу, поскольку в 2007 году 27 стран сообщили о показателях летальности, превышающих пороговое значение в 1% (см. П. 8).

Возбудитель холеры, грамотрицательная бактерия. Холерный вибрион , является факультативным патогеном, который в своем жизненном цикле имеет как человеческую, так и экологическую стадию ^9,10 . V. cholerae дифференцируется серологически на основе О-антигена его липополисахарида (ЛПС) (рис. 1). Штаммы, продуцирующие токсин холеры (токсигенные) серогрупп O1 и O139, вызывают подавляющее большинство заболеваний. Серогруппа O1 подразделяется на два фенотипически различных биотипа, Эль-Тор и классический, второй из которых связан с более ранними пандемиями. Оба биотипа можно подразделить на два серотипа, Инаба и Огава ⁷ . За последние 20 лет Эль Тор заменил классический биотип ¹¹ ; однако наследие классического биотипа сохраняется, поскольку появились штаммы Эль-Тор, содержащие токсин классической холеры ^12,13,14 .Серогруппа O139 впервые появилась в 1992 г. в результате мультигенной замены в O-антиген-кодирующей области штамма-предшественника O1 El Tor ¹⁵ . Хотя серогруппа O139 вызвала разрушительные вспышки в 1990-х годах, штамм Эль Тор остается доминирующим штаммом во всем мире ^11,16,17 .

На основании антигенности компонента О-антигена липополисахарида внешней мембраны в водной среде существует более 200 серогрупп (O1 – O200) Vibrio cholerae .Только подмножество штаммов серогрупп O1 и O139 являются токсигенными (Tox ⁺ ) и, следовательно, способны вызывать холеру при приеме внутрь; такие штаммы отбираются у хозяина. Другие штаммы нетоксигены (Tox ^— ) и отбираются против них. Различные типы О-антигена обозначены цветом внешней мембраны и покрытого оболочкой жгутика (периплазматическое пространство и внутренняя мембрана не показаны). Капсулы присутствуют в подмножестве штаммов. Генотипы разных штаммов обозначены цветом цитоплазмы; Обратите внимание, что Tox ⁺ O1 и O139 имеют по существу один и тот же генотип, за исключением генов O-антигена.

Патофизиология холеры описана в обширной литературе. Короче говоря, патогенные штаммы несут в себе ключевые факторы вирулентности, которые включают холерный токсин ¹⁸ и ко-регулируемый токсин (TCP) ^19,20 , самосвязывающийся пилус, который связывает бактериальные клетки вместе ²¹ , возможно, чтобы противостоять силам сдвига. в тонком кишечнике хозяина. Токсин холеры представляет собой секретируемый токсин субъединицы AB ₅ . Пентамер субъединицы B связывает моносиалотетрагексозилганглиозиды на абсорбирующих эпителиальных клетках, вызывая эндоцитоз ферментативной субъединицы A, после чего он рибозилирует АДФ субъединицу G-белка, который контролирует активность аденилилциклазы.Хотя вирулентность многофакторна, токсин холеры является ключевым фактором, ответственным за обильную секреторную диарею, которая возникает у инфицированных людей. Трансмиссивные элементы, такие как лизогенный бактериофаг, несущий гены токсина холеры ²² и элемент SXT, несущий гены устойчивости к антибиотикам ²³ , будут продолжать определять эволюцию V. cholerae .

Биологические факторы и факторы окружающей среды, которые способствуют динамике вспышек холеры, продолжают оставаться предметом интенсивных исследований.Было опубликовано несколько обзорных статей, посвященных важности экологических факторов в распространении вспышек холеры. ^24,25,26 . В этом обзоре мы сосредоточимся скорее на трех биологических факторах, которые, как считается, играют важную роль в возникновении и формировании вспышек холеры: восприимчивость хозяина, вирулентность V. cholerae и литические бактериофаги. Ниже мы обсудим эту троицу факторов, связанных с динамическим характером вспышек холеры.

Человеческий хозяин

Клинический спектр В.cholerae инфекция . Инфекция V. cholerae вызывает клинический спектр, который варьируется от бессимптомной колонизации до холеры гравис, наиболее тяжелой формы болезни (Таблица 1). После проглатывания зараженной пищи или воды хозяином, V. cholerae колонизирует тонкий кишечник в течение 12–72 часов до появления симптомов. Холера часто начинается с желудочных спазмов и рвоты, за которыми следует диарея, которая может прогрессировать до потери жидкости до 1 литра в час ²⁷ .Эти потери приводят к серьезному истощению объема жидкости и метаболическому ацидозу, что может привести к сосудистому коллапсу и смерти ⁷ . Стул с рисовой водой обычно содержит от 10 ¹⁰ до 10 ¹² вибрионов на литр. Пациенты с симптомами могут выделять вибрионы до начала болезни ^28,29 и будут продолжать выделять организмы в течение 1-2 недель ^30,31 . Бессимптомные пациенты обычно выделяют вибрионы со стулом только в течение 1 дня, примерно 10 ³ вибрионов на грамм стула ³² .Следовательно, распределение пациентов с симптомами влияет на количество V. cholerae , которые выделяются для последующей передачи.

Число симптоматических случаев зависит от возраста и эндемичности заболевания. В эндемичных условиях, таких как дельта реки Ганг, дети с большей вероятностью будут госпитализированы с тяжелым заболеванием ³³ . За последние 20 лет преобладание тяжелых случаев переместилось на детей младшего возраста, с пиком тяжелых случаев в возрасте 2 лет ³⁴ .Напротив, при эпидемических моделях передачи, например, когда V. cholerae вводят иммунологически наивной популяции, все возрастные группы кажутся одинаково восприимчивыми к симптоматической инфекции ^16,35,36,37 .

Бессимптомные случаи также могут способствовать распространению микроорганизма, хотя и на гораздо более низком уровне, чем пациенты с симптомами, и могут отражать важный компонент приобретенного иммунитета, который наблюдается в некоторых сообществах. Однако бессимптомные случаи часто трудно задокументировать.Четырехкратное повышение титра сывороточных вибриоцидных антител является полезной мерой для выявления бессимптомных людей, которые могут быть инфицированы, но от которых невозможно изолировать организм. Используя положительный результат посева из ректального мазка или ответ на вибриоцидные антитела для определения инфекции, недавно было обнаружено, что у бангладешских детей в возрасте до 5 лет вероятность появления симптомов в 2–3 раза выше, чем у детей старше 5 лет ³⁵ . Частота симптомов во всех возрастных группах в этом исследовании составила 57% ³⁵ .Это соответствует показателям симптоматических инфекций, которые были обнаружены в связи с классическими штаммами в более ранней литературе ^32,38,39,40 , но намного выше показателей, зарегистрированных для инфекций Эль-Тор в 1970-е годы ⁴⁰ . Таким образом, бессимптомные случаи могут составлять примерно половину всех случаев. Будущие исследования иммунологии бессимптомных пациентов помогут оценить их вклад в защитный иммунитет на популяционном уровне.

Восприимчивость к холере .Генетические факторы и факторы питания хозяина влияют на восприимчивость к холере. Антигены группы гистокрови ABH представляют собой набор клеточных и секретируемых гликолипидов и гликопротеинов, которые являются ключевыми детерминантами восприимчивости хозяина к ряду желудочно-кишечных патогенов; они, по-видимому, влияют на специфичность рецептора клетки-хозяина в отношении связывания патогенов и токсинов. Фенотип O соответствует немодифицированному антигену H и связан со сниженным риском заражения V. cholerae . Однако, как только хозяин инфицирован, фенотип O связан с повышенным риском серьезных симптомов; механизм этого остается неизвестным.Распространенность фенотипа О варьируется среди человеческих популяций; его низкая распространенность в дельте реки Ганг предполагает, что существует отбор против этого фенотипа в эндемичной по холере зоне ^35,41,42 . В популяциях с высокой распространенностью группы крови O, например в странах Латинской Америки, болезнь протекает тяжелее, и потребности в регидратации и госпитализации инфицированных людей существенно выше ^43,44 .

Хотя антиген группы крови H является единственным давно признанным генетическим фактором, связанным с восприимчивостью к холере, другие генетические полиморфизмы, вероятно, были выбраны за или против, учитывая исторически высокие уровни смертности от холеры.Например, недавнее исследование связывало тяжелую холеру с вариантом LPLUNC1 (белок 1, связанный с карциномой длинного неба, легких и носового эпителия) ⁴⁵ , консервативного белка врожденного иммунитета. Экспрессия LPLUNC1 активируется в эпителии тонкой кишки во время острой холеры и может влиять на течение инфекции V. cholerae ⁴⁶ .

Недоедание, измеряемое по задержке линейного роста, не является фактором риска заражения V. cholerae ³⁵ .Однако дефицит ретинола (витамина А), питательного микроэлемента, который способствует иммунитету слизистых оболочек, является фактором риска, связанным как с инфекцией V. cholerae , так и с развитием симптоматического заболевания ³⁵ . Цинк, еще один питательный микроэлемент, который способствует иммунитету слизистых оболочек, может истощаться во время диарейных заболеваний ⁴⁷ . Оральный цинк устраняет этот дефицит у детей, что приводит к значительному сокращению объема стула и времени до прекращения диареи ⁴⁴ .

Защитная невосприимчивость . Несколько исследований демонстрируют, что клинически очевидная инфекция V. cholerae индуцирует защитный иммунитет против последующей инфекции (вставка 1). Заражение североамериканских добровольцев классическим биотипом и биотипом Эль-Тор обеспечивало 100% и 90% защиту соответственно от последующего заражения ^31,48 . Аналогичным образом, в эндемических условиях было обнаружено, что более 90% пациентов с тяжелым заболеванием, вызванным инфекцией классическим биотипом, были защищены от инфекции в будущем, на основании наблюдаемой и ожидаемой частоты госпитализаций в связи со вторым эпизодом холеры в это население ³³ ; аналогичные результаты были получены в отдельном исследовании ⁴⁹ .Механизм этого защитного иммунитета против инфекции и болезни V. cholerae неизвестен.

