Усвояемость и доступность питательных веществ в пчелиной пыльце при различных предварительных обработках

1. Введение

Пчелы играют важную роль в поддержании биоразнообразия растений, обеспечивая воспроизводство растений и генетическое разнообразие путем опыления (Saavedra et al, 2013).Цветочная пыльца — секреторный продукт в мужских органах растений, это мужская гамета семян (голосеменных и покрытосеменных). Тело пчел специально предназначено для сбора цветочной пыльцы, материала, который является их основным источником питательных веществ (белков, липидов, витаминов, минералов, антиоксидантов и др.). Пчела образует маленькие шарики или шарики цветочной пыльцы путем агломерации путем добавления нектара и слюнной секреции, затем пчела переносит их в улей, неся по одному шарику или шарику пыльцы в корбикулах каждой задней ноги.Поэтому продукт, приготовленный пчелами, называется пчелиной пыльцой или корбикулярной пыльцой (май 2012 г.).

Увеличилось потребление пчелиной пыльцы как полезного и лечебного продукта с точки зрения ее питательных свойств, источника белков, липидов, витаминов, минералов (Campos et al, 2008), аминокислот, каротиноидов, флавоноидов, фенольных соединений, антиоксидантов. , каротины и ксантофиллы (Jean-Prost, 2007), имеющие важное значение для нового образа жизни, ориентированного на здоровое питание.Соответственно, пыльца является вторым продуктом пчеловодства с высоким потенциалом коммерциализации в Колумбии с точки зрения ее преимуществ в отношении погодных и ботанических условий, географического положения и биоразнообразия, что приносит стране огромные экономические и социальные выгоды (LABUN, 2006; Martinez, 2006 г.).

Как следствие, Производственная цепочка пчеловодства и пчеловодства — CPAA разработала стратегический план действий на 2011-2025 годы (CPAA, 2011), который направлен на признание потенциала и проблем пчеловодства посредством выявления угроз и слабых сторон. , сильные стороны и возможности для производителей и потребителей.Эта организация также прогнозирует рост производства пыльцы на 5% в 2015 году с показателем 38 кг / улей / год, а к 2025 году — рост на 8%, в среднем 40 кг / улей / год. В рамках национальной политики конкурентоспособности и производительности экологическая устойчивость рассматривается как фактор конкурентоспособности, полезный в соответствии с законами и природоохранными нормами, для содействия производственному процессу и мотивации развития деловых возможностей (Martinez, 2006; CONPES, 2008).В этом смысле стратегический план установил союзы с различными участниками CPAA, чтобы способствовать развитию конкуренции с помощью нескольких стратегий, которые увеличивают производство, коммерциализацию и исследования.

Однако есть сообщения о сложной структуре пыльцы, которая отрицательно влияет на усвояемость пищевых соединений, что приводит к низкой абсорбции в кишечном тракте людей и пчел (Hesse et al, 2009; Zuluaga et al, 2014). Пыльца окружена сложной защитной внешней мембраной, называемой экзиной, которая отличается устойчивостью и твердостью и состоит из спорополленина, биополимеров, таких как кутин (состоящий из жирных кислот для защиты поверхности клетки), суберин (длинноцепочечный полимер). жирные кислоты) и лигнины (фенольные соединения) (Zuluaga et al, 2014).Эти биополимеры защищают пыльцу от высыхания в течение длительных периодов времени и предотвращают гибель клетки. Напротив, внутренняя стенка пыльцы, называемая интиной, которая покрывает протоплазму, тонкая с низким сопротивлением, состоит из целлюлозы и пектина. Кроме того, сообщается, что пыльцевое зерно содержит другие соединения, такие как токоферолы, провитамин А, витамин D и фитостерины, которые защищают его от окисления; а также селен, минерал, предохраняющий пыльцу от повреждений, вызванных ультрафиолетовым излучением (Gavarayeba, 1996).

Этот проект направлен на то, чтобы стать альтернативой повышению ценности пыльцы в качестве пищи путем разработки процессов трансформации с применением различных предварительных обработок с целью увеличения доступности питательных соединений и улучшения усвояемости пыльцы для потенциального использования в рационе человека.

2. Материалы и методы

2.1 Сырье

Пчелиная пыльца

В данном исследовании использовалась высушенная коммерческая пыльца, распространяемая компанией Apiario Los Cerezos, расположенной в муниципалитете Виракача, департамент Бояка.Образцы хранили в мешках из полистирола и защищали от света для их коммерческого использования.

2.2 Аналитическая методология, использованная при мониторинге экспериментов

Методы, принятые для оценки воздействия предварительной обработки на пыльцу пчел, объясняются в следующих разделах.

2.2.1 Предварительная термообработка сухим теплом

Образец пыльцы был скорректирован в соотношении 1: 2 к воде, нейтрализован 5N NaOH, чтобы использовать методологию, описанную Fuenmayor (2009) и Salazar (2014), применяя их лучшую обработку, стерилизацию при 121 ° C в течение 15 минут. , чтобы получить микробиологически стабильную пыльцу.

2.2.2 Предварительная термическая обработка атмосферным теплом

Образец пыльцы был доведен до отношения 1: 2 к воде, затем его поместили в закрытый контейнер примерно при 130 ° C и 2 атм на 2 мин после достижения такого давления для нейтрализации 5н NaOH. Наконец, его стерилизовали при 121 ° C в течение 15 мин.

2.2.3 Предварительная обработка Enzimatic

Методология, описанная Castro et al. (2014) с некоторыми модификациями считалось инициирующим с пыльцой в естественном состоянии с использованием коммерческого фермента Protamex TM, поставляемого Coldaenzimas Ltda.Образец пыльцы корректировали с помощью 0,1 н. NaOH, изменяя его pH с 5,5 до 7,5. Применяли соотношение 0,01 г энзима / г полюса, а затем переносили в термостатическую баню STUART SBS40 (США) при температуре 37 ± 2 ° C при постоянном перемешивании 200 об / мин x 4 ч, контролируя pH каждые 2 часа. Наконец, обработанную пыльцу стерилизовали при 121 ° C в течение 15 мин.

Protamex ^TM Энзим

Этот фермент характеризуется тем, что представляет собой протеазный комплекс Bacillus, который используется в различных исследованиях для гидролиза пищевых белков.Его оптимальные рабочие условия — pH от 5,5 до 7,5 при температуре от 35 до 60 ° C, и он имеет активность 1,5 единиц Ансона (AU-NH) / г фермента (Liaset et al, 2003).

2.2.4 Предварительная щелочная обработка

Использовали NaOH 3% (мас. / Об.) В соотношении 1: 1 г пыльцы / мл раствора, затем переносили на водяную баню при 70 ° C в течение 10 мин. После этого к гидролизованной пыльце добавляли воду в соотношении 1: 1 и, наконец, стерилизовали.

2.2.5 Определение белка (метод Брэдфорда)

Образец весом 1 г взвешивали и добавляли к 25 мл фосфатного буфера с pH: 7,6 при перемешивании на вортексе в течение 5 мин.Затем подвергали ультразвуку 15 мин и центрифугировали при 9000 об / мин при 4 ° C в течение 20 мин. После этого 2,5 мл разводили в 50 мл дистиллированной воды. 1 мл экстракта добавляли к 1 мл реагента Брэдфорда и после перемешивания считывали до 595 нм, используя 1 мл реагента Брэдфорда и 1 мл дистиллированной воды в качестве холостого опыта. Результат выражали в процентах белка (Castro et al, 2014).

2.2.6 Определение усвояемости пепсином in vitro

Количественный метод, описанный в колумбийском техническом стандарте NTC 719, был рассмотрен для этого теста (ICONTEC, 1994) с учетом некоторых модификаций, сделанных в исследовании Castro et al.(2014). Образец 1,5 г высушенной и обезжиренной пыльцы переносили в колбу Эрленмейера, содержащую 150 мл раствора 0,002% пепсина в соляной кислоте с концентрацией 0,075 Н. Затем переносили в термостатическую баню STUART SBS40 ( USA), выдержать при мягком перемешивании и инкубировать в течение 16 ч при 45 ºC. Результаты выражали в% переваренного белка.

2.2.7 Приготовление экстракта антиоксидантов

Пробу 1 г добавляли к 15 мл 96% этанола в пробирке Falcon на 50 мл.Этот раствор подвергали беззвучной ELMA в течение 10 мин, после чего его отбирали на центрифугирование в течение 10 мин при 7000 об / мин при 10 ° C, затем супернатант экстракта переносили в мерную колбу на 50 мл. Процедура воздействия этанола была повторена еще два раза, и, наконец, объем был доведен до 50 мл 96% этанолом. Аликвоту 5 мл экстракта переносили в мерную колбу на 10 мл с 96% этанолом, и экстракт хранили в янтарной колбе в соответствии с методологией, описанной Берналом (2012) и некоторыми модификациями Института пищевых наук и исследований. Technology (ICTA) Национального университета Колумбии.

2.2.8 Определение антиоксидантной способности методом TEAC (изменение цвета катион-радикала ABTS)

К 1 мл раствора ABTS ^{• +} добавляли 10 мкл экстракта и ожидали реакции в темноте в течение 6 мин. Затем его измеряли на длине волны 734 нм на спектрофотометре УФ-видимого диапазона THERMO SCIENTIFIC GENESYS 10S (США), рассчитывая изменение оптической плотности по сравнению с раствором без реакции. Для проведения расчетов была получена калибровочная кривая с тролоксом в качестве антиоксиданта, и результаты были выражены в ммоль тролокса / г пыльцы (Bernal, 2012).

2.2.9 Определение антиоксидантной способности по методу FRAP (восстанавливающая антиоксидантная способность железа)

Для этого анализа использовалась методология, оцененная ICTA и Bernal (2012). Смесь 20 мкл экстракта, 450 мкл реагента FRAP и 735 мкл дистиллированной воды прореагировала в темноте в течение 30 минут, считая с момента добавления экстракта. Измерения проводились на спектрофотометре УФ-видимого диапазона THERMO SCIENTIFIC GENESYS 10S (США) на длине волны 593 нм.Наконец, результаты были получены путем построения калибровочной кривой с Trolox в качестве антиоксиданта, следовательно, они выражены в ммоль Trolox / г пыльцы.

2.2.10 Определение общих фенолов методом фолина — чокальте

Измерение проводилось путем считывания спектрофотометрически при длине волны 765 нм. Смешивали 500 мкл экстракта, 25 мл дистиллированной воды и 2 мл 10% раствора карбоната натрия, затем, через 10 мин, добавляли 500 мкл фолина, и объем доводили до 50 мл.Раствор хранили в темноте в течение 2 ч, после чего считывание производили на спектрофотометре УФ-видимого диапазона THERMO SCIENTIFIC GENESYS 10S (США), используя в качестве холостого опыта дистиллированную воду. Результаты были получены путем построения калибровочной кривой с галловой кислотой, и они были выражены в мг галловой кислоты / г пыльцы (Bernal, 2012).

2.2.11 Статистическая методология

Результаты были изучены с помощью анализа главных компонентов для применения одномерного или многомерного дисперсионного анализа (ANOVA или MANOVA) в соответствии с полученным главным компонентом с использованием программного обеспечения SPSS Statistics версии 22, Statgraphics Centurion версии 22, MATLAB.

2.2.12 Анализ структуры пыльцы

Морфологическое окрашивание пыльцы

Морфология необработанной пыльцы и пыльцы при различных предварительных обработках была устранена путем помещения образца на предметное стекло микроскопа для проверки его микроструктуры, в частности внешнего слоя полюса.

Методология, описанная Ortiz, Cogua (1989), была применена с некоторыми изменениями. Глицериновое желе, смешанное с фусцином, использовали на предметном стекле микроскопа, а затем проводили прямое наблюдение в оптическом микроскопе.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Сравнение белка пыльцы пчел без обработки и с различными предварительными обработками, определенное методом Брэдфорда

На рисунке 1 показано сравнение среднего содержания белка, определенного методом Брэдфорда в пыльце без обработки и предварительно обработанной. Важно подчеркнуть, что такой метод применяется в различных овощных матрицах, потому что это разумный и практичный метод.