Выявлено несколько коррелятов иммунитета. Лучше всего охарактеризованным серологическим маркером иммунитета является титр сывороточных вибриоцидных антител. Это антитело является комплемент-зависимым бактерицидным антителом, титр которого заметно увеличивается после заболевания, но снижается до исходного уровня через 6–9 месяцев ⁷ . В Бангладеш вибриоцидные антитела выявляются у большинства людей в возрасте 10–15 лет и связаны со снижением риска инфицирования.Поскольку V. cholerae является неинвазивным патогеном, эти сывороточные антитела могут не вносить непосредственный вклад в защиту на уровне слизистой оболочки кишечника, но они могут быть полезны для оценки степени защитного иммунитета на уровне популяции. Антитела иммуноглобулина A, специфичные к TCP, LPS или субъединице B холерного токсина, коррелируют с защитой от последующей инфекции и заболевания ³⁵ .

Полевые испытания вакцины обеспечивают контролируемую оценку устойчивости адаптивных иммунных ответов к V.Холера . В крупнейшем контролируемом испытании 62 285 участников в Бангладеш были рандомизированы для получения 3 пероральных доз (с интервалом 6 недель) комбинации убитых целых клеток (Эль Тор и классические) плюс субъединица В холерного токсина (вакцина B – WC), цельноклеточный компонент без B-субъединицы (вакцина WC) или убитый Escherichia coli K12 в качестве контроля. Через 3 года наблюдения две вакцины (B – WC и WC) имели 50% и 52% защитную эффективность, соответственно ⁵⁰ . Для детей младше 5 лет эффективность составила 23–26%.Через 6 месяцев наблюдения вакцина B – WC дала 85% защиту. ⁵¹ . Ведутся споры о том, демонстрируют ли эти данные эффективность, достаточную для широкомасштабного распространения. В настоящее время предпринимаются усилия по созданию новых вакцин для обеспечения более высоких и устойчивых ответов у реципиентов, а также для снижения производственных затрат, чтобы преодолеть как иммунологические, так и производственные препятствия, которые ограничивают возможность применения нынешних вакцин против холеры ^52,53,54,55 .

Роль, которую коллективный иммунитет играет в замедлении передачи холеры, недавно стала оценена.При испытаниях эффективности вакцины отдельные пациенты рандомизируются, чтобы гарантировать, что защитная эффективность отражает только прямой эффект вакцины ⁵⁶ . Это означает, что лицензирование вакцин не учитывает их преимущества на уровне населения. Обсуждаемое выше испытание вакцины B – WC имело уровень охвата от 4% до 65% в разных регионах ^50,57 . Когда уровни заболеваемости холерой сравнивались с показателями охвата вакцинацией в конкретных регионах, было обнаружено, что заболеваемость среди реципиентов плацебо обратно коррелировала с уровнем охвата прививками ⁵⁷ : там, где охват был высоким, даже среди тех, кто этого не сделал. Получившие вакцину, вероятность заразиться холерой по-прежнему на четверть ниже, чем у невакцинированных лиц в районах с низким уровнем охвата.Когда коллективный иммунитет включен в имитационные модели эффективности вакцины, охват вакцинацией B – WC 50% в эндемичных районах приводит к снижению общего числа случаев на 93% ⁵⁸ . Взятые вместе, эти исследования доказывают, что вакцина B-WC может обеспечить достаточную защиту для широкомасштабной вакцинации в эндемичных регионах и что коллективный иммунитет, вероятно, будет играть важную роль в ограничении передачи холеры.

Передача с точки зрения хоста .Несколько групп создали математические модели, используя точки зрения как хозяина, так и патогена, чтобы помочь объяснить и предсказать природу вспышек холеры. Цель большинства этих моделей — точно отразить резкий рост и снижение заболеваемости холерой, которое наблюдается два раза в год в регионах вокруг Бенгальского залива. Модель была построена для включения показателей передачи, фактора сезонных колебаний и расчета количества восприимчивых людей на основе различного защитного иммунитета от прошлой инфекции ^59,60,61 .Эти идеи были основаны на проверке гипотез о том, что высокое соотношение бессимптомных и симптоматических случаев связано с разрешением вспышки и что короткий интервал защитного иммунитета (2–12 недель) после заражения допускает последующие вспышки, которые наблюдаются в Бангладеш ⁶² . Результаты показывают, что сочетание многих бессимптомных случаев и недолговечного иммунитета, а не «молчаливых» случаев, дает модель, которая лучше всего отражает эпидемиологические данные из Западной Бенгалии. Модель имеет ограничения: она предполагает соотношение бессимптомных и симптоматических случаев, которое намного выше, чем те, которые наблюдались в последние годы, и она была протестирована с использованием показателей смертности, которые связаны с клинически определенной холерой из Западной Бенгалии между 1891 и 1940 годами — эпохой до открытия. ротавируса и энтеротоксигенного E.coli , которые являются смешивающими факторами. Несмотря на свои недостатки, эти модели улучшают наше понимание сложной динамики вспышек и показывают, насколько мощной может быть реакция хозяина в ограничении передачи. Новые модели передачи холеры должны по-прежнему включать факторы сезонных колебаний, соотношение бессимптомных и симптоматических случаев и темпы снижения защитного иммунитета.

Возбудитель

Инфекционные дозы в моделях на животных .Заражение человека-хозяина — многоступенчатый процесс: V. cholerae необходимо принимать в дозе, достаточной для преодоления врожденной иммунной защиты, затем экспрессировать факторы вирулентности для колонизации тонкой кишки и, наконец, координировать выход из организма хозяина для облегчения трансмиссия ⁶³ (рис.2). Модели холеры на животных в значительной степени являются показателями успешности первых двух стадий ⁶⁴ . Используя модель инфекции у новорожденных мышей, было показано, что V. cholerae , выделяющееся с рисовым водяным стулом человека, находятся в гиперинфекционном состоянии, демонстрируя ID ₅₀ 10–100 клеток по сравнению с примерно 500 клетками для V. .cholerae выращено in vitro ^65,66,67 . Гиперинфекция также была задокументирована в Citrobacter rodentium ⁶⁸ , а гиперинфекционный V. cholerae может быть воспроизведен при прохождении через мышиную модель инфекции ^68,69 . Определение и фенотип гиперинфективности противоречивы из-за сложностей при выборе наиболее подходящих условий культивирования для роста контрольного штамма.

Токсигенные штаммы Vibrio cholerae сохраняются в водной среде наряду с нетоксигенными штаммами, чему способствует образование биопленок на биологических поверхностях и использование хитина в качестве источника углерода и азота. При попадании этих адаптированных к водной среде бактерий в загрязненную пищу или воду токсикогенные штаммы колонизируют тонкий кишечник, размножаются, выделяют токсин холеры и возвращаются в окружающую среду хозяином при секреторной диарее. Патогены, выделяемые калом, находятся в преходящем гиперинфекционном состоянии, которое усиливает вспышку за счет передачи последующим хозяевам.

Молекулярные механизмы, которые способствуют гиперинфективности у V. cholerae , многофакторны. Исследования на микроматрицах показали, что глобальный профиль транскрипции гиперинфекционных вирусов V. cholerae из рисового водяного стула отличается от такового для V. cholerae , выращенных in vitro или верхних отделов тонкой кишки V. cholerae , выведенных в рвотных массах ^{65, 70,71} (рис.3). Большинство известных генов вирулентности, включая гены холерного токсина и TCP, подавляются в стуле из рисовой воды, но механизм этого подавления остается неизвестным.Еще одна уникальная особенность — подавление генов хемотаксиса, что удивительно, учитывая, что планктонные вибрионы, выделяемые пациентами, являются жгутиками и очень подвижны. Было показано, что это подавление хемотаксиса является одним из компонентов гиперинфективности, потому что подвижные, но не хемотаксирующие мутанты V. cholerae являются гиперинфекционными ^66,72,73 .

При проглатывании (нижняя правая панель) Vibrio cholerae использует подвижность и муциназы для проникновения через слизистый гель и N -ацетилглюкозамин-связывающий белок А (GbpA) и другие факторы для колонизации эпителия тонкой кишки.Существенные изменения в экспрессии генов сопровождают этот переход от пруда к острой инфекции, включая, помимо прочего, индукцию vieA , которая кодирует фосфодиэстеразу, гидролизующую вторичный мессенджер циклический ди-GMP, и гены, регулируемые ToxR, включая гены холеры. токсин и самоагрегирующиеся пилусы, регулируемые токсином (TCP). Кроме того, репрессируются несколько генов, например, гены хитин-связывающего маннозу-чувствительного гемагглютинина пилуса (MSHA) и стрессового сигма-фактора RpoS.На поздней стадии инфекции (нижняя левая панель) V. cholerae снова изменяет экспрессию своего гена, чтобы отделиться от эпителия — «реакция бегства» — и подготовиться к передаче другому хозяину (например, распространение в домашних условиях). ) или попадание в водную среду. Изменения на поздней стадии включают индукцию генов синтеза c-di-GMP (дигуанилилциклазы), систем поглощения питательных веществ (таких как регулон регуляции поглощения железа (Fur)) и подвижности (Fla), а также репрессию таких генов, как для хемотаксиса (Che) и регулона ToxR.Возникающее в результате «подвижное, но не хемотаксическое» состояние способствует гиперинфективности. Если бактерии, содержащиеся в стуле, не попадают в организм другого хозяина в течение короткого периода времени, то их ждет одна из двух судьб (верхняя панель): установление в водной среде путем нахождения подходящих источников питательных веществ, таких как хитин, или распад в « активную, но некультивируемое состояние. После воздействия хитина V. cholerae индуцирует несколько генов, участвующих в присоединении и катаболизме хитина (регулон ChiS), а также гены, участвующие в генетической компетентности (регулон TfoX).Образование биопленок на поверхности опосредуется индукцией регулона Vps, который кодирует внеклеточный полисахарид. Во время перехода в активное, но не культивируемое состояние, происходят большие изменения в экспрессии генов, поскольку V. cholerae пытается адаптироваться к условиям с низким содержанием питательных веществ. К ним относятся индукция генов фосфатного и азотного голодания ( phoB и glnB-1 , соответственно) и репрессия генов машин трансляции.

Расшифровка V.cholerae , который передается от животных, также уникален и был отмечен двумя недавними исследованиями. Во-первых, существует скоординированная «реакция бегства», которая позволяет организму отделяться от ворсинок кишечника, готовясь к выходу из организма хозяина; это регулируется стрессом и стационарной фазой сигма-фактора РНК-полимеразы RpoS ⁷⁴ . Во-вторых, на более поздних стадиях заражения животных V. cholerae активирует экспрессию генов, которые не требуются для инфекции, но важны для выживания при переходе в водную среду ⁷⁵ .Эта предварительная индукция генов выживания в окружающей среде на поздних этапах инфекции может подготовить организм к жесткому селективному давлению в воде пруда, тем самым облегчая передачу ^24,65 . В большинстве описанных выше исследований бактериальные клетки, составлявшие инфекционную дозу, были планктонными клетками, а не агрегатами. Было проведено одно исследование с участием добровольцев, в котором V. cholerae в морщинистой форме (то есть агрегатной и продуцирующей экзополисахариды) вводили добровольцам; инфекционная доза была аналогична дозе, наблюдаемой для планктонных форм, а морщинистые формы выделялись добровольцами ⁷⁶ .Кроме того, люди выделяют V. cholerae в виде сложных биопленкообразных агрегатов ^67,77,78 . ID ₅₀ для V. cholerae выделяется в совокупности, и роль, которую эти совокупности играют в передаче, еще предстоит определить.

Инфекционная доза у человека . Инфекционная доза V. cholerae для людей сильно варьируется в зависимости от бактериального штамма и хозяина. Дозы в 10 ⁸ –10 ¹¹ клеток требовались для обеспечения последовательной колонизации у здоровых добровольцев из Северной Америки ^7,29,31 .Инфекционная доза снижается до 10 ⁴ –10 ⁸ при использовании бикарбонатного буфера для нейтрализации желудочной кислоты незадолго до инокуляции; этот метод дает процент заражения 90% ^7,29,31 . В домашнем хозяйстве пища может действовать как кислотный буфер; В исследованиях на добровольцах введение бактерии как часть «еды» из риса, рыбы, заварного крема и обезжиренного молока дало результаты, сравнимые с результатами, наблюдаемыми при одновременном введении бактерий и бикарбоната ⁷⁹ .В эндемичных условиях инфекционная доза неизвестна. Подсчет V. cholerae в образцах домашнего хозяйства и окружающей среды исторически сложен, требуя быстрого реагирования и использования флуоресцентной микроскопии для подсчета тех бактерий, культивирование которых может оказаться затруднительным. ⁸⁰ .

Клиническое наблюдение, что буферная кислота желудочного сока снижает инфекционную дозу, предполагает, что бактериальные гены, участвующие в кислотной устойчивости, могут способствовать вирулентности. Сигнатурный мутагенез (STM) был использован для поиска подмножества генов вирулентности, которые вносят вклад в устойчивость к кислоте in vitro ⁸¹ .Удаление этих генов ослабило V. cholerae в модели инфекции у новорожденных мышей, что подтверждает их роль в вирулентности. Кроме того, воздействие кислоты на V. cholerae дикого типа непосредственно перед инокуляцией мышей давало большое конкурентное преимущество перед неадаптированными к кислоте бактериями ⁸² . Эти данные, наряду с другими, демонстрируют, что бактерии , выращенные in vitro, могут быть более заразными в результате воздействия стресса. Кроме того, эти результаты могут иметь клиническое значение в тех регионах мира, где пониженное производство кислоты в желудке (ахлоргидрия) является вторичным по отношению к Хеликобактер пилори распространена инфекция, например Бангладеш ⁷ .

Передача с точки зрения возбудителя . Роль, которую гиперинфекция играет в быстром распространении холеры среди населения в начале вспышки, остается непроверенной. V. cholerae остается гиперинфекционным в течение как минимум 5 часов после перехода от пациентов в водную среду, что позволяет предположить, что гиперинфекция играет особую роль в передаче инфекции в местах с высокой плотностью населения, где существует вероятность контакта с организмом другого человека. в относительно короткие сроки ^65,70 .Одна из моделей передачи холеры предполагает, что вспышка начинается, когда либо уже инфицированный индексный случай мигрирует и загрязняет новую территорию, либо V. cholerae , потребляемая из естественного водоема окружающей среды, создает новый индексный случай у постоянного населения. В обоих сценариях не исключено, что ускорение вспышки является результатом быстрого распространения гиперинфекционного вируса V. cholerae от человека к человеку при очень коротком пребывании в окружающей среде.Модели передачи, которые допускают только стохастическое поступление V. cholerae из окружающей среды, не предсказывают резкого роста числа случаев, которые наблюдаются в начале вспышек во всем мире, включая те, которые происходят раз в два года в Бангладеш ¹¹ . Однако модели, которые включают гиперинфективность ⁸³ , лучше отражают этот крутой подъем.

Обслуживание трансмиссии через водоемы . Эндемичная холера встречается в регионах с естественными водными резервуарами токсигенных и нетоксигенных V.cholerae , где бактерии могут сохраняться либо в свободноживущем состоянии, либо в ассоциации с фитопланктоном ^84,85,86 , зоопланктоном ^85,86,87,88 или биотическим и абиотическим детритом ^89,90 . Эти взаимодействия могут быть как полезными, так и антагонистическими ^91,92 . Ассоциации вообще не случайны. Например, у V. cholerae появились механизмы присоединения, разложения и использования хитина в качестве источника углерода и азота ^93,94,95 (рис.3). Для экологических изолятов методы ДНК-типирования, основанные на секвенировании гипервариабельных локусов повторов короткой последовательности, начали лучше определять взаимосвязь между нетоксигенными и токсигенными V. cholerae . Было обнаружено, что два сельских региона, разделенных 80 км в дельте реки Ганг, содержат отдельные, разнообразные штаммы из экологических и клинических условий ⁹⁶ . Изоляты из окружающей среды состояли как из токсигенных, так и из нетоксигенных штаммов O1 El Tor и O139 на фоне нетоксигенных штаммов, представляющих многие серогруппы.Напротив, клинические изоляты были строго токсигенными O1 El Tor и O139, но относились к разным типам штаммов. Эти результаты демонстрируют, что в организме хозяина токсигенные штаммы обладают селективным преимуществом перед нетоксигенными штаммами из окружающей среды. Взаимосвязь между экологическими и клиническими штаммами может быть разной в других регионах мира и, вероятно, будет варьироваться в зависимости от окружающей среды, санитарии, инфраструктуры и плотности населения.

Селективное давление в водной среде .Некоторые бактериальные патогены, включая V. cholerae , теряют способность культивироваться на стандартных средах после переноса от хозяина или лаборатории в водную среду ^24,97 . Этот фенотип традиционно был известен как «жизнеспособное, но не культивируемое» (VBNC) состояние, поскольку клетки сохраняют способность к основным метаболическим процессам, таким как синтез белка, дыхание и поддержание целостности мембран, несмотря на их неспособность культивироваться ²⁴ . Альтернативный, более консервативный термин, который применяется к этому состоянию, — «активный, но не культивируемый» (ABNC), поскольку остается неясным, живы ли еще бактерии, утратившие культивирование на стандартных средах ⁹⁸ .

V. cholerae может быстро превратиться в ABNC, когда покидает человека-хозяина и попадает в водную среду. Исследования с участием V. cholerae , полученного от пациента и in vitro, полученного in vitro , которые подвергались диализу в прудовой воде, продемонстрировали снижение культивируемости на 60% и 90% через 5 часов и 24 часа соответственно ⁶⁵ . Анализ микроматрицы продемонстрировал быстрые и поразительные изменения транскрипции, когда бактерии входили в состояние ABNC ⁶⁵ . Эти изменения включали индукцию генов поглощения фосфатов и фиксированного азота и подавление генов синтеза белка и энергетического метаболизма, что согласуется с низкими уровнями источников углерода, фосфата и фиксированного азота, которые часто встречаются в водной среде.Остается проверить, будет ли включение твердых частиц, которые были отфильтрованы из воды пруда в вышеупомянутом исследовании, продлить культивирование V. cholerae . Учитывая возможность такого быстрого снижения культивируемости, исследователи задались вопросом, является ли большинство клеток V. cholerae , заражающих людей из окружающей среды, ABNC или культивируемыми клетками. Одна из гипотез гласит, что если культивируемые клетки более заразны, чем клетки ABNC, то ID ₅₀ , рассчитанный по общему количеству клеток, будет увеличиваться по мере уменьшения процента культивируемых клеток в популяции.Это было подтверждено в недавних экспериментах, предполагающих, что основными виновниками инфицирования человека, вероятно, являются культивируемые клетки V. cholerae ⁶⁵ . Будущие математические модели передачи V. cholerae должны учитывать возможность уменьшения скорости культивирования.

V. cholerae литический бактериофаг

Биология вибриофагов .Восемьдесят лет назад было высказано предположение, что бактериофаги могут контролировать естественные популяции патогенов ^99,100 . Более поздние исследования в области морской микробиологии выявили элегантный баланс между бактериофагами и их цианобактериальной добычей ¹⁰¹ . С клинической точки зрения бактериофаги, в принципе, можно использовать для профилактики или лечения инфекций. Действительно, документально подтверждена «фаговая терапия» против холеры и других заболеваний (вставка 2). Существует не менее 200 видов бактериофагов, которые инфицируют V.cholerae , известные как вибриофаги ^102,103 . Нитевидный лизогенный вибриофаг CTXφ является одним из наиболее охарактеризованных, поскольку он несет гены, кодирующие токсин холеры ²² . Первым секвенированным геномом хвостатого вибриофага был геном κ139; этот вибриофаг может быть как лизогенным, так и литическим. Основным механизмом, с помощью которого V. cholerae O1 становится устойчивым к κ139 и многим другим вибриофагам, является мутация кластера генов rfb , который кодирует ферменты для синтеза LPS ¹⁰⁴ .В отсутствие рецептора антигена LPS O вибриофаг не может связываться или инфицировать бактериальную клетку. Все мутанты rfb -null V. cholerae O1, которые были протестированы на сегодняшний день, аттенуированы ^65,67,105 .