Согласно различным отчетам о белке пчелиной пыльцы, было получено значение 21,11%, что совпадает с отчетом другого исследования о близости этого значения к чилийскому сорту Cryptocarya alba 22% (Montenegro et al, 2013). . Фактически, рисунок 1 показывает значительно меньшее количество белка в пыльце, обработанной с помощью различных предварительных обработок, по сравнению с необработанной пыльцой, что вызвано разрывом пептидных связей.Однако ферментативно гидролизованная пыльца показала самое низкое содержание белка среди предварительно обработанных препаратов. По мнению некоторых авторов, этот результат связан с возможным комбинированным действием ферментов, вызывающих разрыв определенных пептидных связей, которые не определяются количественно, и высвобождение определенных аминокислот (Castro et al, 2014; Sánchez, 2010), хотя другие исследования сообщают что реагент может специфически взаимодействовать только с остатками аргинина и лизина (Grintzalis et al, 2015).

3.2 Определение усвояемости необработанной и предварительно обработанной пыльцы

Немногочисленные отчеты представляют ослабление первичной стенки пыльцы с технологическими целями (Zuluaga et al, 2014), поскольку они сосредоточены на морфологии и определении вида, без учета поиска пыльцы с большим количеством доступных питательных веществ, которые должны быть включены в человеческая диета.На рисунке 2 сравнивается усвояемость необработанной пыльцы или в ее исходном состоянии с пыльцой, полученной после применения различных предварительных обработок в этом исследовании. Некоторые авторы изучали предварительную сухую термическую обработку этой растительной матрицей, однако они сосредоточились на получении микробиологической стабильной пыльцы, а не на ее изучении как биопроцессе (Fuenmayor, 2009; Salazar, 2014), что подчеркивает отсутствие исследований в отношении высокой усвояемости Цветочная пыльца.

Общее и значительное увеличение перевариваемости белка in vitro было обнаружено в предварительно обработанной пыльце по сравнению с необработанной пыльцой, что можно объяснить денатурализацией белка из-за высоких температур и химических реакций, которые происходят при определенных предварительных обработках, что может принести пользу деформация экзины. Ферментативная предварительная обработка дает повышение перевариваемости на 84%, что может быть связано с уменьшением количества белка (см. Рисунок 1), что совпадает с результатами, полученными Castro et al.(2014), которые сообщили о высвобождении аминокислот после ферментативной обработки пыльцы в свежем состоянии.

Некоторые исследования подчеркивают различный гидролиз белка, поскольку они могут улучшить пищеварение поджелудочной железы и увеличить доступность питательных веществ в результате разрушения молекулярной структуры, учитывая, что расщепление белка в пище легче, когда она денатурализована, что увеличивает всасывание питательных веществ в кишечнике человека ( Гонсальво, 2001; Мартинес, 2006). Кроме того, некоторые авторы отмечают, что пчелы не потребляют пыльцу в свежем виде, превращая ее в пчелиный хлеб с усвояемостью 66% (Castro et al, 2014).Перевариваемость предварительно обработанной пыльцы близка к значению, указанному для животных белков, 95% для молочных белков и 85% для яиц, что подчеркивает, что ферментированное молоко может иметь более высокую усвояемость и усвоение белка по сравнению с молоком в естественном состоянии (Del Castillo & Лагаррига, 2004).

Что касается антиоксидантной способности FRAP и ABTS (таблица 1), они показали снижение в большинстве предварительных обработок, за исключением предварительной обработки щелочью в ABTS, которая не показала значительных различий по сравнению с необработанной высушенной пыльцой.Снижение антиоксидантной способности пыльцы может быть следствием эффектов, производимых различными применяемыми методами лечения (Araya et al, 2006; Salazar, 2014), что совпадает с данными других авторов, которые указывают на то, что технологические процессы могут снизить антиоксидантную активность определенных растительных матриц (Perea- Вилламил и др., 2009). С другой стороны, в некоторых исследованиях сообщалось о повышении антиоксидантной способности некоторых пищевых продуктов как о благоприятном эффекте предварительной термической обработки или процесса сушки, что, вероятно, связано с реакцией Майяра (Fuenmayor, 2009; Salazar (2014).

Таблица 1

Сравнение антиоксидантной способности и фенолов для предварительно обработанной и необработанной пыльцы.

Значения фенолов показали небольшое снижение для каждой предварительной обработки по сравнению с пыльцой в ее естественном состоянии, за исключением предварительной обработки щелочью, которая показала повышение, эти результаты аналогичны тем, о которых сообщает Castro et al.(2014). Этот факт можно объяснить сложной структурой пыльцы, поскольку внешний слой, называемый экзин, который представляет собой полимер, состоящий из жирных кислот и лигнинов фенольных соединений, высвобождает определенные фенолы, когда его подвергают некоторым предварительным обработкам, вызывающим разложение в клетке. стенка этой матрицы и трещина в полимерном лигнине (Zuluaga, 2014).

Несмотря на обнаруженное снижение антиоксидантных свойств предварительно обработанной пыльцы, значения все еще значительны по сравнению с другими матрицами, такими как ежевика и барбарис (Bernal, 2012).Наконец, было продемонстрировано, что каждая предварительная обработка улучшает усвояемость пыльцы по сравнению с пыльцой в естественном состоянии, учитывая, что предварительно обработанная пыльца может быть потреблена.

3.3 Статистическая оценка переменных, оцениваемых в ходе предварительной обработки комбинированным способом

Окончательный анализ данных был проведен с помощью анализа главных компонентов (PCA), чтобы четко оценить влияние каждой оцениваемой переменной, такой как белок по методу Брэдфорда, усвояемость, антиоксидантная способность и общее количество фенолов.На рис. 3 показан график оценок и график загрузки главного извлеченного компонента, который объясняет 96% дисперсии данных. Заметны значительные различия между высушенной пыльцой (UP) и предварительно обработанной пыльцой с точки зрения более высокой усвояемости и более низкого содержания белка. Что касается антиоксидантов, общая тенденция заключается в сокращении количества различных предварительных обработок, за исключением фенолов.

Для извлеченного главного компонента применяли дисперсионный анализ ANOVA (таблица 2) для оценки эффекта предварительных обработок и проверки Тьюки того, что все предварительные обработки показали разные средние векторы, что указывает на значительную разницу по каждой упомянутой переменной по отношению к предварительным обработкам.Исключение составляли предварительная щелочная и сухая термическая обработка.

Таблица 2

Краткое изложение одномерного дисперсионного анализа (ANOVA) по извлеченному главному компоненту.

3.4 Окрашивание морфологии пыльцы

Учитывая, что оценка частоты предварительной обработки структуры пыльцы была желаемым результатом этого исследования, на рисунке 4 представлены измерения оптической микроскопии, сделанные для высушенной необработанной пыльцы и обработанной пыльцы в термической, ферментативной и щелочной форме, чтобы наблюдать структурную модификацию. пыльцы после воздействия различных процессов.

Что касается рисунка 4, то (а) показывает овальную однородную морфологию без трещин, в то время как (б) отличается круглой формой и тремя ребрами брода в первичной стенке, хотя в этих морфологиях очевидна четко выраженная структура, в которой выделена экзина. . В (c) представлена ​​термически обработанная пыльца с деформацией клеточной стенки различной морфологии. Морфология (d) показывает деформацию структуры, вызванную предварительной влажной термической обработкой, кроме того, (e) имеет деградацию внешней структуры пыльцы под действием предварительной ферментативной обработки.Наконец, (f), который относится к пыльце, обработанной щелочью, показывает трещину и деформацию экзины.

С другой стороны, этот тип техники упоминается в большинстве исследований как сосредоточенный на ботаническом происхождении пыльцы, однако было продемонстрировано, что он может быть применен для другого вида анализа.

4. Выводы

Различные термические, химические и ферментативные обработки пчелиной пыльцы привели к значительным изменениям в белке по методу Брэдфорда. Предварительная ферментативная обработка, в частности, сильно повлияла на пчелиную пыльцу, что привело к очевидному снижению количества белка и большего количества доступных питательных веществ.

Когда 62% усвояемости пыльцы в естественном состоянии сравнивают с 85% усвояемостью пыльцы при ферментативной предварительной обработке, 89% для предварительной сухой термической обработки, 92% для предварительной влажной термической обработки и 98% для предварительной обработки щелочью, обнаруживается значительное увеличение. это подразумевает получение матрицы с лучшими характеристиками, чем исходная пыльца, с точки зрения наличия питательных веществ, которые могут способствовать ее потреблению.

Антиоксидантные свойства у предварительно обработанной пыльцы снизились по сравнению с пыльцой без обработки, однако эти изменения не были выражены по сравнению с другими растительными матрицами.Согласно результатам этого исследования, предварительная обработка является хорошей альтернативой для повышения усвояемости и улучшения доступности других питательных веществ в пчелиной пыльце.

Ферментативная, термическая и химическая предварительная обработка оказывает значительное влияние на микроструктуру пыльцы в соответствии с деформацией экзины, наблюдаемой с помощью оптической микроскопии

5. Благодарности

Авторы выражают признательность Институту пищевых наук и технологий — ICTA при Национальном университете Колумбии, кампус Богота, Административному отделу науки, технологий и инноваций (COLCIENCIAS), компании Apiario los Cerezos и альтернативной стратегической программе. для создания стоимости продуктов пчеловодства в Колумбии за счет инноваций и технологического развития, для поддержки этих исследований.

Список литературы

Арайя, Л.Х., Клавихо, Р.С., и Эррера, К. (2006). Capacidad antioxidante de frutas y verduras cultivados en Chile. Archivos Latinoamericanos de Nutricion 56 (4), 361-365.

Бернал, Л. (2012). Evaluación de las propiedades bioactivas de mora (Rubus glaucus) y agraz (Vaccinium meridionale Swartz), en fresco y durante processos de transformación. Tesis Magíster en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Национальный университет Колумбии, Богота, Колумбия.

Кампос, М.Г.Р., Богданов, Стефан, де Алмейда-Мурадян, Л.Б., Щесна, Т., Манчебо, Ю., Фриджерио, К., и Феррейра, Ф. (2008). Состав пыльцы и стандартизация аналитических методов. Журнал исследований пчеловодства 47 (2), 154-161.

Дель Кастильо-Шелли Р. Р. и Лагаррига Дж. М. (2004). Productos lácteos. Tecnología. Барселона: Политехнический университет Каталонии.

Кастро, Л., Сулуага, К., и Киказан, М. (2014). Contenido protéico y digestibilidad aparente de polen apícola y pan de abejas del Altiplano Cundiboyacense.En Congreso Ciencia, Investigación Y Tecnología IICTA 2014, Медельин, Колумбия, стр. 97-102.

Фуэнмайор, К. (2009). Aplicación de bioprocesos en polen de abejas para el desarrollo de un suplemento nutricional proteico. Тесис, Magíster Ingeniería Química, Национальный университет Колумбии, Богота, Колумбия.

Gavarayeba, N. (1996). Развитие спородермы у Liriodendron chinense (Magnoliaceae): вероятная роль эндоплазматического ретикулума. Северный журнал ботаники 16 (3), 307-323.

Гонсалво, С. (2001). Методы определения пищевых продуктов in vitro для животных, моногастрикос. Revista Computarizada de Producción Porcina 8 (2), 70-79.

ICONTEC (Colombiano de Normas Técnicas y Certificación). (1994). Alimentos para animales. Determinación de la digestibilidad con pepsina de la proteína de origen animal., NTC 719, Богота, Колумбия.

Жан-Прост, П. (2007). Apicultura: Conocimiento de la abeja.Manejo de la colmena.(Cuarta Edición). Мадрид: S.A. Mundi-Prensa Libros.

Лиасет Б., Джулсхамн К. и Эспе М. (2003). Химический состав и теоретическая оценка питательности полученных фракций ферментативного гидролиза рамок лосося с использованием Protamex ^TM . Биохимия процесса 38 (12), 1747-1759.

Мартинес, Т. (2006). Diagnóstico de la actividad apícola y de la crianza de abejas en Colombia. Documento preparado para el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Dirección de cadenas productivas, Богота, Колумбия.