Вибриофаги в окружающей среде . В 1930-х годах было обнаружено, что случаи холеры положительно коррелировали с изоляцией вибриофагов в водной среде ¹⁰⁶ . В наше время была описана отсроченная положительная согласованность между ростом числа случаев холеры и последующим ростом вибриофагов в окружающей среде ¹⁰⁷ .Модель, разработанная Дженсеном и др. . предсказывает, что если вспышка будет инициирована увеличением содержания V. cholerae в окружающей среде, плотность вибриофагов впоследствии увеличится, что в конечном итоге будет способствовать сокращению вспышки ¹⁰⁸ . В Международном центре исследований диарейных заболеваний в Бангладеш (ICDDRB) рост случаев холеры был связан с согласованным, но отсроченным увеличением доли больных холерой с вибриофагами в стуле ¹⁰⁹ .Вибриофаги, идентифицированные в этом исследовании, были литическими вибриофагами (JSF4), хотя у пациентов можно выделить несколько типов вибриофагов ¹⁰⁷ . Титры вибриофагов в стуле из рисовой воды варьировались от 10 ² до 10 ⁸ бляшкообразующих единиц на миллилитр, что согласуется с другими публикациями ^65,67 . Несмотря на присутствие литических вибриофагов, все стула были положительными для V. cholerae и V. cholerae , как правило, по количеству вибриофагов, по крайней мере, на один порядок.Последующие исследования показали, что большинство бактериальных изолятов из стула все еще чувствительны к вибриофагам ^65,67 . Пока не ясно, почему вибриофаги в кишечнике человека не справляются с инфекцией V. cholerae , но эта «неудача» может играть важную роль в распространении клональной экспансии фагов во время вспышек ¹⁰⁹ .

Передача с точки зрения вибриофага . Современные эксперименты начали проверять гипотезу о том, что фаги могут ослаблять передачу бактерий.Например, тесты подвижности с использованием микроскопии в темном поле были использованы для быстрого скрининга стула из рисовой воды на наличие вибриофагов; стул, который был отрицательным в темном поле (не содержал подвижных вибрионов), с большей вероятностью содержал литические вибриофаги и имел низкое количество культивируемых клеток, но схожее общее количество клеток ⁷⁷ . С помощью этого косвенного измерения для фагов было обнаружено, что по крайней мере половина пациентов с холерой, которые наблюдались в течение 5-летнего периода в ICDDRB, содержали вибриофаги, а домашние контакты пациентов с положительным индексом вибриофагов имели меньшую вероятность инфицирования. с В.cholerae , чем люди, которые контактировали с пациентом, который не был фагоположительным ⁷⁷ . Эти результаты согласуются с выводом о десятикратном снижении инфекционной дозы V. cholerae , когда в стуле хозяина содержатся вибриофаги ⁶⁷ .

V. cholerae обычно превосходит литические бактериофаги сразу после пассажа от хозяина ^65,67 . В лабораторных экспериментах с использованием стула из рисовой воды, выращенного человеком, бактериофаги имеют начальный всплеск репликации в течение первых нескольких часов в водной среде и могут достигать отношения бактериофагов к бактериям примерно 1: 1 за 24 часа ^65,67 .Хотя гиперинфекция может сохраняться в течение нескольких часов после пассажа от хозяина ^65,70 , потеря культивирования (обсуждаемая выше) и расцвет бактериофагов в водной среде, вероятно, объединяются, чтобы блокировать передачу ⁶⁵ . Контрольные эксперименты с , полученным in vitro , производным V. cholerae и бактериофагами, подтверждают, что бактериофаги могут ограничивать бремя инфекции ^65,67 . Однако бактериофаги никогда не могут полностью блокировать инфекцию, потому что мутанты V.cholerae , у которых отсутствует зрелый LPS, избегают хищничества и колонизируют мышей, хотя и в меньшем количестве. Как уже упоминалось, мутанты LPS ослаблены и могут быть потеряны в естественном жизненном цикле V. cholerae ^65,67,105 .

Таким образом, динамическое взаимодействие между бактериофагом и бактерией в воде пруда предполагает, что модель передачи холеры должна включать в себя меру быстрого снижения способности бактерий к культивированию и уничтожения бактериофагами. В закрытой экспериментальной системе передача В.cholerae можно свести к минимуму, если эти два фактора сочетаются в водной среде. Следовательно, вероятно, будет преимущество пригодности для V. cholerae , которое быстро передается следующему хозяину, когда культивирование все еще остается высоким, а концентрация бактериофагов все еще низкая. В этом обзоре упоминалось несколько моделей, которые предлагают разные объяснения роста и падения вспышек с точки зрения хозяина (клинический спектр и коллективный иммунитет), бактерии (гиперинфекция) и бактериофага (хищничество).Мы объединили несколько опубликованных моделей в одну рабочую диаграмму, чтобы побудить задуматься о том, как эти факторы могут взаимодействовать в естественной среде (рис. 4). Лучшее понимание того, как функционирует интегрированная модель, может раскрыть возможности для вмешательств в области общественного здравоохранения.

Вся популяция (H) питает пул восприимчивых хозяев (S), которые становятся заразными (I) после употребления Vibrio cholerae из источника окружающей среды, с литическими бактериофагами или без них (Ф).Инфицированные люди имеют симптомы (I _symp ) или бессимптомны (I _asymp ) и выздоравливают (R) благодаря действиям своей иммунной системы и, возможно, литических бактериофагов, или погибают от инфекции (m). Выздоровевшие люди будут повторно попадать в пул восприимчивых с разной скоростью (//) в зависимости от степени защитного иммунитета. Литические фаги и гиперинфекционные V. cholerae (VC _Hi ) выделяются симптоматическим хозяином в различных концентрациях; бессимптомные хозяева выделяют гораздо меньше бактерий (пунктирная линия).Клетки VC _Hi быстро переходят к следующему хозяину, сохраняются в окружающей среде в виде культивируемых клеток с неизвестной инфекционностью (VC _C ) или распадаются в «активное, но не культивируемое» состояние (VC _ABNC ) с пониженной инфекционностью. Все три типа клеток плюс совокупные бактерии (не показаны), вероятно, играют смешанную роль в качестве резервуаров окружающей среды для будущих вспышек.

Заключительные замечания

Модель передачи, которая точно предсказывает масштабы возникающей вспышки, предоставит органам общественного здравоохранения полезную информацию для соответствующего масштабирования их ответных мер.Вмешательства, нацеленные на жизненно важные этапы передачи, могут быть эффективными для предотвращения вспышек. Иммунитет хозяина, гиперинфекция патогенов и фаги — все это факторы, которые можно использовать для борьбы со вспышкой. Например, централизованные центры управления отходами часто терпят неудачу в условиях нехватки ресурсов. Поскольку пациенты с симптомами выделяют более V. cholerae , а V. cholerae в стуле из рисовой воды является гиперинфекционным, вспышки холеры лучше всего остановить у источника, уменьшив воздействие на человека свежевыпущенного гиперинфекционного стула.Другими словами, при сохранении централизованного управления следует поощрять и проверять децентрализованные усилия по целевому управлению отходами в единице домашнего хозяйства. Эта концепция подчеркивает решающую важность уже проверенных, но простых мероприятий в домашних условиях, таких как использование кувшинов с узким горлышком, хлорирование хранящейся воды и мытье рук, для профилактики заболеваний. ^110,111 .

Еще многое предстоит узнать об эффективности вакцины в естественных условиях холеры.Отказ от традиционных мер оценки эффективности вакцин путем включения преимуществ коллективного иммунитета будет по-прежнему раскрывать истинное влияние как существующих вакцин, так и вакцин, находящихся в разработке. Кроме того, понимание воздействия хищничества бактериофагов и того, как вакцины снижают пул восприимчивости до такой степени, что передача не может продолжаться, являются важными областями для будущих исследований. Ответы на многие вопросы, поставленные в этом обзоре, имеют решающее значение для стран с ограниченными ресурсами, таких как Зимбабве, для оптимизации использования ограниченных запасов вакцины и борьбы с пагубными последствиями неудовлетворительной санитарии.

Коробка 1 | Иммунный ответ человека на

Врожденный ответ

Холера считается прототипом невоспалительной инфекции. Часто отсутствуют грубые изменения слизистой оболочки кишечника или архитектурной целостности тонкой кишки. Однако наблюдается повышенная регуляция провоспалительных цитокинов (включая интерлейкин-1β и фактор некроза опухоли), экспрессии различных бактерицидных белков и миграции нейтрофилов в собственную пластинку во время острой холеры.Естественная вариабельность врожденного иммунного ответа может влиять на восприимчивость, что подтверждается открытием, что полиморфизм в промоторной области гена LPLUNC1 (белок 1, связанный с карциномой длинного неба, легкого и носового эпителия) связан с повышенным риском холеры.

Адаптивный ответ

Неизвестно, как адаптивный иммунный ответ на холеру обеспечивает защиту от последующих заболеваний. Поскольку Vibrio cholerae неинвазивен, было высказано предположение, что секреторный иммуноглобулин А кишечника (sIgA) защищает от колонизации слизистой оболочки.Примерно через 8 дней после начала холеры наблюдается пик циркуляции антиген-специфических лимфоцитов V. cholerae , которые экспрессируют хемокиновые рецепторы кишечника (см. Рисунок) ¹¹² . Эти лимфоциты вскоре становятся необнаруживаемыми в крови, поскольку они возвращаются на слизистую оболочку кишечника, где они приводят к увеличению секреции sIgA в кишечнике. Реакции сывороточных антител, такие как реакция вибриоцидных антител, также достигают максимума через 1-3 недели после заражения. Хотя высокие сывороточные титры вибриоцидных антител и IgA, специфичного к холерному токсину, коррелируют с защитой от инфекции, эти антитела снижаются до исходного уровня через год после заражения, задолго до того, как защитный иммунитет против холеры ослабевает.Точно так же у добровольцев, инфицированных V. cholerae , уровни sIgA слизистой оболочки снижаются до исходного уровня в течение нескольких месяцев. Однако, когда добровольцев, у которых больше нет выявляемых антител, повторно провоцируют антигенами V. cholerae , они демонстрируют стойкую способность вызывать анамнестический иммунный ответ, развивая пиковую кишечную секрецию антител так же быстро, как в течение трех дней. Следовательно, возможно, что скорость анамнестического ответа на повторное воздействие, а не заранее сформированные антитела, может опосредовать защиту от холеры.Это подтверждается недавними данными о том, что холера вызывает ответ В-клеток памяти, который выявляется в течение по крайней мере 1 года после заражения холерой ¹¹³ .