Мэй, Т., и Родригес, С. (2012). Plantas de interés apícola den el paisaje: Observaciones de campo y la percepción de apicultores en república Dominicana. Revista Geográfica de América Central 1 (48), 133–162.

Черногория, Г., Писарро, Р., Мехиас, Э., и Родригес, С. (2013). Evaluación biológica de polen apícola de plantas nativas de Chile. Журнал экспериментальной ботаники 9457 (82), 7-14.

Переа-Вилламил, Дж. А., Кадена-Кала, Т., и Эррера-Ардила, Дж.(2009). Какао и продукты, содержащие антиоксиданты: Efecto del процесамьенто. Салуд УИС 41 (2), 128-134.

Сааведра, К., Келина, И., Рохас, И., Дельгадо, П., и Гильермо, Э. (2013). Características polínicas y composición química del polen apícola colectado en Cayaltí (Lambayeque — Перу). Red de Revistas Científicas de América Latina, El Caribe, España Y Portugal 40 (1), 71-78.

Салазар, К. (2014). Evaluación de Diferentes condiciones del procso de fermentación en fase sólida de polen apícola.Tesis Magíster en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Национальный университет Колумбии, Богота, Колумбия.

Санчес, М. (2010). Протеасовый продукт с Bacillus licheniformis ATCC 12759 y su acción hidrolitica sobre proteínas de arroz (Oryza sativa L.) y maíz (Zea mays L.). Tesis Magíster Scientiarum en Biotecnología Alimentaria, Национальный экспериментальный университет Симона Родригеса, Каракас, Боливарианская республика Венесуэлы.

Сулуага, К., Серрато, Дж., И Кикасан, М.(2014). Альтернативы валоризации колумбийской пчелиной пыльцы для использования в качестве пищевого ресурса — структурированный обзор. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica 21 (3), 237-247.

Простое выделение и анализ экзина спорополленина из пыльцы пчел

Образцы пыльцы пчел

Наши основные исследования были проведены на трех типах образцов пыльцы пчел, высушенных в ламинарном потоке воздуха при 40 ° C. Рапс имел чистоту 100%, подсолнечник — 93% (с 7% кукурузы), и мы также исследовали смешанный образец пыльцы.Составные анализы образцов перечислены в таблице дополнительных материалов S1.

Пыльца рапса была собрана пчеловодом в северо-западной Венгрии (регион Сигеткез), а пыльца подсолнечника — одним в центральной Венгрии (округ Фейер). Смешанный образец представляет собой конгломерат образцов пыльцы, собранных в различных регионах Венгрии и Трансильвании в разное время года.

Удаление растворимых соединений за пределами целлюлозной внутренней стенки (фаза очистки P1)

Экстракции Сокслета

Экстракции Сокслета 100 г зерен пчелиной пыльцы проводили в экстракторах двух типов.В более тонком, имеющем внутренний диаметр 5 см, высота столбика пыльцы составляла 10 см, наивысший уровень столбца растворителя над пыльцой составлял 5 см, а цикл экстракции занимал около 5 минут. В более толстом, с внутренним диаметром 6,5 см, высота столбика пыльцы составляла 6 см, наивысший уровень столбца растворителя над пыльцой был 10 см, цикл длился около 15 мин.

Общее время экстракции 7 ч. Объем растворителей составлял 1 л (хлороформ, изопропиловый спирт и метанол), а экстракторы были оборудованы 2-литровыми круглодонными колбами.Количество материала, экстрагированного индивидуальными органическими растворителями, определяли после ротационного испарения и последующей сушки при 60 ° C и давлении 5 мбар в течение 1 часа.

Обратите внимание, что во время экстракции хлороформом и изопропиловым спиртом пыльцевые зерна слипались, в то время как внутри материала в экстракторе Сокслета образовывались каналы. Поэтому для повышения эффективности экстракции пыльцу в экстракторе несколько раз перемешивали.

После экстракции метанолом образцы в тонком и толстом экстракторах были объединены, перемешаны в течение 3 часов в 1 л горячей воды, отфильтрованы на стеклянном фильтре (в результате получился чистый поток, что означает отсутствие потерь пыльцевых зерен). и сушили при 60 ° C и давлении 5 мбар до достижения постоянства веса.

Наконец, был проведен последний раунд экстракции Сокслета ацетоном. На этой стадии очистки не было удалено никаких дополнительных материалов. Консистенция полученного очищенного вещества представляла собой хрупкое твердое вещество, а не мелкий порошок.

Промывки водой и изопропиловым спиртом

Водные промывки проводились как горячей (90–100 ° C), так и водой комнатной температуры, соответственно. 100 г зерен пчелиной пыльцы смешивали с 1 л воды и перемешивали в течение 3 ч механической мешалкой при 700 об / мин.

После перемешивания в горячей воде фильтровали на предварительно нагретом стеклянном фильтре. Нагревание фильтра (путем промывки его горячей водой) было необходимо, чтобы избежать блокировки фильтра парафинистыми соединениями. Пыльцу на фильтре промывали 300 мл горячей дистиллированной воды и сушили в вакуумном эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянного веса.

После перемешивания в воде комнатной температуры следовала декантация. Воскообразный материал с поверхности воды был удален, а остальное было отфильтровано.Снова вещество на фильтре промывали 300 мл дистиллированной воды и сушили в вакуумном эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянного веса. Обратите внимание, что фильтрация в этом случае заняла несколько часов.

Наконец, 30 г сухого материала, предварительно промытого горячей водой, гомогенизировали в 300 мл кипящего (80 ° C) изопропилового спирта; 30 г сухой пыльцы, предварительно промытой холодной водой, гомогенизировали в 300 мл изопропилового спирта комнатной температуры и растворы перемешивали в течение 3 часов.Затем их фильтровали на стеклянном фильтре, промывали 100 мл изопропилового спирта, имеющего ту же температуру, и сушили в вакуумном эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянства веса. Полученный материал представлял собой мелкодисперсный порошок.

Промывание изопропиловым спиртом и водным раствором лаурилсульфата натрия

20 г зерен пчелиной пыльцы смешивали с 200 мл изопропилового спирта, перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре, фильтровали на стеклянном фильтре, снова промывали 50 мл изопропилового спирта. спирт и сушеные.Затем обезжиренные таким образом образцы перемешивали в 100 мл 10 м / м% раствора лаурилсульфата натрия в течение 3 ч, промывали пять раз 100 мл дистиллированной воды, фильтровали и сушили в вакуумном эксикаторе над P _2. O ₅ до достижения постоянства веса.

В альтернативном протоколе 150 г зерен пчелиной пыльцы смешивали с 750 мл 10 м / м% раствора лаурилсульфата натрия и оставляли на сутки при комнатной температуре. Затем его центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g, заливали 500 мл дистиллированной воды и перемешивали.Процедуру повторяли 6 раз. Наконец, материал промывали на стеклянном фильтре 2 л дистиллированной воды и 1 л изопропилового спирта и затем сушили в вакуумном эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянного веса. Однако этот последний протокол привел к потере некоторого материала при удалении супернатанта после этапов центрифугирования и оказался неадекватным для измерения баланса масс.

Оба протокола дали тонкий порошок.

Растворение целлюлозной стенки интины (фаза очистки P2)

Горячая 85% фосфорная кислота

10 г пыльцы P1, очищенной экстракциями Сокслета, погружали в 75 мл 85% фосфорной кислоты при 90–95 ° C на 5 дней. ч и энергично встряхивали каждый час. Затем материал фильтровали под вакуумом, промывали 50 мл фосфорной кислоты и 300 мл дистиллированной воды. Время, необходимое для фильтрации, варьировалось от пары часов до одного дня. Обработка сильной кислотой дала темно-коричневый материал.После ополаскивания дистиллированной водой оттенок цвета стал светлее. Полученные образцы сушили в эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянства веса.

Комнатная температура 85% фосфорная кислота

10 г пыльцы P1, очищенной экстракциями Сокслета, перемешивали в 75 мл 85% фосфорной кислоты при комнатной температуре в течение 5 дней и встряхивали несколько раз каждый день. Процедура была такой же, как и с горячей кислотой. Обратите внимание, что вакуумная фильтрация требует значительно меньше времени, чем в случае горячей кислоты.

Горячий 10% водный раствор гидроксида калия

10 г пыльцы P1, очищенной экстракциями Сокслета, перемешивали в 50 мл 10% раствора гидроксида калия (КОН) при 90–95 ° C в течение 5 ч и энергично встряхивали каждый час. . Затем материал фильтровали в вакууме и промывали 50 мл раствора гидроксида калия и 300 мл дистиллированной воды. Время, необходимое для фильтрации, варьировалось от пары часов до 2 дней. В результате получился темно-коричневый материал.После ополаскивания дистиллированной водой оттенок цвета стал светлее. Промытые образцы сушили в эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянства веса.

10% водный раствор гидроксида калия при комнатной температуре

5 г пыльцы P1, очищенной экстракциями Сокслета, перемешивали в 200 мл 10% раствора гидроксида калия при комнатной температуре в течение 5 дней и встряхивали несколько раз каждый день. Процедура была такой же, как и для горячей щелочи.Отметим, что в этом случае вакуумная фильтрация потребовала значительно больше времени.

2-этоксиэтанол (целлозольв)

5 г пыльцы P1, очищенной экстракциями Сокслета, перемешивали в 50 мл целлозольва в течение 5 часов, встряхивая каждый час. Затем материал фильтровали в вакууме и промывали 25 мл целлозольва и 50 мл ацетона. Промытые образцы сушили в эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянства веса.

Обратите внимание, что потеря массы во время процедуры с использованием Целлозольва была либо минимальной, либо, в случае пыльцы подсолнечника, произошло даже небольшое увеличение массы.Мы предполагаем, что растворитель может связываться с пыльцевыми зернами. Однако консистенция вещества была однозначно изменена. Жесткий, хрупкий материал, полученный в результате экстракции Сокслета, превратился в тонкий порошок.

Ионная жидкость: 40% водный раствор гидроксида тетрабутилфосфония (TBPH)

0,5 г пыльцы P1, очищенной экстракцией Сокслета, перемешивали магнитной мешалкой в ​​5 мл TBPH в течение 2 дней при комнатной температуре. Затем материал фильтровали в вакууме и промывали 50 мл дистиллированной воды.Промытые образцы сушили в эксикаторе над P ₂ O ₅ до достижения постоянства веса.

Чтобы уменьшить повреждение пыльцевых зерен, перемешивание можно заменить встряхиванием, а фильтрацию в вакууме центрифугированием при 3000 г в течение 10 мин. В этом случае удаление TBPH осуществлялось двумя стадиями центрифугирования и ресуспендирования с использованием дистиллированной воды. Высушивание ускоряли последующим ресуспендированием в изопропиловом спирте и гексане с последующим центрифугированием.

Ферментные коктейли

Чтобы найти наиболее эффективную смесь ферментов для растворения богатой целлюлозой стенки интины, мы протестировали серию ферментных коктейлей, разрушающих лигноцеллюлозу (Cellic CTec2, NS22086 — комплекс целлюлазы; NS22119 — ферментный комплекс; NS22002— Гемицеллюлаза и NS22118 — β-глюкозидаза). Все это было предоставлено Novozymes A / S (Багсверд, Дания). Смесь Cellic CTec2 (основная активность: целлюлаза) и NS22118 (основная активность: β-глюкозидаза) оказалась наиболее эффективной для растворения интины, и результаты, представленные в статье, были реализованы с помощью комбинации этих двух коктейлей.Активность на фильтровальной бумаге Cellic CTec2 составляла 142 FPU / мл, тогда как активность β-глюкозидазы NS22118 составляла 318 МЕ / мл. Обратите внимание, что одна единица активности фильтровальной бумаги (FPU) определяется как количество высвобожденной глюкозы (мкмоль) в минуту при 50 ° C и pH 5 с использованием фильтровальной бумаги Whatman № 1 (Sigma) в качестве субстрата и одной единицы β- активность глюкозидазы (МЕ) — это количество высвобожденной глюкозы (мкмоль) в минуту при 50 ° C и pH 5 с использованием 4-нитрофенил-β-d-глюкопиранозида (Sigma) в качестве субстрата.

Предварительная обработка сокслета разбавленной кислотой и пыльцевых зерен, очищенных водой-изопропанолом

0.15 г образцов пыльцы P1, очищенных по нескольким протоколам, диспергировали в 5 мл 2% -ного раствора серной кислоты и обрабатывали в течение 1 ч при 120 ° C в автоклаве под давлением. После этой процедуры пыльцевые зерна отделяли от супернатанта центрифугированием (6000 г, , 10 мин) и дважды промывали ацетатным буфером (100 мМ, pH 5). Предварительную обработку разбавленной кислотой проводили в трех экземплярах.

Ферментативный гидролиз

Предварительно обработанные и промытые образцы пыльцы ресуспендировали в 5 мл раствора фермента, содержащего 0.85 FPU Cellic CTec2 и 0,29 МЕ NS22118 в ацетатном буфере (100 мМ, pH 5). Ферментативный гидролиз проводили при 50 ° C при непрерывном встряхивании в течение 24 ч. Чтобы избежать микробного загрязнения, 20 мг тимеросала (Sigma) добавляли к 1 л раствора фермента. После ферментативного гидролиза интины оболочки экзины спорополленина отделяли от супернатанта центрифугированием (6000 г, , 10 мин) и дважды промывали дистиллированной водой. Обезвоживание происходило в сушильной камере (50 ° C) в течение 3 дней.Ферментативный гидролиз проводили в трех повторностях.

Химическое покрытие

Поверхность спорополленина, очищенного P1 и P2, была покрыта функционализированными флуоресцентными красителями. Изотиоцианат родамина B и изотиоцианат флуоресцеина (Sigma-Aldrich, Германия) присоединяли к аминогруппам на поверхности экзиновых оболочек спорополленина, как описано ниже. Наш протокол можно рассматривать как модель для покрытия экзины дополнительными соединениями с изотиоцианатом или другими реакционноспособными функциональными группами.

Покрытие RBITC и FITC реализовывалось следующим образом. 5 мг изотиоцианата родамина B добавляли к суспензии 10 мг очищенного экзина спорополленина в 200 мкл ДМФ ( N , N -диметилформамид). Полученную суспензию встряхивали 2 дня. Пыльцевые зерна отделяли центрифугированием и многократно промывали ДМФ до тех пор, пока цвет красителя (RBITC of FITC) не стал видимым в промывочном растворе. Затем функционализированный образец дважды промывали водой, изопропиловым спиртом, тетрагидрофураном и сушили в вакууме.Аналогичная процедура была применена для покрытия FITC.

Инструментальный анализ

Флуоресцентная микроскопия

Целостность и форма пыльцевых зерен проверяли с помощью светлопольной микроскопии.

Флуоресцентная микроскопия использовалась, с одной стороны, для проверки наличия или отсутствия целлюлозной интины, а с другой стороны, для изучения покрытия раковин экзин флуоресцентными красителями. Изображения получали при комнатной температуре с использованием эпифлуоресцентного микроскопа AxioImager Z1 (Zeiss), оснащенного конфокальным блоком сетки Apotome и ртутной лампой HBO 100, с использованием камеры AxioCam MRm и EC Plan-Neofluar 40 × NA = 0.75 или EC Plan-Neofluar 10 × NA = 0,3 воздушные цели (все Zeiss). Изображения флуоресценции Calcofluor white, GFP, DsRed и Dylight 488 были получены в AxioVision SE64 Rel. 4.9.1 (Zeiss) и обработан в Photoshop CS3 Extended (Adobe).

Для исследования состояния интины калькофлюоровый белый ^73,74,75,76 было применено неспецифическое флуоресцентное окрашивание, которое связывается со структурами, содержащими целлюлозу, каллозу и хитин. Пыльцевые зерна погружали либо в 50% -ный водный раствор глицерина, либо в 1% -ный агарозный гель, оба из которых содержали разбавление 1: 1 об. / Об. Раствора калькофлуора белого (Sigma, 18909, Calcofluor white M2R 1 г / L, Эванс синий 0.5 г / л). Для флуоресцентной визуализации использовался фильтрующий куб DAPI. Обратите внимание, что экзины спорополленина также обнаруживают аутофлуоресценцию (см. Дополнительный материал на рисунке S1). Поэтому в первую очередь наше внимание было сосредоточено на наличии или отсутствии участков интны, которые выступают через апертуры экзин.

Для исследования покрытия RBITC и FITC покрытые пыльцевые зерна погружали в воду или 50% -ный водный раствор глицерина. Для флуоресцентной визуализации использовались кубики фильтров mCherry и FITC соответственно.

Твердотельный ЯМР

Твердотельный ЯМР ¹³ C был записан при 125,77 МГц с использованием кросс-поляризации (CP) и вращения под магическим углом (MAS). Использовали спектрометр Bruker Avance III 500 МГц и зонд Bruker 4 мм BB-1H MAS. Спектры получали со следующими параметрами: задержка релаксации 5 с, окно спектра 80 кГц, частота вращения образца 10 кГц. 2048 точек данных были получены в течение 12,9 мс с последовательностью развязки SPINAL-64 1H. Формованный импульс Ramp 90–100% ¹ H использовался для получения более эффективного диполярного взаимодействия во время CP.Спектры относятся к внешнему образцу тетраметилсилана.

Рамановская спектроскопия

Варианты спорополленина демонстрируют сильную автофлуоресценцию при освещении ультрафиолетовым или видимым светом. Это затрудняет регистрацию высококачественных рамановских спектров с использованием возбуждения UV – VIS ^77,78,79 . Однако при возбуждении ближним инфракрасным светом их автофлуоресценция минимальна. Поэтому мы решили провести спектроскопию комбинационного рассеяния света с преобразованием частоты с использованием лазера возбуждения в ближней инфракрасной области (1064 нм).Хотя лазеры ближнего инфракрасного диапазона часто используются для записи спектров комбинационного рассеяния биологических образцов, демонстрирующих сильную флуоресценцию в видимом диапазоне, они имеют определенные недостатки. Более низкая энергия лазера ближнего инфракрасного диапазона сильно снижает эффективность комбинационного рассеяния света, что может привести к уменьшению отношения сигнал / шум и потенциально может потребовать гораздо большего времени измерения. Лазеры ближнего инфракрасного диапазона также могут привести к перегреву образца.

Фурье-спектры комбинационного рассеяния регистрировали с помощью инфракрасного спектрометра с преобразованием Фурье (FTIR) Bruker IFS55, оснащенного блоком расширения Рамана FRA 106 (Bruker Optik GmbH, Эттлинген, Германия), с использованием источника лазера Nd: YAG мощностью 500 мВт 1064 нм. работал при мощности лазера 100 мВт и Ge-детекторе, охлаждаемом жидким азотом.Спектры комбинационного рассеяния света (Фурье) образцов экзина спорополленина, помещенных в стандартный держатель твердых образцов прибора с использованием устройства для обратного рассеяния 180 °, регистрировали при инструментальном разрешении 4 см ⁻¹ в диапазоне 4000–100 см ⁻¹ . Диапазон волновых чисел (рамановский сдвиг) и не менее 2048 сканирований. Необработанные спектры были скорректированы по базовой линии для флуоресцентного фона, и было применено 19-точечное сглаживание для уменьшения шума.

Анализ флуоресценции

Спектры флуоресценции регистрировались флуориметром Spex FluorMax.20 мг экзины рапса или подсолнечника, очищенной экстракциями Сокслета и TBPH, диспергировали в 5 мл дистиллированной воды в кварцевой кювете 10 × 10 мм, снабженной магнитной мешалкой. Для возбуждения образца использовали монохроматический свет 300 нм, 400 нм, 500 нм и 600 нм. Спектры излучения регистрировались с использованием окна длин волн 10 нм и времени интегрирования 2 с (рисунок S1a). Мы также записали спектры флуоресценции с помощью рамановского микроскопа (дополнительный материал, рисунок S1b).

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующая электронная микроскопия (Hitachi 2360 N, 25 кэВ, детектор Robinson BSE) использовалась для проверки целостности пыльцевых зерен в режиме низкого вакуума без какого-либо покрытия после различных обработок.

Сезонные колебания пыльцы, собираемой медоносными пчелами (Apis mellifera) в развитых районах четырех регионов США

Abstract

У медоносных пчел ( Apis mellifera ) поддержание и рост колонии сильно зависят от рабочих-фуражиров, получающих достаточные ресурсы от цветущих растений круглый год. Несмотря на важность цветочного разнообразия для правильного питания пчел, городское развитие резко изменило доступность ресурсов и разнообразие этих важных опылителей.Следовательно, понимание цветочных ресурсов, добываемых пчелами в урбанизированных районах, является ключом к выявлению и продвижению растений, которые улучшают здоровье колоний в этих средах. В этом исследовании мы определили пыльцу, которую пчелы собирают в четырех развитых районах США, и выяснили, существуют ли пространственные или временные различия в типах цветочных источников пыльцы, используемых медоносными пчелами в этих ландшафтах. Для этого пыльцу собирали каждый месяц на срок до одного года из колоний, расположенных на развитых (городских и пригородных) участках в Калифорнии, Техасе, Флориде и Мичигане, за исключением месяцев отсутствия пыльцы или зимы.Гомогенизированные образцы пыльцы были подвергнуты ацетолизу и идентифицированы под микроскопом до минимально возможного таксономического уровня. После идентификации каждый тип пыльцы был классифицирован в частотную категорию на основе его общей относительной численности. Также рассчитывались индексы видового богатства и разнообразия и сравнивались по штатам и сезонам. Мы идентифицировали до 64 типов пыльцы, принадлежащих 39 семействам растений за один сезон (Калифорния). Богатство видов было самым высоким в ЦА, самым низким в Техасе и самым высоким весной во всех штатах.В частности, «преобладающие» и «вторичные» типы пыльцы принадлежали семействам Arecaceae, Sapindaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Fabaceae, Fagaceae, Lythraceae, Myrtaceae, Rhamnaceae, Rosaceae, Rutaceae, Saliaceae и Ulmaceae. Это исследование поможет расширить наши представления об экологии и питании медоносных пчел в городских условиях, а также будет способствовать использованию растений, которые служат двойной цели — обеспечивать эстетическую ценность и питательный корм для семей медоносных пчел, размещенных в развитых ландшафтах.

Образец цитирования: Lau P, Bryant V, Ellis JD, Huang ZY, Sullivan J, Schmehl DR, et al. (2019) Сезонные колебания пыльцы, собираемой медоносными пчелами ( Apis mellifera ) в развитых районах четырех регионов США. PLoS ONE 14 (6): e0217294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294

Редактор: Вольфганг Бленау, Лейпцигский университет, ГЕРМАНИЯ

Поступила: 17 января 2019 г .; Принята к печати: 8 мая 2019 г .; Опубликовано: 12 июня 2019 г.

Авторские права: © 2019 Lau et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование частично финансировалось грантом JR (номер награды M1402691), JDE (номер награды 00115707) и ZYH (номер награды NSNTN015) от Bayer Crop Science и Syngenta Crop Protection LLC (1005822 — UF). ), Техасский исследовательский проект AgriLife TEX09557 компании JR и многогосударственный проект Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США (2015-67013-23170).Мы также хотели бы поблагодарить стипендию Herb Dean ’40 Endowed Scholarship и Техасскую ассоциацию пчеловодов за их финансовую поддержку PL. Эти спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Джозеф Салливан работает в Ardea Consulting. Ardea Consulting оказывала поддержку в виде заработной платы автору JS, но не играла никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.Конкретная роль этого автора сформулирована в разделе «Авторский вклад». Даниэль Р. Шмель и Ана Р. Кабрера работают в Bayer CropScience LP. Bayer CropScience LP оказывала поддержку в виде заработной платы авторам DRS и ARC, но не играла никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации или подготовке рукописи. Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад».