Ящик 2 | Исследование бактериофагов

В 1915–1917 годах Twort ¹¹⁴ и d’Hérelle ¹¹⁵ независимо друг от друга открыли бактериофаги. Д’Эрелль определил, что бактериальная инфекция на животных моделях может быть ослаблена бактериофагами, и в 1925 году состояние пациентов с бубонной чумой улучшилось после того, как д’Эрелль ввел бактериофаги непосредственно в их бубоны (увеличенные лимфатические узлы).Эти открытия привели к исследованию бактериофагов, в задачу которого входило изучение терапии бактериофагом холеры в Индии ¹¹⁶ . Их первое испытание терапии сравнивало 244 нелеченных пациента с холерой с 219 пациентами с холерой, которых лечили вибриофагами; в нелеченой группе смертность составляла 20%, тогда как в обработанной группе — 6,8% (χ ² , p <0,01). Другие исследования показали аналогичные результаты ^5,116,117 . Несмотря на некоторые ограничения, характерные для той эпохи, расследование добилось достаточного успеха, чтобы расширить свои усилия. ⁵ .

За 1928, 1929 и 1934 годы, всего 36 000, 130 823 и 871 316 доз вибриофагов были подготовлены и распространены сотрудниками по расследованию в то время, когда начались вспышки в конкретных исследуемых сообществах в Индии ¹¹⁶ . Вибриофаги также распространялись в общественных источниках питьевой воды для профилактики. Смертность от холеры сравнивалась с контрольными сообществами до и после вмешательств. Трехлетний коэффициент смертности от холеры снизился с 30 до 2 на 10 000 в регионах, которые лечились вибриофагами ¹¹⁷ .Хотя эти исследования имели несколько ограничений, они предоставляют единственные доступные данные об эффективности терапии вибриофагами. Достижения в области регидратации и антибиотикотерапии в 1930-х и 1940-х годах сделали испытания бактериофагов, основанные на конечных точках смертности, неэтичными и статистически сложными ^116,118 .

Холера: молекулярная основа возникновения и патогенеза | Возбудители и болезни

1 Введение

Холера явно хорошо знает роль мрачного жнеца.Это одна из первых болезней, о которых думает большинство людей, когда приходит беда и цивилизация рушится. Мы видели, как это происходило несколько раз за последнее десятилетие, и наиболее ярким примером является смерть от холеры 80 000 человек в лагерях руандийских беженцев в Гоме, Заир, в 1994 году.

Хотя холера как болезнь, вероятно, не так давно как и другие, такие как туберкулез или оспа, очевидно, что он существует уже как минимум тысячу лет. Хотя существует множество диарейных заболеваний, интенсивность холеры и взрывоопасность эпидемий холеры очевидны и, должно быть, впечатлили древних наблюдателей.Например, в древнегреческой и китайской литературе есть описания, которые могли быть только холерой. Как отмечает Поллитцер, перевод Шмидта санскритской работы, происхождение которой считается Тибетом около 802 г. н.э., явно указывает на холеру:

«Когда сила добродетелей и заслуг на земле уменьшается, среди людей появляются первые из них. живущие на берегах больших рек, различные недуги, не дающие времени на лечение, но оказывающиеся смертельными сразу после их появления.… Различные сосуды выделяют воду, так что тело становится пустым… Его первые признаки — головокружение, онемение в голове, а затем сильнейшее очищение и рвота (Пер.) »[1].

Поллитцер также отметил, что в 1543 году исследователь Гаспар Корреа описал жертву холеры во время вспышки болезни в Индии, в которой уровень смертности превысил способность выживших хоронить мертвых:

«Так мучительно было муть, и так плохо с ней». что самый ужасный яд, похоже, подействовал, что доказывалось рвотой, сопровождающейся нехваткой воды, как будто живот пересох, и судорогами, фиксировавшимися в сухожилиях суставов и плоской стопе, с болью настолько сильной, что пострадавшие казались на грани смерти; глаза потускнели, а ногти на руках и ногах стали черными и выгнутыми »[1].

Нет сомнений в том, что эти тексты описывают полномасштабную азиатскую холеру. Это одно из известных заболеваний с наиболее быстрым смертельным исходом. От первого жидкого стула до гиповолемического шока может пройти от 4 до 12 часов в зависимости от размера пострадавшего. Смерть может наступить всего через 10–18 часов от появления симптомов, и без лечения до 80% жертв с симптомами умирают. Столь же драматично выздоровление от холеры. Ребенок, который явно находится на пороге смерти, может вернуться в страну живых в течение пары часов после внутривенной терапии.

Однако до развития внутривенной и ротовой заместительной терапии холера, по оценкам, уносила более 100 000 человек ежегодно только в Индии в 1900–1950 годах. Когда в начале 1800-х годов болезнь достигла пандемии, она убила миллионы людей во всем мире.

2 Распространение пандемии

В то время как многие бактериальные патогены могут вызывать диарею, только Vibrio cholerae , возбудитель холеры, вызывал повторные пандемии. С начала 19 века холера вызвала эпидемии практически на всех континентах.Несмотря на то, что Джон Сноу продемонстрировал свою инфекционную природу более века назад, мы все еще не в состоянии контролировать холеру во всех развивающихся странах. Несмотря на то, что существуют безопасные и эффективные вакцины, защищающие от V. cholerae , число погибших от холеры по-прежнему исчисляется тысячами во всем мире.

Считается, что пандемия холеры за пределами Азии началась менее двух веков назад. Первая пандемия холеры (вероятно, вызванная штаммами классического биотипа) началась в Индии в 1817 году и охватила Ближний Восток и Азию.С тех пор произошло еще шесть пандемий, последняя из которых началась в 1961 году и была вызвана биотипом Эль-Тор. Некоторые утверждают, что седьмая пандемия Эль-Тор теперь уступила место восьмой пандемии с появлением новой серогруппы холеры O139. В последнее время число случаев холеры во всем мире растет, во многом благодаря прибытию седьмой пандемии в Перу в 1991 году и появлению серогруппы O139 из V. cholerae в 1992 году. Между этими крупными вспышками заболевания холера по-прежнему присутствует на Индийском субконтиненте и в Африке в основном в эндемичных очагах.

3 Экологические факторы

V. cholerae — грамотрицательный патоген, который существует в виде свободноживущего организма в прибрежных водах по всему миру. Как и многие бактериальные патогены, он передается при приеме внутрь зараженной пищи и воды. Однако экология многих бактериальных патогенов — это область, о которой мы все еще очень мало знаем. Мы знаем, что V. cholerae может образовывать различные ассоциации с различными водными существами.Окружающая среда, по-видимому, играет важную роль в эпидемиях и распространении эндемической холеры. Однако мы не знаем конкретно, какие агенты в окружающей среде питают организм в этом отношении. Например, каковы правильные условия окружающей среды (температура, соленость и т. Д.), Которые позволяют эффективно передавать эту болезнь в эндемичных и эпидемических условиях?

4 Пандемические штаммы

Серогруппа V. cholerae определяется структурой его липополисахарида.Хотя несколько различных типов штаммов V. cholerae вызывают холеру, до 1993 года все эпидемические штаммы холеры относились к серогруппе O1, хотя известно более 150 различных серогрупп. Вероятно, первые шесть пандемий холеры были вызваны штаммами классического биотипа, в то время как большая часть холеры в современном мире вызвана другим биотипом, называемым «Эль Тор». Классические штаммы и штаммы Эль Тор имеют заметно разные хромосомные структуры, и сравнение последовательностей ДНК генов домашнего хозяйства показало, что штаммы Эль Тор и классические штаммы довольно отдаленно связаны друг с другом.Штаммы Эль Тор, вызывающие нынешнюю пандемию, более тесно связаны с непатогенными изолятами из окружающей среды. Таким образом, похоже, что пандемические штаммы произошли независимо от различных экологических клонов и, следовательно, вероятно, независимо приобрели серогруппу O1.

Серогруппа O139 появилась в 1992 г. у Бенгальского залива [2]. Это был первый штамм V. cholerae, не относящийся к O1, который вызвал эпидемическое заболевание. Он распространился от побережья Индии по большей части Южной Азии в течение нескольких месяцев после своего появления [3].Антиген O139 структурно сильно отличается от антигена O1. O139 содержит редкий сахар, колитозу, который полимеризуется в длинные цепи с образованием капсулы. Несколько линий доказательств предполагают, что штаммы O139, как правило, генетически тесно связаны со штаммами El Tor O1. Однако в O139 отсутствуют многие из генов, необходимых для создания антигена O1. Вместо генов O1 находится вставка размером 36 000 п.н., которая, по прогнозам, кодирует гены, участвующие в биосинтезе сахаров и синтезе полисахаридов [4].Содержание G + C в этой области варьируется в разных открытых рамках считывания, но некоторые из них очень отличаются от остальной хромосомы V. cholerae, что позволяет предположить, что вставка может быть получена из организма, отличного от Vibrio [4]. Опять же, мы не знаем, как произошла передача этой O139-специфической ДНК или, действительно, как даже был впервые приобретен антиген O1. Кажется вероятным, что нынешние эпидемические штаммы O139 произошли от эндемичного штамма O1 после приобретения новой ДНК O139 путем гомологичной рекомбинации, что привело к замене O1.

4.1 Происхождение пандемических штаммов

Откуда взялось V. cholerae , возбудитель холеры? Как возникли старые формы этого организма и как возникли новые? Будут ли те же молекулярные механизмы задействованы в появлении следующего нового пандемического патогена, который бросит вызов человечеству?