Конкурирующие интересы: У нас есть следующие интересы: Это исследование частично финансировалось Bayer Crop Science и Syngenta Crop Protection LLC, а также Ассоциацией пчеловодов Техаса.Даниэль Р. Шмель и Ана Р. Кабрера работают в Bayer CropScience LP. Джозеф Салливан работает в Ardea Consulting. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать. Это не влияет на нашу приверженность всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Медоносные пчелы ( Apis mellifera L.) большую часть своей фазы сбора пищи посвящают, специализируясь на сборе нектара, пыльцы, прополиса или воды [1].Цветочный нектар обеспечивает углеводы, необходимые для энергетических нужд колонии, а пыльца, основной источник белка, обеспечивает пчел десятью незаменимыми аминокислотами, которые имеют решающее значение для выращивания расплода и кормления маток [2–5]. Пыльца сохраняется при хранении путем смешивания ее с нектаром и секретами желез рабочих для получения так называемого «пчелиного хлеба» [6]. Пчелы-кормилицы потребляют пергамент для развития их гипофарингеальных желез, которые производят богатое белком желе, которое используется для кормления развивающихся личинок [7, 8].Хотя колонии обычно требуется больше углеводов, чем белков, пыльца часто может стать ограничивающим фактором питания из-за низкой доступности или качества ресурсов в определенное время года [5, 9, 10]. Например, дефицит определенных аминокислот может стать узким местом при выращивании расплода [5], а без адекватного количества и типов пыльцы колонии могут быстро истощить свои запасы белка, что приведет к сокращению выращивания расплода и даже к каннибализму расплода. [11].

Среднее количество пыльцы, в которой нуждается колония с 10 000–15 000 рабочих, оценивается от 13,4 до 17,8 кг в год [12, 13]. В то время как наличие достаточного количества пыльцы важно для поддержания колонии, доступ к разнообразной пыльце не менее важен для питания колонии, поскольку пыльца различается для разных видов растений по типу и количеству содержащихся в ней аминокислот [14–16]. Неудивительно, что полифлорные диеты повышают иммунокомпетентность рабочих [17] и общую толерантность колоний к патогенам.Например, колонии, получавшие полифлорную диету, демонстрируют более длительную продолжительность жизни рабочих за счет снижения их восприимчивости к кишечному патогену микроспоридий Nosema spp. [18]. В то время как некоторые исследования предполагают, что медоносные пчелы склонны собирать пыльцу из-за близости к доступным цветочным ресурсам [19–21], другие предполагают, что собиратели способны демонстрировать предпочтения пыльцы в зависимости от потребностей их колонии в питании [22–24]. Тем не менее очевидно, что наличие доступа к постоянному потоку пыльцы из различных цветочных источников полезно для медоносных пчел.

Недавний всплеск осведомленности общественности о роли опыления медоносными пчелами в сельском хозяйстве привел к увеличению числа мелких пчеловодов в США, особенно в развитых городских и пригородных районах [25, 26]. В то время как крупномасштабные коммерческие операции пчеловодства (то есть те, которые управляют 500 или более семей) по-прежнему предоставляют большую часть услуг опыления для агроэкосистем, подсобные пчеловоды и пчеловоды (то есть те, которые управляют до 50 или 500 семей соответственно) представляют собой почти 99% пчеловодческого населения страны [27].Городская и пригородная среда представляют собой другую систему управления колониями по сравнению с сельскими или сельскохозяйственными ландшафтами, учитывая, что таксономическое разнообразие растений может быть затронуто различными способами в зависимости от степени освоения земель. Например, сильно развитые городские районы в основном покрыты тротуаром и зданиями, что приводит к потере зеленых насаждений и снижению доступности растений [28]. Напротив, умеренный уровень урбанизации может фактически увеличить разнообразие за счет орошаемых общественных парков и частных садов [29, 30].Независимо от степени развития, многие из небольших вегетативных участков в развитых районах часто содержат мало или совсем не содержат местных растений, потому что они были заменены неместными декоративными растениями, которые выбираются из-за их эстетической ценности, а не из-за их пользы для опылителей [ 31]. В городской среде преобладают несколько видов декоративных растений, которые либо доминируют в конкурентной борьбе, либо предпочитают в этих условиях [32, 33]. Хотя многие парки и частные сады в пригородной среде содержат местные и неместные виды растений [34], в целом развитие городов и фрагментация среды обитания резко изменили доступность ресурсов и разнообразие для опылителей [35].Кроме того, ожидается, что преобразование ландшафта будет продолжаться, поскольку, согласно прогнозам, урбанизация будет расширяться во всем мире [36], что, вероятно, окажет воздействие на опылителей из-за изменений в местной флоре [37, 38].

Для исследования цветочных источников, собранных пчелами-собирателями в любом ландшафте, пыльца, собранная пчелами, может быть проанализирована с помощью методов мелиссопалинологии, которые обычно используются для идентификации пыльцы в меде для определения цветочных источников нектара [39–44]. Однако собиратели пыльцы не посещают те же растения, что собирают нектар из одной и той же колонии, что приводит к различиям в типах растений, добываемых колонией, в зависимости от ее потребностей в нектаре и пыльце [40, 45].Несколько исследований, в которых анализировался состав гранул пыльцы, собранных у собирателей, проводились с использованием колоний, расположенных в преимущественно неосвоенных или сельскохозяйственных ландшафтах [45–47]. Следовательно, у нас есть ограниченное представление о предпочтениях при кормлении пыльцой колоний, расположенных в городских и пригородных условиях. В этом исследовании мы определили основные типы пыльцы, собираемые собирателями в городских и пригородных условиях в Калифорнии, Техасе, Флориде и Мичигане в весенние, летние, осенние и (если возможно) зимние месяцы.Мы использовали эту информацию для оценки видового богатства и индексов разнообразия для каждого участка и сравнили эти значения по штатам и сезонам, ожидая найти различия в разнообразии пыльцы из-за пространственных и временных различий между участками. Более того, поскольку исследования в Европе показали, что колонии, размещенные в сельскохозяйственных ландшафтах, собирают наибольшее разнообразие пыльцы в летние месяцы [48–50], мы предположили, что разнообразие цветков в нашем исследовании будет самым высоким в летний сезон. Это исследование дает представление об экологии кормодобывания и цветочных предпочтениях семей медоносных пчел в течение года в городских или пригородных условиях и служит основой для будущей работы, посвященной экологии кормления пчелами и цветочным предпочтениям в развитых ландшафтах.

Материалы и методы

Выбор площадки

пчеловодов, которые управляли колониями, расположенными в городских и пригородных районах, были идентифицированы местными и государственными пчеловодческими организациями в Калифорнии (Калифорния; Залив и Сакраменто), Техасе (Техас; Остин и Колледж-Стейшн), Флориде (Флорида; Орландо и Тампа) и Мичиган (Мичиган; Детройт и Ист-Лансинг). Каждый владелец дал разрешение на проведение исследования на своем участке. У нас было в общей сложности 20 сайтов в Калифорнии, 18 сайтов в Техасе, 19 сайтов в Флориде и 15 сайтов в Мичигане, всего 394 образца по всем сайтам (таблица 1).На каждом участке было по крайней мере две колонии, так что очаговая колония могла быть заменена в том случае, если позже она была сочтена непригодной для сбора пыльцы для использования в исследовании.

Таблица 1. Количество участков, отобранных по штатам и сезонам.

Общее количество колоний, отобранных в каждом штате, и количество проб, проанализированных в каждом сезоне. Времена года определялись по Северному метеорологическому календарю.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.t001

Координаты GPS для каждого сайта были собраны и нанесены на карту в ArcGIS (версия 9.3 или 10.4). На карте вокруг каждого участка нанесены концентрические круги радиусами 0,8 км, 1,6 км и 4,0 км. Предполагая, что медоносные пчелы добывают корм в районах, близких к улью [1], ожидалось, что радиус 0,8 км вокруг участка будет представлять основной ареал кормодобывания колонии, в то время как радиус 4,0 км должен охватывать область, близкую к максимальной, где большая часть кормления в большинстве случаев встречается в типичной колонии [1]. Чтобы учесть региональные различия в классификации данных о земном покрове, мы использовали Национальную базу данных о земном покрове 2011 года (NLCD) для классификации типов земного покрова, окружающего каждый участок (https: // www.mrlc.gov/nlcd2011.php). NLCD классифицирует развитые районы как с открытыми пространствами, так и с низкой, средней и высокой интенсивностью развития или урбанизации [51]. Процент земельного покрова для каждого из этих четырех классов был суммирован для расчета общего процента освоенных земель вокруг каждого участка.

К неосвоенным ландшафтам относятся ландшафты, покрытые водными системами, кустарниками или лугами, лесами и редколесьями, пахотными землями, а также прибрежными или водно-болотными системами. Большие водоемы были отнесены к категории недоступных районов кормления, чтобы прибрежные районы не отражали уровень развития данного района.Сельскохозяйственные угодья были разделены на те, которые были заняты пастбищами и сенокосом, и те, которые занимались возделываемыми культурами. Аэрофотоснимки территорий вокруг каждой колонии обеспечили визуальное изображение каждого участка и помогли определить особенности ландшафта, такие как жилые районы, поля для гольфа, открытая вода и неосвоенные районы. Аэрофотоснимки также использовались в дополнение к NLCD, чтобы запечатлеть недавнюю застройку земель путем наложения аэрофотоснимков на объекты, классифицированные по NLCD. Районы, которые можно было определить как жилые или застроенные с помощью аэрофотоснимков, были вручную переклассифицированы как разрабатываемые.Затем мы рассчитали процент освоенной площади от общей площади, окружающей концентрические круги вокруг каждого участка. Все объекты в каждом штате должны были быть отделены друг от друга не менее чем на четыре километра.

Сбор пыльцы

Мы отбирали образцы пыльцы из Калифорнии и Флориды ежемесячно с июля 2014 г. по июнь 2015 г. (12 месяцев), MI с июля по сентябрь 2014 г. и с марта по июнь 2015 г. (7 месяцев) и Техаса с марта по октябрь 2015 г. (8 месяцев). Мы использовали Северный метеорологический календарь для категоризации данных по сезонам на основе месяца, в котором они были собраны.Весенний отбор проб проводился с 1 марта по 31 мая, летний отбор проб — с 1 июня по 31 августа, осенний отбор проб — с 1 сентября по 30 ноября, а зимний отбор — с 1 декабря по 28 февраля.

Каждая колония имела ловушку для пыльцы (деталь ND № 464 Brushy Mountain Bee Farm для ульев с десятью рамками и деталь № 509 для ульев с восемью рамками), установленную на входе в улей. Участвующие пчеловоды были проинструктированы активировать ловушки для пыльцы не позднее, чем за неделю до даты отбора проб, чтобы собрать достаточное количество пыльцы из различных цветочных источников.Пыльца пассивно собиралась, когда собиратели проходили через активированную ловушку, в результате чего часть гранул пыльцы на их корбикулах падала в лоток для сбора [52]. Мы отобрали образцы пыльцы в течение одной недели или раньше после активации ловушек, чтобы получить свежие образцы, представляющие окружающую зону кормодобывания из улья в это конкретное время. Для палинологического анализа с каждого участка отбора проб в каждый момент времени собирали минимум 1 г пыльцы. Всего было отобрано 146 образцов в Калифорнии, 79 образцов в Техасе, 144 образца в Флориде и 87 образцов в Мичигане.Образцы хранили замороженными при -20 ° C и отправляли на сухом льду в Техасский университет A&M в Колледж-Стейшн, штат Техас, для анализа пыльцы.