5 Детерминанты вирулентности

Исследования на добровольных началах научили нас, что обычно нужно проглотить большое количество организмов — по крайней мере, миллион жизнеспособных клеток — чтобы воспроизводимо вызвать заболевание.Это может быть не так в естественных условиях, где его связь с органическим материалом или водными организмами, такими как водоросли или планктон, может защитить его от кислотного барьера, который представляет собой наиболее важный защитный механизм против холерных вибрионов и других кишечных патогенов. Когда организм действительно попадает в тонкий кишечник в жизнеспособной форме, он затем использует различные свойства для эффективной колонизации этого участка. Например, моторика и хемотаксис направляют движение организма к эпителию кишечника, где он затем прикрепляется с помощью нитчатых структур, называемых «пили» или «фимбрия».Затем он размножается и вырабатывает различные токсины.

5.1 Холерный токсин

Самым важным из этих токсинов является, конечно же, холерный токсин, экзотоксин белка, ответственный за большую часть диареи, наблюдаемой при этой болезни [5]. Токсин холеры вызывает секрецию иона хлорида в просвет кишечника, а также ингибирует поглощение натрия. В результате возникает осмотическая водянистая диарея, которая приобретает вид рисовой воды — мутной жидкости с частичками слизи.В экспериментах на добровольцах приема внутрь всего нескольких микрограммов холерного токсина достаточно, чтобы вызвать 22 литра диареи. Конечно, вся эта диарея может способствовать распространению организма. Типичная диарейная жидкость от жертвы холеры содержит сто миллионов организмов на миллилитр.

Токсин холеры и пилус также увеличивают приспособленность V. cholerae в организме человека-хозяина. Это можно показать по специфическим мутациям в этих генах [6]. Мутации, инактивирующие токсин холеры, уменьшают степень колонизации, что измеряется, например, количеством бактерий, выделяемых на грамм стула у добровольца.Мутации, влияющие на выработку особого ворсинок, называемого корегулируемым токсином пилюса (TCP), полностью уничтожают способность организмов колонизировать кишечник [6]. Таким образом, присутствие этих факторов усиливает кратковременную репликацию организма в кишечнике человека, и эта усиленная репликация также должна способствовать эволюционной приспособленности штаммов, несущих гены этих факторов вирулентности.

5.2 Факторы колонизации

Широкое определение В.Факторы колонизации cholerae включают все продукты бактериальных генов, которые специфически способствуют либо выживанию, либо размножению бактерий в тонком кишечнике. Это определение включает многие бактериальные факторы и свойства, которые включают, но не ограничиваются ими, те, которые опосредуют прикрепление вибрионов к эпителию тонкой кишки. Безусловно, наиболее важным фактором колонизации V. cholerae является TCP. Эта ворсинка была обнаружена нашей лабораторией как структура, которая координируется с холерным токсином [6].То есть в лабораторных условиях, когда штаммы V. cholerae экспрессируют большие количества токсина холеры, они также экспрессируют большие количества TCP.

Несколько лет назад наша лаборатория изучала молекулярные основы координационной регуляции холерного токсина и TCP [6,7]. Любопытно, что подавляющее большинство штаммов V. cholerae не вырабатывают ни холерный токсин, ни TCP в лабораторных условиях. Однако все клинические изоляты продуцируют эти факторы вирулентности в кишечнике.Таким образом, проявление вирулентности с помощью V. cholerae является регулируемым свойством. В конце концов мы клонировали многие из генов, участвующих в этой регуляции, но одним из наиболее важных является ген под названием toxR . Экспрессия как холерного токсина, так и TCP полностью зависит от регуляторного гена toxR [7]. ToxR, продукт гена, представляет собой мембранный белок, который, возможно, воспринимает сигналы окружающей среды в кишечнике, а затем активирует экспрессию холерного токсина и генов TCP.

Мутантные штаммы V. cholerae , которые не вырабатывают TCP, обладают более чем 1000-кратным снижением способности колонизировать детенышей мыши и по существу не колонизируют кишечник добровольцев человека [8]. Механизм, с помощью которого TCP опосредует колонизацию тонкой кишки V. cholerae , еще не выяснен. Хотя кажется вероятным, что некоторая часть пилуса функционирует как адгезин для энтероцитов, на сегодняшний день такое связывание четко не установлено.Известно, что TCP объединяется в «связки», и выражение TCP вызывает автоагглютинацию V . холеры культур. Такое слипание может отражать аналогичную роль TCP в создании микроколоний на кишечном эпителии.

5.3 Передача генов вирулентности

Все эпидемические штаммы V. cholerae продуцируют холерный токсин, состоящий из пяти копий B-субъединицы, связанных с одной копией A-субъединицы, кодируемой генами ctxA и ctxB [9].Поскольку гены ctxAB были использованы в гибридизационном анализе различных штаммов V. cholerae , мы и другие исследователи в этой области начали делать любопытные наблюдения. Не все штаммы V. cholerae несут гены токсина холеры. Фактически только эпидемические штаммы V. cholerae имели токсиновые гены, а штаммы из окружающей среды, как правило, не имели. Другой характеристикой большинства (но не всех) экологических штаммов V. cholerae было отсутствие традиционного антигенного поверхностного покрытия эпидемических штаммов, антигена O1 или серогруппы.Таким образом, можно было сгруппировать штаммов V. cholerae в различные подгруппы, но только токсикогенные штаммы O1 были связаны с эпидемиями до 1993 года. Это предполагает, что должен существовать механизм, позволяющий этим штаммам либо приобретать гены токсина холеры, либо терять их. . Это наблюдение побудило нас провести подробный анализ генетической структуры ДНК в районе генов ctxAB .

В конце концов мы обнаружили, что гены ctxAB находятся в пределах области на V.cholerae , которую называют CTX-элементом [10]. Этот сегмент ДНК часто дублировался в токсигенных штаммах и имел размер около 7000 п.н. В конце концов несколько других лабораторий, в частности лаборатория Джима Капера в Мэриленде, заинтересовались элементом CTX и сообщили, что два гена, соседние с ctxAB , по-видимому, кодируют белки с энтеротоксической активностью. Они назывались ace и zot . Кроме того, элемент CTX кодирует пептид, продукт гена cep , который напоминает генный продукт другого пилуса, продуцируемого бактерией Aeromonas .Другой ген, orfU , также был идентифицирован, который кодирует неизвестную функцию. Эта группа генов содержится в части элемента CTX, известной как «ядро», потому что она обычно фланкируется с обеих сторон другой последовательностью, называемой «RS», для повторяющейся последовательности. Элемент RS, как известно, кодирует систему сайт-специфической рекомбинации, которая катализирует интеграцию плазмид, несущих этот элемент, в геном V. cholerae [10]. В целом, элемент ctx считался сайт-специфичным транспозоном, но мы не имели ни малейшего представления о том, как этот транспозоноподобный элемент переместился в V.cholerae и откуда она взялась. Однако его химические характеристики позволяют предположить, что он имел другое происхождение, а не V. cholerae .

6 Роль бактериальных вирусов

6.1 Трансдукция

К нашему удивлению, мы в конце концов обнаружили, что элемент ctx может передаваться между штаммами, но для демонстрации этого потребовались очень точные лабораторные условия [11]. Мы показали это, сначала заменив гены токсина холеры кассетой, кодирующей устойчивость к антибиотику канамицину.Штаммы, содержащие ген устойчивости к канамицину вместо структурных генов ctx, были способны передавать устойчивость к антибиотикам другим штаммам. Эта передача не требовала межклеточного контакта. Фактически, отфильтрованные культуральные супернатанты донорских штаммов были способны опосредовать передачу фенотипа. Добавление нуклеаз к супернатантам не ингибировало этот перенос [11]. Эксперименты показали, что, вероятно, вирусная частица опосредует перенос гена устойчивости к канамицину, встроенного в элемент CTX.Бактериальные вирусы называются «бактериофагами» или просто «фагами». Когда фаг перемещает бактериальную ДНК из одной бактериальной клетки в другую, этот процесс называется «трансдукцией».

6.1.1 Источник генетических элементов

Электронно-микроскопические исследования показали, что концентраты супернатов культур донорских штаммов содержат структуры, сходные по морфологии с нитчатыми бактериофагами. Было обнаружено, что при частичной очистке эти фаги содержат геном однонитевой ДНК размером 7000 п.н., кодирующий элемент CTX.Таким образом, элемент CTX фактически представляет собой геном нитчатого бактериофага [11].

Фактически, некоторые гены в элементе ctx напоминают гены известных нитчатых фагов. Кунин отметил, что предсказанная последовательность белка, кодируемого геном zot , напоминала последовательность продукта гена I фага M13 Escherichia coli , белка внутренней мембраны, необходимого для сборки фага [12]. Другие продукты генов CTX-элементов напоминают другие белки нитчатых фагов и действительно, как было показано, необходимы, как zot , для морфогенеза CTX-фагов.Однако геном фага CTX весьма необычен тем, что он может интегрироваться в хромосому хозяина в определенном месте или реплицироваться в виде плазмиды. На сегодняшний день наши данные позволяют предположить, что геном фага CTX имеет три функциональных модуля. Первый модуль, элемент RS, отвечает за интеграцию, репликацию и их регулирование. Центральная область, которая содержит гены структуры и морфогенеза фага, составляет второй модуль. Третий модуль, генов ctx , вероятно, не выполняет функции репликации или морфогенеза фага, а представляет собой просто ген токсина, улавливаемый фагом.

Интересно, что все известные нитчатые фаги (которых всего около дюжины) используют пили в качестве рецепторов на бактериальных клетках. Рецептор — это структура, с которой фаг связывается на первом этапе доставки своей ДНК в бактериальную клетку-мишень. Мы были несколько шокированы тем, что фаг CTX на самом деле использует TCP в качестве рецептора. Как вы помните, TCP-пилус чрезвычайно важен в патогенезе холеры. В модели холеры у новорожденных мышей и у людей-добровольцев было показано, что TCP требуется для V.cholerae колонизация тонкой кишки [6,8]. Мутации в tcpA (главный ген пилина) предотвращают заражение фагом CTX, как и антисыворотка к пилусу.

Требование к штаммам-хозяевам экспрессировать TCP-пилус для инфицирования фагом CTX имеет важные последствия. В то время как штаммы классического биотипа (которые вызвали пандемии до текущей пандемии) экспрессируют TCP в различных конкретных лабораторных условиях, штаммы El Tor (возбудители текущей пандемии) плохо экспрессируют TCP ни при каких условиях in vitro.Ясно, однако, что TCP должен экспрессироваться во время инфекции, потому что мутанты TCP даже штаммов El Tor дефектны в колонизации у людей и мышей. Вывод был очевиден и, наконец, поддается проверке. Пили TCP экспрессируются штаммами El Tor in vivo.