Анализ пыльцы

Каждый образец пыльцы был обработан с использованием стандартных процедур ацетолиза [39, 53–56]. Ацетолиз используется для удаления протоплазмы пыльцевого зерна, чтобы его морфологические характеристики можно было увидеть под световым микроскопом для таксономической идентификации. Подмножества по крайней мере 0,25 г пыльцы из каждого образца гомогенизировали в пробирке с 10 мл 95% ледяной уксусной кислоты, которую добавляли под вытяжным шкафом для удаления воды из образца, тем самым предотвращая потенциально опасную экзотермическую реакцию между любыми образцами. остатки воды и ацетолизная смесь.Образцы встряхивали и центрифугировали при 1060 x g в течение 2 минут [56]. После декантации ледяной уксусной кислоты к образцу постепенно добавляли 10 мл ацетолизной смеси, содержащей уксусный ангидрид и серную кислоту в соотношении 9: 1. Смеси периодически перемешивали и оставляли реагировать на нагревательном блоке при 80 ° C в течение 10 минут. Затем образцы заливали ледяной уксусной кислотой и давали остыть перед повторным центрифугированием при 1060 x g в течение 2 минут [56].После того, как супернатант был слит, образцы прошли серию промывок ледяной уксусной кислотой и дистиллированной водой, а затем были окрашены сафранином O (Sigma-Aldrich, Миссури) и промыты 95% этанолом. Сафранин О обычно используется в палинологии, поскольку он окрашивает пыльцевые зерна таким образом, что увеличивает контраст изображения для микрофотографии [56–58]. Образцы переносили в пробирки Эппендорфа, содержащие глицерин, и оставляли открытыми на 24 часа для сушки этанола. На следующий день были сделаны слайды, равномерно распределив каплю остатков пыльцы по слайду и закрыв ее покровным стеклом с использованием прозрачного лака для ногтей [59].

Пыльцевые зерна были идентифицированы на уровне семейства, рода или вида с помощью светового микроскопа Nikon E200. Автономный контроллер камеры микроскопа Nikon DS-L3 использовался для измерения размера пыльцевых зерен и получения цифровых изображений уникальных типов пыльцы с увеличением от 200 до 600 раз. Идентификация пыльцы была основана на орнаменте, ориентации, размере и структуре поверхности зерна. Специфика идентификации пыльцы зависела от диагностических характеристик зерна и справочной коллекции, доступной в палинологической лаборатории факультета антропологии Техасского университета A&M.Также использовались различные региональные атласы пыльцы, однако некоторые типы пыльцы были идентифицированы только на уровне семейства. Например, пыльцу семейств Asteraceae, Liliaceae, Poaceae, Rhamnaceae, Rosaceae и Ericaceae нелегко идентифицировать до уровня рода без изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) из-за морфологического сходства растений в каждом из этих семейств [39]. . Большинство членов семейства Asteraceae были разделены по длине шипов и дифференцировались как высокие шипы (HS) Asteraceae (шипы> 2.5 мкм в длину), низкий шип (LS) Asteraceae (шипы длиной <2,5 мкм) или liguliflorae (LF) Asteraceae в трибе Lactuceae. Таксоны также были классифицированы как деревья, кустарники, травы, комбинации или неизвестные на основе базы данных растений Министерства сельского хозяйства США.

Мы идентифицировали не менее 200 пыльцевых зерен на образец. Недавно было определено, что этого количества достаточно для получения точного представления о таксономических группах растений, присутствующих в осадке пыльцы, собранной собирателями [60]. Каждый идентифицированный тип пыльцы был помещен в одну из четырех частотных категорий, как было предложено Louveaux et al.[61]. «Преобладающая» категория пыльцы включала таксономические группы, которые были представлены в> 45% пыльцевых зерен, подсчитанных на образец. В категории «вторичные», «важные второстепенные» и «второстепенные» входили таксономические группы, которые были представлены в 16–45%, 3–15% и <3% пыльцевых зерен, подсчитанных на образец, соответственно [62].

Таксономическое разнообразие

Таксономическое разнообразие цветов в каждой выборке было рассчитано с использованием индекса разнообразия Шеннона-Уивера для характеристики таксономического богатства и равномерности для каждого сезона в каждом штате.Индекс разнообразия Шеннона-Уивера ( H ’) был рассчитан с использованием уравнения: где p _i — доля пыльцы каждого типа ( i ) в образце, а ln — натуральный логарифм. Более высокое значение H ’ указывает на большее таксономическое разнообразие [62]. Индексы разнообразия Шеннона-Уивера были рассчитаны для каждого отдельного участка для каждого сезона в каждом штате. Мы использовали этот индекс для сравнения таксономического разнообразия в масштабах страны и штата.Мы также рассчитали эффективное количество видов (ENS) из индекса разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка, чтобы выполнить сравнение биоразнообразия между различными растительными сообществами, даже несмотря на то, что ENS имеет тенденцию полагаться на обильные таксоны и минимизировать ввод относительно редких таксонов. [63]. Неизвестные типы пыльцы учитывались путем присвоения каждой из них уникального «неизвестного» идентификационного кода.

Статистический анализ

Мы проверили нормальность индексов разнообразия Шеннона-Уивера и значений ENS с помощью теста Шапиро-Уилка.Поскольку индексы разнообразия для каждого сезона и штата не соответствовали предположениям о нормальности, мы использовали непараметрический тест Краскела-Уоллиса для выявления значительных различий между значениями разнообразия в каждом сезоне или в каждом штате. Мы провели множественные сравнения разнообразия по сезонам и штатам, используя тест Данна [64]. Поскольку на каждом участке было как минимум две колонии, доступные для отбора проб, мы собрали пыльцу либо из первой, либо из второй колонии на участке, несмотря на возможность того, что каждая колония собирала пищу из разных ресурсов [65].Поэтому каждый образец рассматривался как независимая точка для нашего анализа. Вся описательная статистика представлена ​​как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Мы установили уровень статистической значимости для всех тестов на α = 0,05 и использовали JMP Pro 14 (SAS Inc., Кэри, Северная Каролина) для всех статистических анализов.

Результаты

Проверка развитого земельного покрова

Мы использовали географическое положение каждого участка и информацию NLCD относительно состава земного покрова, окружающего участок, чтобы рассчитать процент земель, покрытых каждой категорией, описанной ранее (т.д., водные системы, кустарники или луга, леса и редколесья, пахотные земли и прибрежные или водно-болотные системы). Используя эту информацию, мы подсчитали, что на всех участках в среднем было застроено 81,26% земли в радиусе четырех километров вокруг каждого участка. Средний развитый растительный покров (без учета крупных водоемов) вокруг каждого участка составлял 74,69% в ЦА, 84,95% в Флориде, 84,71% в Мичигане и 80,72% в Техасе (рис. 1). Предполагая, что основной радиус кормодобывания в типичной колонии медоносных пчел составляет четыре километра [1], общая обследованная площадь потенциальной кормодобывающей деятельности для сбора пыльцы составила приблизительно 3 619 км ² в четырех штатах.

Рис. 1. Состав земного покрова.

Общий состав растительного покрова (выраженный в процентах) окружающей среды, окружающей колонии медоносных пчел, используемый в каждом штате, с четырехкилометровым радиусом кормодобывания вокруг каждого участка поселения. «Другой» тип земного покрова представляет собой возделываемые пахотные земли, недавно нарушенные или измененные, пастбища или сено, разреженные и бесплодные системы, а также интродуцированную и полуестественную растительность.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g001

Общее видовое разнообразие растений

Мы обнаружили значительную разницу в общем общем видовом разнообразии во всех четырех штатах (H = 34,69, P <0,001). Апостериорные тесты выявили более высокое общее видовое разнообразие в ЦА и более низкое общее видовое разнообразие в Техасе по сравнению с другими штатами (тест Данна для всех пар, P <0,05; рис. 2). В национальном масштабе общее разнообразие также было значительно выше весной во всех регионах (H = 33,47, P <0.001) по сравнению с другими сезонами (тест Данна для всех пар, P <0,05; рис. 3).

Существовали также сезонные различия в видовом разнообразии в пределах каждого штата (рис. 4). Например, медоносные пчелы в ЦА собирали осенью пыльцу значительно меньшего числа (H = 23,67, P <0,001) видов растений, чем в другие сезоны (тест Данна для всех пар, P <0,05). В Техасе видовое разнообразие было значительно выше (H = 12.94, P = 0.002) весной (H = 12.94, P = 0,002), чем летом (тест Данна для всех пар, P <0,05). Точно так же видовое разнообразие в FL было выше (H = 11,66, P = 0,009) весной, чем в любое другое время года (тест Данна для всех пар, P <0,05). Хотя мы обнаружили значительный эффект сезонного видового разнообразия в MI (H = 6,25, P = 0,04), мы не обнаружили попарных различий в видовом разнообразии между сезонами в этом штате (тест всех пар Данна, P > 0.05).

Рис. 4. Индексы разнообразия Шеннона-Уивера по сезонам в каждом штате.

Сводка значений индекса разнообразия Шеннона-Уивера (среднее ± S.E.M.) для всех участков в каждом штате с разбивкой по сезонам. Различные буквы над полосами указывают на значительные различия в показателях разнообразия Шеннона-Уивера между сезонами в пределах штата.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g004

Цветочное разнообразие Калифорнии

Весной собиратели из колоний в ЦА собирали пыльцу 65 таксонов растений, принадлежащих к 39 семействам (таблица S1, фигура S1).Средний индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка весной составлял 1,21, а ENS — 3,75 (рис. 5). Ни одна из собранных пыльцы не принадлежала к категории «преобладающих», как было предложено Louveaux et al. [60]. То есть ни один отдельный тип пыльцы не представлял> 45% пыльцевых зерен, подсчитанных в выборке (см. « Выбор участка » выше для объяснения каждой категории численности). Образцы пыльцы состояли из «вторичных» и «важных второстепенных» таксонов растений (рис. 6А). Колоний собрано 37.5% отобранной пыльцы с трав и 58,0% с деревьев и кустарников.

Рис. 5. Индексы разнообразия Шеннона-Уивера по штатам в каждом сезоне.

Сводка значений индекса разнообразия Шеннона-Уивера (среднее ± S.E.M.) для всех участков в каждом сезоне с разбивкой по штатам. Различные буквы над полосами указывают на значительные различия в показателях разнообразия Шеннона-Уивера между штатами в течение сезона.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g005

Рис.6.Обилие пыльцы в Калифорнии.

Сводная информация об относительном количестве пыльцы (идентифицированной по семейству растений), собранной колониями медоносных пчел, расположенными в городских и пригородных условиях в ЦА, весной (A), летом (B), осенью (C) и зимой (D) . См. [61] для объяснения каждой категории численности.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g006

Мы идентифицировали пыльцу 48 таксонов растений, принадлежащих к 34 семействам, собранных летом (таблица S1, фигура S1).Это включало «вторичный» таксон пыльцы и «важные второстепенные» таксономические группы (рис. 6B). Колонии собрали 41,3% пыльцы с трав, а 58,5% — с деревьев и кустарников. Летом индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составлял 1,03 при ENS 3,09 (рис. 5). Осенью пчелы собирали пыльцу 33 таксонов, принадлежащих к 24 семействам (таблица S1, рис. S1). Образцы включали «вторичные» и «важные второстепенные» таксоны (рис. 6C). Колонии собрали 27,1% пыльцы с трав и 72% пыльцы.4% из деревьев и кустарников. Средний индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка осенью составил 0,69, а ENS — 2,14 (рис. 5). Наконец, зимой было 33 таксона, принадлежащих к 23 семействам (таблица S1, фигура S1), к которым принадлежал «вторичный» таксон пыльцы и несколько «важных второстепенных» таксонов (рис. 6D). Колонии собрали 18,8% пыльцы с трав и 69,7% пыльцы с деревьев и кустарников. Индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составил 1,14, а ENS — 3,46 (рис. 5).

Цветочное разнообразие Техаса

Весной мы идентифицировали пыльцу, относящуюся к 49 таксонам, представляющим 36 семейств (таблица S2, фигура S2).В семействе Anacardiaceae был один «вторичный» таксон, который также был самым многочисленным семейством растений, обнаруженным во всех выборках. Мы также обнаружили «важные второстепенные» таксоны растений, а также один важный неизвестный «второстепенный» таксон, который имел зерна с триколпоратной структурой (рис. 7А). Колонии собрали 9,5% пыльцы с трав, а 78,5% — с деревьев и кустарников. Весной индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составлял 0,82, а показатель ENS — 2,27 (рис. 5).

Рис. 7. Обилие пыльцы в Техасе.

Сводная информация об относительном количестве пыльцы (идентифицированной по семейству растений), собранной колониями, расположенными в городских и пригородных условиях в Техасе весной (A), летом (B) и осенью (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g007

Летом мы обнаружили пыльцу 20 таксонов растений 15 семейств (таблица S2, рис. S2). Мы обнаружили один «преобладающий» таксон, а также «важные второстепенные» таксоны (рис. 7B). Колонии собрали 4,2% пыльцы с трав и 90% пыльцы.1% из деревьев и кустарников. Летом значение индекса разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составляло 0,43, а значение ENS — 1,61 (рис. 5). Осенью мы обнаружили пыльцу 15 таксонов растений, принадлежащих к 14 семействам (таблица S2, фигура S2). Они состояли из одного «преобладающего» таксона растений, одного «вторичного» таксона и одного «важного второстепенного» таксона (рис. 7C). Колонии собрали 27,6% пыльцы с трав и 72,4% пыльцы с деревьев и кустарников. Разнообразие Шеннона-Уивера для каждого участка осенью составило 0,61, а ENS — 1.98 (рис 5). Мы не собирали пыльцу с ноября по февраль в Техасе.

Цветочное разнообразие Флориды

Весной мы идентифицировали 36 таксонов растений, принадлежащих к 30 семействам (таблица S3, рис. S3), состоящих из одного «вторичного» таксона и нескольких «важных второстепенных» таксонов (рис. 8A). Колонии собрали 12,4% пыльцы с трав и 83,3% пыльцы с деревьев и кустарников. Средний индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка весной составлял 1,14, в то время как ENS составлял 3,57 (рис. 5). Выявленная летом пыльца принадлежала к 29 таксонам растений и 22 семействам (таблица S3, рис. S3).Они состояли из одного «преобладающего» и одного «вторичного» таксона растений (рис. 8B). Колонии собрали 5,0% пыльцы с трав, а 94,3% — с деревьев и кустарников. Летом индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составлял 0,76, а ENS — 2,36 (рис. 5).

Рис. 8. Обилие пыльцы во Флориде.

Сводная информация об относительном количестве пыльцы (идентифицированной по семейству растений), собранной колониями, расположенными в городских и пригородных условиях во Флориде весной (A), летом (B), осенью (C) и зимой (D).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g008

Осенью мы обнаружили пыльцу 34 таксонов растений, представляющих 27 семейств (таблица S3, рис S3). В образцах пыльцы не было «преобладающих» таксонов растений, но мы обнаружили «второстепенные» и «важные второстепенные» таксоны, а также один «второстепенный» таксон (рис. 8C). Колонии собрали 32,3% пыльцы с трав и 62,4% пыльцы с деревьев и кустарников. Осенью индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка был равен 0.76, а ENS — 2,14 (рис. 5). Наконец, зимой был 31 таксон растений в 23 семействах (таблица S3, рис S3), которые принадлежали к «второстепенным» и «важным второстепенным» таксонам (рис. 8D). Колонии собрали 6,9% пыльцы с трав, а 90,6% — с деревьев и кустарников. Индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составил 0,72, а ENS — 2,28 (рис. 5).

Цветочное разнообразие в Мичигане

Весной мы идентифицировали пыльцу 39 таксонов и 27 семейств (таблица S4, рис. S4), которые принадлежали к «вторичным» и «важным второстепенным» таксонам растений (рис. 9A).Колонии собрали 30,3% пыльцы с трав и 61,3% пыльцы с деревьев и кустарников. Весной индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составлял 0,96, а ENS — 2,61 (рис. 5).

Рис. 9. Обилие пыльцы в Мичигане.

Сводная информация об относительном количестве пыльцы (идентифицированной по семейству растений), собранной колониями, расположенными в городских и пригородных условиях в MI весной (A), летом (B) и осенью (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.g009

Летом мы обнаружили 29 таксонов растений из 20 семейств (таблица S4, рис. S4), которые состояли из «преобладающих» и «важных второстепенных» таксонов (рис. 9B). Колонии собрали 77,4% пыльцы с трав и 19,6% с деревьев и кустарников. Летом индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составлял 0,76, а показатель ENS — 2,32 (рис. 5).

Пыльца, собранная осенью, принадлежала к 20 таксонам из 12 различных семейств (таблица S4, фигура S4). Все образцы, принадлежащие к семейству сложноцветных, были сгруппированы вместе, поскольку мы не смогли идентифицировать их до более низкого таксономического уровня.В совокупности вся пыльца семейства сложноцветных (55,23%) считалась «преобладающим» таксоном растений. Были также «важные второстепенные» таксоны, а также один «важный второстепенный» таксон, принадлежащий к неизвестной таксономической группе с трехслойной структурой, которая напоминала пыльцу из рода Salix (рис. 9C). Колонии собрали 89,9% пыльцы с трав, а 3,2% — с деревьев и кустарников. Осенью индекс разнообразия Шеннона-Уивера для каждого участка составил 0,69, а ENS — 2,07 (рис. 5).Пыльца собиралась только в сентябре осенью, а зимой пыльца не собиралась.

Обсуждение

Мы провели годичный обзор цветочных источников пыльцы, добываемой управляемыми колониями медоносных пчел в городских и пригородных условиях в четырех различных регионах США. Используя стандартные мелиссопалинологические методы, мы идентифицировали гранулы пыльцы, собранные собирателями в этих средах. в пространственном и временном масштабах. В целом, «преобладающие» и «вторичные» источники пыльцы, собранные собирателями во всех штатах, происходят от растений, принадлежащих к различным родам Fabaceae (бобовые), Anacardiaceae (сумах), Lythraceae (вербейник), Arecaceae (пальмы), Asteraceae (маргаритки). и астры), семейства Fagaceae (дуб), Sapindaceae (мыльница), Rhamnaceae (облепиха), Salicaceae (ива), Myrtaceae (эвкалипт), Rosaceae (роза) и Brassicaceae (горчица) (таблица S1, таблица S2).Также было большое количество пыльцы с деревьев и кустарников для колоний в Техасе, Флориде и Калифорнии, в том числе в семьях Lythraceae, Arecaceae, Fagaceae, Salicaceae, Myrtaceae и Rosaceae. Ранее было показано, что эти типы деревьев и кустарников являются важными источниками пыльцы для опылителей в урбанизированных районах [65, 66]. Интересно, что большая часть пыльцы, собранной в MI летом и осенью, поступает с травянистых растений, а не с деревьев и кустарников, что указывает на важность трав в качестве корма для медоносных пчел в этом регионе США.С.

Калифорния была штатом с наибольшим количеством таксонов, идентифицированных в данный сезон (n = 64 весной). Несмотря на такое таксономическое изобилие, относительно высокий индекс разнообразия Шеннона-Уивера для этого сезона (1,21) свидетельствует о низкой однородности видов в каждый период отбора проб в каждой отобранной колонии. Это указывает на то, что собиратели не собирали пыльцу равномерно в течение определенного периода отбора проб, а вместо этого, вероятно, предпочитали собирать пыльцу из нескольких цветочных ресурсов в каждой коллекции.Это согласуется с предыдущей работой, показывающей, что даже в случаях, когда доступно большое разнообразие растительных ресурсов, медоносные пчелы, как правило, сосредотачивают свои усилия на поисках пищи на нескольких видах [46, 67, 68], потому что предпочтительные источники более многочисленны, или потому что они обеспечивают определенные питательные вещества, которые необходимы колониям в определенное время. Кроме того, известно, что медоносные пчелы обследуют окружающую их территорию и коллективно кормятся с нескольких видов растений в определенный момент времени до тех пор, пока ресурсы почти не исчерпаны [1, 45, 49, 67–70].

Диапазон наблюдаемого эффективного числа видов (ENS) во всех штатах и ​​сезонах варьировался от 1,61 таксона растений в MI летом, когда пыльца семейства Fabaceae была наиболее «преобладающим» типом, до 3,75 таксонов растений в ЦА в течение лета. весной, где большая часть собранной пыльцы поступала из семейств Rosaceae, Brassicaceae, Myrtaceae и Fagaceae. Наше исследование показало, что наибольшее разнообразие таксонов растений, добываемых кормом, наблюдается весной. Этот результат отличался от исследований в Европе, которые показали, что наибольшее разнообразие растений вокруг сельскохозяйственных ландшафтов наблюдается летом [48–50].Эти различия могут быть связаны с сезоном, различиями в ландшафтных характеристиках между исследуемыми регионами, количеством образцов, собранных на участке, самым низким таксономическим уровнем цветков, достигнутым во время идентификации пыльцы, или общей деятельностью рабочих в поисках пищи. В частности, более теплые месяцы в Европе случаются не раньше, чем в течение года, по сравнению с местами, включенными в наше исследование. Например, температура в Германии колеблется от 8 C до 18 ˚C в мае, что примерно соответствует температуре в большинстве наших мест в конце зимы — начале весенних месяцев.Средняя широта в этих европейских исследованиях [48–50] составляла приблизительно 48,35 ° с.ш., тогда как средняя широта для наших четырех штатов в США составляла 35,32 ° с.ш. который находится на той же широте, что и США (около 31,77 ° с.ш.), был самым высоким с ранней весны до середины лета [65].

Низкое таксономическое разнообразие растений, наблюдаемое в летние месяцы в MI, вероятно, связано с обилием растений, сгруппированных в семейство Fabaceae, особенно в родах Trifolium и Melilotis .Даже несмотря на то, что колония в целом может собирать пыльцу из нескольких источников растений в течение более длительного периода времени, отдельные рабочие обычно демонстрируют временную специализацию и постоянство цветков для конкретного источника пыльцы [4], при этом 52–79% пыльцы составляют за неделю собирается колония, принадлежащая одному виду растений [20]. При максимальном периоде сбора пыльцы в одну неделю наши методы обеспечивали лишь ограниченный предварительный просмотр того, какие колонии собирают в данный момент времени, поскольку пчелы могли вернуться с пыльцой с совершенно разных растений в дни или недели до или после сбора образцов.Иногда пчеловоды-добровольцы включали ловушки всего за несколько дней до отбора проб пыльцы. Несмотря на короткое время для сбора пыльцы каждый месяц, а также временную специализацию колонии по сбору пыльцы, мы по-прежнему наблюдали пространственные и временные различия в разнообразии растений, выращиваемых нашими очаговыми колониями. Однако сезонность может иметь большее влияние на разнообразие пыльцы, собираемой собирателями, по сравнению с эффектами на уровне ландшафта, такими как уровень городского развития в окружающем ландшафте колонии [48].

Источник дал наибольшее таксономическое богатство пыльцы во всех регионах, при этом растения из семейств Anacardiaceae, Rosaceae, Rhamnaceae и Arecaceae представляют большую часть пыльцы, собранной в Техасе, Калифорнии, Мичигане и Флориде, соответственно. Летняя пыльца в MI была преимущественно представлена ​​родами семейства Fabaceae, в частности, растениями из родов Trifolium , Melilotus , Lotus , Gleditsia и Mimosa , которые являются обычными инвазивными травами и кустарниками, встречающимися в городских и городских районах. полугородские районы [71].Роды растений, встречающиеся в MI, очень привлекательны для медоносных пчел, но в этом состоянии считаются инвазивными растениями [71]. По мере того, как сезон приближался к осени, колонии в MI преимущественно добывали пыльцу из семейства Asteraceae, которое также в значительной степени было представлено как «вторичный» тип пыльцы в CA, TX и FL. Аналогичная тенденция перехода медоносных пчел на Великих равнинах Севера с растений семейства Fabaceae на растения семейства Asteraceae ранее наблюдалась Smart et al.[72].

В Калифорнии и Флориде, где колонии отбирались зимой, фуражиры собирали пыльцу в основном с рано цветущих деревьев и кустарников из семейств Fagaceae, Aceraceae, Myrtaceae, Rosaceae и Salicaceae. Только несколько групп растений надежно обеспечивали пыльцой в течение года во всех штатах. Например, растения семейств Arecaceae и Myrtaceae ( Eucalyptus spp.) Обеспечивали надежный источник пыльцы для колоний в течение всего года в Флориде и Калифорнии. Известно, что растения из рода Eucalyptus и семейства Arecaceae обычно добываются медоносными пчелами и пчелами без жала в других регионах, включая Бразилию и Вест-Индию [73, 74].Пыльца растений семейства Arecaceae, как правило, содержит высокий уровень белка, незаменимых аминокислот и минералов [75]. Однако антиоксидантная активность пыльцы Arecaceae имеет тенденцию быть низкой по сравнению с другими типами пыльцы [76]. Между тем, Эвкалипт обычно считается типом пыльцы с низким содержанием питательных веществ, поскольку он имеет низкое содержание лизина (незаменимой аминокислоты) и омега-3 жирных кислот, которые положительно связаны с улучшением обучения и памяти медоносных пчел [77, 78].