Мы разработали эксперимент для проверки этой гипотезы, которую мы называем «трансдукцией in vivo». Что мы сделали, так это смешали штамм-реципиент Эль-Тор со штаммом-донором фага CTX, а затем либо культивировали эти штаммы вместе in vitro в лаборатории, либо, альтернативно, совместно инфицировали эти штаммы мыши.Мы обнаружили, что реципиенты Эль-Тор, полученные из кишечника мыши после такой коинфекции, инфицированы фагом СТХ со скоростью более чем в миллион раз выше, чем в условиях in vitro. Зараженное млекопитающее-хозяин — единственная известная в настоящее время естественная среда, в которой TCP эффективно экспрессируется штаммами El Tor. Поскольку фаг CTX был получен из штамма El Tor, мы должны прийти к выводу, что наиболее вероятное место появления первых токсигенных штаммов El Tor находится в кишечнике человека.По аналогии, появление других новых штаммов V. cholerae может происходить у людей-хозяев, коинфицированных токсиногенными (CTX +) и нетоксиногенными (CTX-) штаммами V. cholerae . Это напоминает перегруппировку генома гриппа, приводящую к антигенному сдвигу, который происходит у многократно инфицированных животных.

Известно, что многие детерминанты бактериальной вирулентности кодируются бактериофагами умеренного климата. К ним относятся токсины, такие как ботулотоксины, стафилококковые энтеротоксины и мощный шига-подобный токсин O157 E.coli . Такие токсины, кодируемые фагами, вызывают большую озабоченность во всем мире. Например, недавно сообщалось, что 4% жителей города Сакаи, Япония, были колонизированы O157 E. coli во время вспышки болезни летом 1996 года. Однако источник этого патогенного штамма все еще остается не понятно. Таким образом, характеристика того, что кодируется фагами, может быть ценным инструментом наблюдения для отслеживания того, какие гены вирулентности находятся «где-то там» и перемещаются по горизонтали между различными штаммами и видами бактерий.Было несколько умеренных фагов, которые были описаны в V. cholerae ; однако в выявлении связи между присутствием этих фагов и вирулентностью достигнут незначительный прогресс. Большинство кодируемых фагами генов вирулентности были идентифицированы только после распознавания их белкового продукта и затем обнаружения того, что кодирующая последовательность связана с фагом.

Незадолго до нашего открытия фага CTX мы получили дополнительные доказательства того, что другой вибриофаг может быть связан с изменениями вирулентности в V.холеры. Этот фаг, названный K139, относится к семейству каппа бактериофагов, ранее описанных в серогруппе O1 V. cholerae . K139 был первоначально выделен из штамма O139, но его можно найти во множестве вирулентных штаммов. Фаг содержит геном двухцепочечной линейной ДНК, который интегрируется с сайт-специфичностью в хромосому V. cholerae .

Мы использовали генетический метод для идентификации генов, которые кодируют секретируемые продукты в фаге K139 [13].Поскольку генные продукты, необходимые для того, чтобы вызывать заболевание, часто являются секретируемыми белками, такие гены могут представлять собой кодируемые фагом факторы вирулентности. Мы обнаружили, что только один ген на фаге K139 кодирует секретируемый белок. Эта открытая рамка считывания была обозначена как ген glo . Сравнение продукта гена glo с другими известными белками показало, что он имеет значительное сходство последовательностей с эукариотическим GTP-связывающим белком, Gs-a, одной из регуляторных субъединиц аденилатциклазы и субстратом для ADP-рибозилирования холерным токсином.Важно отметить, что С-конец белка Glo содержит мотив, который предполагает, что он модифицирован ферментами, которые катализируют изопренилирование остатков цистеина вблизи С-концов. Это модификация, которая присутствует во множестве G-белков мелких млекопитающих, но ранее не было продемонстрировано, что она происходит на бактериальном субстрате. Сходство Glo с G _sa особенно интересно, учитывая, что сам холерный токсин нацелен на G _sa и для его активности требуется второй GTP-связывающий белок (ARF).Таким образом, Glo может быть новым кодируемым фагом токсином, который действует как гомолог эукариотических G-белков.

Важен ли Glo при вирулентности? Мутанты говорят да! Было обнаружено, что у мышей чаще наблюдается диарея при заражении бактериями, содержащими ген glo дикого типа, чем при инфицировании мутантами glo . Кроме того, количество бактерий, необходимых для уничтожения детенышей мышей, было по крайней мере в 10–100 раз выше для glo мутантов V. cholerae . Эти результаты предполагают, что glo действительно играет роль в вирулентности V.холера . Тот факт, что большинство штаммов V. cholerae O139 несут бактериофаг K139, является дополнительным доказательством того, что этот фаг, возможно, также способствовал появлению серогруппы O139.

Еще один интересный элемент, возможно, способствовал появлению O139. Когда в конце 1992 г. серогруппа O139 начала вызывать заболевание на юго-востоке Индии, изоляты оказались устойчивыми к ряду антибиотиков [2,3]. Такой образец устойчивости к стрептомицину, триметоприму, сульфаметоксазолу и фуразолидину не был характерен для эндемичных штаммов O1 из того же района.Генетический анализ показал, что гены устойчивости к трем из этих антибиотиков — стрептомицину, триметоприму и сульфаметоксазолу — физически связаны. Кроме того, эксперименты по спариванию показали, что все эти три сопротивления могут передаваться между различными штаммами V. cholerae и даже от V. cholerae на E. coli [14]. Невозможно выделить плазмиды ни из донорского, ни из реципиентного штаммов. Саузерн-блот-анализ штаммов реципиентов показал, что они приобрели новую хромосомную вставку размером 62 т.п.н., содержащую гены устойчивости к антибиотикам, известные как «элемент SXT».Механизм переноса элемента SXT неясен. Бесклеточные супернаты не переносят элемент.

Попадая в клетку-реципиент, элемент SXT не реплицируется, а вместо этого интегрируется в геном хозяина. Эти свойства напоминают конъюгативные транспозоны, которые могут передаваться при спаривании между бактериями. Примечательно, что конъюгативные транспозоны из видов Bacteroides также способны опосредовать перенос ДНК, которая находится за пределами границ транспозона.Таким образом, элемент SXT может представлять собой средство, с помощью которого несколько разных несвязанных хромосомных локусов V. cholerae могут обмениваться между разными штаммами V. cholerae и, возможно, другими бактериями. Мы также еще не знаем, кодирует ли элемент SXT гены вирулентности, а также устойчивость к антибиотикам.

7 островов патогенности

Вставки, подобные элементу SXT, формально похожи на большие вставки хромосомной ДНК, переносимые многими другими бактериальными патогенами.Когда эти хромосомные вставки несут гены вирулентности, их называют «островами патогенности». Эти кластеры генов часто соседствуют с локусами тРНК и рибосомной РНК и часто имеют особенности, которые предполагают чужеродное происхождение.

Примечательно, что второй по важности фактор вирулентности V. cholerae, по-видимому, кодируется островком патогенности. Как отмечалось ранее, для эффективной колонизации кишечного тракта V. cholerae требуется TCP. Гены биосинтеза TCP пилуса содержатся в сегменте ДНК, который отсутствует во многих непатогенных штаммах V.холеры. Кажется весьма вероятным, что остров tcp первоначально возник в результате горизонтального переноса генов и, возможно, продолжает передаваться. Фактически, использование кодонов внутри острова отличается от использования кодонов в остальной части хромосомы, что позволяет предположить, что он мог возникнуть у другого вида бактерий. Механизм передачи острова tcp и других островов патогенности пока не ясен. Ни о каких случаях передачи острова пока не сообщалось. По мере того, как становится доступным больше информации о последовательностях, мы можем распознавать больше генов, связанных со специфическими механизмами горизонтального переноса генов.Основываясь на том, что мы узнали до сих пор, мы прогнозируем, что островок TCP будет перемещаться либо путем фаговой трансдукции, либо путем конъюгации.

7.1 Модель для появления деформации

Наши данные предполагают, что появление V. cholerae включает горизонтальное перемещение генов как рецептора TCP для фага CTX, так и самого фага CTX. Это движение, вероятно, происходит в кишечнике человека, где рецепторы фага экспрессируются под контролем регуляторной системы ToxR.

8 Условия для новых пандемий

Что вызывает новые пандемии холеры? Ясно, что для новой вспышки болезни необходимы как восприимчивая популяция, так и опасный организм. Поскольку инфицирование эпидемическим штаммом V. cholerae приводит к длительному (возможно, пожизненному) иммунитету, восприимчивая популяция должна содержать достаточно большое количество людей, которые либо никогда не болели холерой, либо, по крайней мере, никогда не были инфицированы антигенно родственным штаммом. .В эндемичных регионах заболеваемость холерой сильно смещена в сторону детей, у которых не было возможности развить защитный иммунитет. В условиях нынешней эпидемии в Латинской Америке, где холера не наблюдалась задолго до начала этого столетия, страдают как взрослые, так и дети. Таким образом, для девственной, неиммунной популяции простое введение вирулентного штамма может вызвать эпидемию. В других иммунных популяциях появилась недавно возникшая, антигенно отличная версия V.cholerae может быть гораздо более подходящим, чем антигенно более старые штаммы.

Самым ярким примером этого является недавняя вспышка холеры O139. Рост числа случаев холеры также был связан с необычным числом случаев среди взрослых. Как указывалось ранее, штаммы O139 не экспрессируют антиген серогруппы O1, который был характерен для всех предыдущих эпидемических штаммов. Вместо этого штамм содержал новый антиген серогруппы, O139, устойчивость к антибиотикам, которой не хватало резидентным штаммам, и, возможно, один или два бактериофага, которые кодировали дополнительные факторы вирулентности.