Креп мирт, принадлежащий к роду Lagerstroemia (Lythraceae), был представлен как «преобладающий» тип растений, выращиваемых в Техасе и Флориде, и был «вторичным» типом растений в ЦА. Листопадный кустарник, произрастающий в Индии, креп-мирт является обычным декоративным растением в городской среде, демонстрирующим диморфную пыльцу с двумя отчетливыми мутовками: один служит пищей для опылителей, а другой используется для удобрения растений [79, 80]. Интересно, что хотя пыльца крепового мирта ранее была обнаружена в меде из нескольких штатов [81], ее присутствие в меде, вероятно, является побочным эффектом, возникающим в результате «перекрестного заражения» сборщиками пыльцы, учитывая, что это растение не имеет нектарников и, следовательно, оно не является источником нектара для пчел.Креп-мирт был задокументирован как источник пыльцы местных и неместных пчел в других исследованиях [82–85]. Фактически, креп-мирт может быть недооценен из-за его вклада в питание медоносных пчел в конце лета, в период, когда семьи могут испытывать серьезную нехватку ресурсов [86]. Таким образом, «преобладающее» присутствие пыльцы мирта крепового, которое мы наблюдали летом, предполагает, что некоторые из наших исследуемых колоний полагались на присутствие этого декоративного растения в городской среде для сбора пыльцы [80, 87].

Поддержание надежного потока пыльцы при выращивании расплода имеет решающее значение для питания [88]. В гетерогенной среде, содержащей источники пищи, различающиеся по качеству и количеству, медоносные пчелы применяют различные стратегии поиска пищи для регулирования своего состояния питания [89]. Например, медоносные пчелы предпочитают одни незаменимые аминокислоты и жирные кислоты другим, а также определенные диеты, которые дополняют предыдущие диеты с недостаточным питанием [22–24, 90]. В нашем исследовании мы квалифицировали типы растений, которыми пчелы кормятся в городской среде, используя метод категоризации, описанный ранее [61], и рассмотрели пространственные и временные различия в разнообразии пыльцы.Однако, поскольку мы не определяли количественно относительное количество пыльцы, принесенной из каждого цветочного источника, наши результаты не могут ни сделать вывод о состоянии питания колонии, ни определить, ограничены ли пыльцой колонии в городских и пригородных условиях. Avni et al. [13] обнаружили пространственные и временные различия в количестве и содержании пыльцы путем измерения потребления пыльцы колониями и количественного определения содержащихся в ней макроэлементов за целый год [13]. Несмотря на эти различия, авторы не обнаружили каких-либо пищевых эффектов количества и качества пыльцы на общий рост колонии в течение года.Как универсальные фуражиры, медоносные пчелы собирают ресурсы с самых разных растений и могут компенсировать дефицит питательных веществ, собирая дополнительные рационы [23]. Дальнейшие исследования, направленные на дальнейшее рассмотрение этого вопроса, должны включать использование Геометрической структуры, которая исследует, как организмы (в том числе индивидуумы и живущие в колонии «суперорганизмы») балансируют потребление питательных веществ в многомерном пространстве питательных веществ [91–93].

Наша основная цель в этом исследовании состояла в том, чтобы определить «преобладающие», «вторичные» и «важные второстепенные» таксономические группы растений, с которых медоносные пчелы собирают пыльцу в городских и пригородных районах.Одним из ограничений было то, что не все типы пыльцы были идентифицированы до уровня вида, отчасти потому, что традиционный метод световой микроскопии, который мы использовали для идентификации пыльцы на основе морфологии зерна, — это трудоемкий процесс, требующий высокого уровня знаний. В зависимости от микроскопа и временных ограничений желаемого исследования, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) может использоваться в сочетании со световой микроскопией для визуализации определенных морфологических особенностей, которые не ясны только с помощью световой микроскопии, обеспечивая лучшее таксономическое разрешение на уровне рода или вида [ 39, 94].Новые технологии, такие как мета-штрих-кодирование ДНК, которое проверяет образцы пыльцы на определенные последовательности генома растений, в настоящее время изучаются для идентификации пыльцы [68, 95–98]. Однако этот метод все еще находится в разработке, так как он не обеспечивает адекватного определения относительной численности каждого типа пыльцы и может давать «ложноположительные» результаты идентификации растений [98, 99]. Комбинированное использование микроскопии и молекулярных методов, вероятно, обеспечит наиболее полную и надежную информацию при проведении палинологического анализа цветочного происхождения и обилия пыльцевых зерен в данном образце.Хотя мы отбирали пыльцу только в течение ограниченного периода времени в течение каждого месяца, наши результаты являются репрезентативными для растительных источников пыльцы, предпочитаемых в развитых средах в разные сезоны и географические регионы. С постоянно меняющимся составом ландшафтов наши результаты могут помочь нам лучше понять экологию питания медоносных пчел в городских и пригородных условиях, а также помочь в продвижении использования растений, которые обеспечивают соответствующие ресурсы пыльцы медоносным пчелам в развитых районах. Кроме того, данные, полученные в этом исследовании, могут быть использованы государственными и частными городскими садовниками, чтобы помочь им в выборе пестицидов, используемых на декоративных и ландшафтных растениях, особенно с точки зрения сроков и норм применения продуктов, используемых в домах и садах.Например, следует планировать режимы обработки пестицидами, чтобы избежать применения химикатов, когда пчелы в основном собирают пыльцу с данного растения. Приветствуются аналогичные исследования в других регионах страны, чтобы помочь нам лучше понять и, возможно, улучшить условия кормодобывания, доступные медоносным пчелам в городских условиях в течение года.

Вспомогательная информация

S1 Таблица. Таксономическая идентификация пыльцы, собранной в Калифорнии.

Семейство, род, частотный класс, количество зерен (количество подсчитанных пыльцевых зерен), относительная численность (как описано Louveaux et al.[58]) и общий тип растительных источников пыльцы, выявленных в Калифорнии для каждого сезона. Преобладающие, вторичные, важные второстепенные и второстепенные типы пыльцы определяются как те таксономические группы, обнаруженные в более чем 45%, 16–45%, 3–16% или менее 3%, соответственно, из 200 пыльцевых зерен, проанализированных на образец. как описано ранее [58].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s001

(XLSX)

S2 Стол. Таксономическая идентификация пыльцы, собранной в Техасе.

Семейство, род, частотный класс, количество зерен (количество подсчитанных пыльцевых зерен), относительная численность (как описано Louveaux et al. [58]) и общий тип растительных источников пыльцы, выявленных в Техасе для каждого сезона. Преобладающие, вторичные, важные второстепенные и второстепенные типы пыльцы определяются как те таксономические группы, обнаруженные в более чем 45%, 16–45%, 3–16% или менее 3%, соответственно, из 200 пыльцевых зерен, проанализированных на образец. как описано ранее [58].

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0217294.s002

(XLSX)

S3 Таблица. Таксономическая идентификация пыльцы, собранной во Флориде.

Семейство, род, частотный класс, количество зерен (количество подсчитанных пыльцевых зерен), относительная численность (как описано Louveaux et al. [58]) и общий тип растительных источников пыльцы, выявленных во Флориде для каждого сезона. Преобладающие, вторичные, важные второстепенные и второстепенные типы пыльцы определяются как те таксономические группы, обнаруженные в более чем 45%, 16–45%, 3–16% или менее 3%, соответственно, из 200 пыльцевых зерен, проанализированных на образец. как описано ранее [58].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s003

(XLSX)

S4 Таблица. Таксономическая идентификация пыльцы, собранной в Мичигане.

Семейство, род, частотный класс, количество зерен (количество подсчитанных пыльцевых зерен), относительная численность (как описано Louveaux et al. [58]) и общий тип растительных источников пыльцы, выявленных в Мичигане для каждого сезона. Преобладающие, вторичные, важные второстепенные и второстепенные типы пыльцы определяются как те таксономические группы, обнаруженные в более чем 45%, 16–45%, 3–16% или менее 3%, соответственно, из 200 пыльцевых зерен, проанализированных на образец. как описано ранее [58].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s004

(XLSX)

S1 Рис. Микрофотографии преобладающего (P), вторичного (S) и второстепенного (IM) типов пыльцы CA.

1) тип Rosaceae, 2) Brassica , 3) тип Myrtaceae, 4) Quercus , 5) тип Rhamnaceae, 6) Rhus , 7) Vicea , 8) Medicago, 9) Asteraceae- Lactuceae , 10) Lagerstroemia indica , 11) Centaurea , 12) Trifolium / Melilotus , 13) Lotus , 14) Eucalyptus , 15) Rhus , 16) Тип Arecaceae, 17) Brassica , 18) тип Apiaceae, 19) Prunus , 20) Ulmus , 21) Salix , 22) Eucalyptus , 23) тип Anacardiaceae, 24) HS Asteraceae, 25) тип Rosaceae, 26) Ulmus , 27) Myrica , 28) Eucalyptus , 29) Prunus , 30) Salix , 31) Тип Rhamnaceae, 32) Acacia , 33) Acer , 34) Fraxinus , 35) Алнус .Белая шкала в каждом квадрате соответствует 25 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s006

(TIF)

S2 Рис. Микрофотографии преобладающих (P), вторичных (S) и важных второстепенных (IM) типов пыльцы TX.

1) Rhus , 2) Crataegus , 3) Quercus , 4) Triadaca sebifera , 5) Неизвестный трехслойный тип, 6) Populus , 7) Trifolium / Melilotus , 8 ) Vitis , 9) Lagerstroemia indica 10) Lagerstroemia indica , 11) Prosopis , 12) Тип Areaceae, 13) Rhus , 14) Lagerstroemia indica , 15) HS Asteraceae, 16) Ulmus .Белая шкала в каждом квадрате соответствует 25 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s007

(TIF)

S3 Рис. Микрофотографии преобладающего (P), вторичного (S) и второстепенного (IM) типов пыльцы FL.

1) Тип Arecaceae, 2) Magnolia grandiflora , 3) Platanus , 4) Vitis , 5) Eucalyptus , 6) Mimosa pudica , 7) Lagerstroemia indica , 8) HS Asteraceae тип, 9) Lagerstroemia indica , 10) Тип Arecaceae, 11) Schinus , 12) Cocos , 13) HS Asteraceae, 14) Тип Ranunculaceae, 15) Casuarina , 16) Baptisia , 17) Quercus , 18) Acer , 19) Тип Rosaceae, 20) Salix , 21) Тип Arecaceae, 22) Тип HS Asteraceae, 23) Citrus .Белая шкала в каждом квадрате соответствует 25 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s008

(TIF)

S4 Рис. Микрофотографии преобладающих (P), вторичных (S) и важных второстепенных (IM) типов пыльцы MI.

1) тип Rhamnaceae, 2) Acer , 3) Salix , 4) Prunus 5) Robinia , 6) Trifolium / Melilotus тип 1, 7) Trifolium / Melilotus тип 2 , 8) Castanea , 9) Rhus , 10) тип Apiaceae, 11) Plantago , 12) Parthenocissus , 13) HS Asteraceae, 14) HS Asteraceae — триба Lactuceae, 15) Artemisia , 16) тип Ranunculaceae, 17) Trifolium , 18) Неизвестный тип триколпата, 19) Тип Poaceae.Белый цвет в каждой шкале прямоугольника соответствует 25 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217294.s009

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить сотрудничающие пчеловодческие группы в Калифорнии, Флориде, Мичигане и Техасе за помощь в сборе образцов пыльцы из их колоний. Мы благодарим сотрудников Александрии Пейн и Вона Брайанта за их опыт палинологической идентификации для определения типов пыльцы. Мы благодарим Брэнди Симмонс и Саванну Нис за помощь в лаборатории и сбор пыльцы во Флориде, Сянбин Се и Шудонг Луо (оба — МГУ) за сбор пыльцы в Мичигане.

Ссылки