9 Заключение

Теперь мы понимаем, что многие ключевые факторы вирулентности V. cholerae кодируются мобильными генетическими элементами. Передача генов вирулентности — распространенная тема среди патогенных бактерий. Стало ясно, что горизонтальный перенос генов сыграл важную роль в эволюции пандемических штаммов V. cholerae . Патогенные V. cholerae обитают в море авирулентных V. cholerae . Учитывая способность детерминант вирулентности перемещаться между штаммами, эти авирулентные бактерии представляют собой резервуар потенциальных новых эпидемических штаммов.Ограничивающим скорость событием, контролирующим появление новых штаммов, может быть их контакт друг с другом в среде, подходящей для переноса генов (то есть в кишечнике). Полученные нами сведения о системе V. cholerae предоставляют нам не только модели появления этого патогена, но и модели того, как у бактерий развиваются координационные регуляторные системы, контролирующие вирулентность. Теперь мы знаем, что среда внутри хозяина играет важную роль в модуляции экспрессии фактора вирулентности.То, что перенос элементов, которые кодируют факторы вирулентности между бактериями, также должен зависеть от экспрессии этих же факторов вирулентности, шокирует, но понятно [15]. Ясно, что эволюционные отношения между всеми тремя сторонами в этом взаимодействии (бактериофаг, бактерия и человек-хозяин) тесно зависят друг от друга и эффективно происходят только в одном месте — в кишечном тракте человека.

Список литературы

(

1959

Холера

Всемирная организация здравоохранения

Женева

(

1993

Крупная вспышка клинической холеры, вызванная Vibrio cholerae non-O1 в Бангладеш

Ланцет

341

704

(

1994

Распространение холерного вибриона O139 Бенгалия в Индии

J. Infect. Дис.

169

1029

1034

(

1996

Клонирование и последовательность области, кодирующей поверхностный полисахарид Vibrio cholerae O139, и характеристика сайта вставки в хромосому Vibrio cholerae O1

Мол. Microbiol.

19

815

826

(

1992

Холерный энтеротоксин (холераген): историческая перспектива

Cholera

155

187

Пленум

Нью-Йорк, Нью-Йорк

(

1987

Использование слияний генов phoA для идентификации фактора колонизации пилуса, координируемого с помощью холерного токсина

Proc. Natl. Акад. Sci. США

84

2833

2837

(

1992

Координировать экспрессию генов вирулентности с помощью ToxR в Vibrio cholerae

Мол. Microbiol.

6

451

458

(

1988

Токсин, токсин-корегулируемые пили и регулон toxR необходимы для патогенеза Vibrio cholerae у людей

J. Exp. Med.

168

1487

1492

(

1983

Гены холерного токсина: нуклеотидная последовательность, делеционный анализ и разработка вакцины

Природа

306

551

557

(

1993

Генетический элемент CTX кодирует систему сайт-специфической рекомбинации и фактор колонизации кишечника

Proc. Natl. Акад. Sci. США

90

3750

3754

(

1996

Лизогенная конверсия нитчатым фагом, кодирующим токсин холеры

Наука

272

1910

1914

(

1992

Второй холерный токсин, Zot, и его кодируемые плазмидой и фагом гомологи составляют группу предполагаемых АТФ-аз с измененным пуриновым NTP-связывающим мотивом

FEBS Lett.

312

3

6

(

1995

Характеристика бактериофага K139 Vibrio cholerae и использование нового мини-транспозона для идентификации кодируемого фагом фактора вирулентности

Мол. Microbiol.

18

685

701

(

1996

Новый тип конъюгированного транспозона кодирует устойчивость к сульфаметоксазолу, триметоприму и стрептомицину у Vibrio cholerae O139

J. Bacteriol.

178

4157

4165

(

1996

Модуляция горизонтального переноса генов у патогенных бактерий с помощью сигналов in vivo

Ячейка

87

795

798

© 1997 Федерация европейских микробиологических обществ.

Холерный токсин — обзор

Помимо того, что CT и LT являются сильными иммуногенами слизистой оболочки, они также являются мощными адъювантами слизистой оболочки (Holmgren et al. , 1993). Они сильно усиливают иммуногенность большинства других антигенов, независимо от того, связаны ли они с токсинами или просто смешаны с ними, при условии, что другой антиген вводится одновременно и на той же поверхности слизистой оболочки, что и токсины.Однако, поскольку как CT, так и LT обычно считаются слишком токсичными для использования человеком, в последнее время были предприняты большие усилия, чтобы определить, можно ли разделить адъювантную и токсическую активности в качестве основы для разработки адъювантов слизистой оболочки для использования человеком. .

Адъювантное действие CT и LT

CT и LT может влиять на несколько этапов индукции иммунного ответа слизистой оболочки. Эти эффекты, которые по отдельности или в комбинации могут объяснить их сильное адъювантное действие после пероральной иммунизации, включают: (i) повышенную проницаемость кишечного эпителия, ведущую к усиленному поглощению совместно вводимого антигена; (ii) усиление презентации антигена различными APC; (iii) стимулирование дифференцировки изотипов в В-клетках, приводящее к повышенному образованию IgA; и (iv) комплексное стимулирующее, а также ингибирующее действие на пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов.Кроме того, было показано, что CT и LT не только предотвращают индукцию пероральной толерантности, но также отменяют эффективные схемы индукции толерантности путем перорального введения антигена (Holmgren et al. , 1993; Lycke, 1997).

Среди этих многих эффектов те, которые приводят к усиленной презентации антигена различными APC, вероятно, имеют наибольшее значение для адъювантной активности. СТ заметно увеличивает презентацию антигена дендритными клетками (ДК), макрофагами и В-клетками, а также было обнаружено, по крайней мере, in vitro , чтобы сделать эпителиальные клетки кишечника эффективными APC (Gagliardi et al., 2002). В соответствии с этой активностью CT активирует экспрессию молекул MHC / HLA-DR, костимулирующих молекул CD80 / B7.1 и CD86 / B7.2, а также хемокиновых рецепторов, таких как CCR7 и CXCR4, как на мышах, так и на мышах. человеческий DC и другие APC (Gagliardi et al. , 2002; Eriksson et al. , 2003). Важно отметить, что CT также индуцирует секрецию IL-1 из DC (Eriksson et al. 2003), таким образом подтверждая аналогичные наблюдения, сделанные ранее для макрофагов. IL-1 не только индуцирует созревание DC, но и сам по себе является эффективным адъювантом слизистой оболочки при совместном введении с белковыми антигенами и может опосредовать значительную часть адъювантной активности CT (Staats and Ennis, 1999).

Было заявлено, что СТ в первую очередь индуцирует иммунные ответы типа Th3, характеризующиеся наличием CD4 + Т-клеток, продуцирующих IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10, и продуцированием антител IgA, IgG1 и IgE. С другой стороны, сообщалось, что LT вызывает смешанный иммунный ответ Th2- и Th3-типа. Однако другие исследования показали, что CT также может вызывать смешанные типы иммунных ответов Th2 и Th3, в отличие от CTB, которые, по-видимому, вызывают более ограниченный тип иммунного ответа Th3 (Eriksson et al., 2003). Таким образом, DC, который был предварительно обработан in vitro белковым антигеном (овальбумин, OVA), связанным или смешанным с CT, а затем введен мышам антиген-специфическим образом, индуцировал как Th2-, так и CTL-ответы в дополнение к Ответ Th3. Напротив, импульсный DC in vitro с OVA, связанным с CTB, вызывает только иммунный ответ типа Th3.

Метаболиты, производные комменсала, определяют патогенез холерного вибриона в кишечнике хозяина | Микробиом

Вазоактивный кишечный пептид (VIP) в патогенезе холеры — описательное исследование — Global Task Force on Cholera Control

Краткое описание проекта

Фон

Холера — это быстро обезвоживающее диарейное заболевание, которое остается глобальной угрозой для здоровья населения.По недавним оценкам, в странах, эндемичных по холере, зарегистрировано около 2,8 миллиона случаев холеры и 91 500 случаев смерти от холеры. На сегодняшний день не существует лекарств, которые могли бы быстро уменьшить холерный понос.

Пробел в знаниях

В настоящее время не проводились исследования, чтобы понять, является ли вазоактивный кишечный полипептид (VIP) медиатором в патогенезе холеры.

Актуальность

Если VIP является медиатором холерной диареи, антагонисты / блокаторы VIP могут значительно уменьшить холерный понос.Надеюсь, это может снизить заболеваемость и смертность от холеры в эндемичных странах.

Цели

Для определения уровней VIP в стуле холеры рисвотер и в плазме пациентов, полученных одновременно, как до, так и после коррекции тяжелого обезвоживания с использованием стандартной внутривенной регидратации и поддерживающей терапии. Тем самым подтвердить роль VIP в патофизиологии холеры.

Методы

Это будет описательное исследование, в исследуемую популяцию войдут пациенты любого пола в возрасте от 18 до 64 лет, посещающие больницу ICDDR в Дакке b с тяжелым обезвоживанием из-за холеры.Образцы стула и венозной крови из ректального катетера будут взяты непосредственно перед началом регидратационной терапии, после регидратации, через 24 часа после регидратации и перед выпиской.

Показатели / переменные результата

Первичным критерием оценки будет уровень VIP стула и плазмы до и после коррекции тяжелого обезвоживания. , и общий объем полученного ПРС, развитие серьезных осложнений по решению лечащего врача.

Краткое содержание

Холера — это диарейное заболевание, которое может быстро вызвать сильное обезвоживание. Холера остается глобальной угрозой общественному здоровью. По недавним оценкам, в странах, эндемичных по холере, зарегистрировано около 2,8 миллиона случаев холеры и 91 500 случаев смерти от холеры. На сегодняшний день не существует лекарств, которые могли бы быстро уменьшить холерный понос. В настоящее время не проводились исследования, чтобы понять, является ли вазоактивный кишечный пептид (VIP) медиатором в патогенезе холеры.Если VIP является медиатором холерной диареи, антагонисты / блокаторы VIP могут значительно уменьшить холерный понос. Надеюсь, это может снизить заболеваемость и смертность от холеры в эндемичных странах.

Потенциал воздействия на общественное здоровье или принятие решений в области глобального здравоохранения

Если VIP является медиатором холерной диареи, антагонисты / блокаторы VIP могут значительно уменьшить холерный понос. Надеюсь, это может снизить заболеваемость и смертность от холеры в эндемичных странах.