Пцр на туберкулез крови: Инвитро. Туберкулёз, узнать цены на анализы и сдать в Москве

Содержание

Диагностика туберкулеза по анализу крови

Диагностика туберкулеза по анализу крови часто заключается в проведении исследования по ПЦР методике. Определение генетического материала возбудителя — палочки Коха — путем многократного копирования ДНК-фрагмента. Для обследования нужно сдать кровь из вены.

Туберкулез — инфекционная болезнь, которой можно заразиться воздушно-капельным путем от человека или животного. У 90 процентов первичное инфицирование не приводит к развитию туберкулеза — иммунная система подавляет микобактерии. Переход из латентной формы в активную наступает при сильном подавлении иммунитета. В группу риска входят:

  • ВИЧ-инфицированные,
  • больные сахарным диабетом,
  • беременные,
  • пожилые,
  • дети после виража туберкулиновых проб,
  • контактирующие с больными туберкулезом.

Сегодня анализ крови по методике ПЦР — один из самых чувствительных и быстрых методов диагностики.

Можно также провести стандартный бактериальный посев, который отличается высокой специфичностью. Но у него есть и недостатки — длительность, необходимость высокой концентрации палочек Коха в материале. При диагностике легочной формы болезни бакпосев сочетают с рентгенографией.

Специалисты также назначают анализы на антитела к микобактериям — специфическим иммуноглобулинам. Определяют суммарно IgG и IgM. Для диагностики используют метод иммуноферментного анализа, ИФА. В активной форме иммунная система вырабатывает большое количество антител к антигенам. Анализы показательны через месяц с момента перехода заболевания в активную форму. Обследование вакцинированных пациентов не дает ложноположительных результатов. Специфичность тестов крови достигает 95 процентов. Чувствительность зависит от локализации микобактерий.

Показания к диагностике туберкулеза по анализу крови:

  • подозрения на внелегочный туберкулез,
  • контакт с больными,
  • ВИЧ-инфекция,
  • признаки туберкулезной бактериемии.

Бактериемия — содержание бактерий в крови, изначально она стерильна. Возможна на первых стадиях туберкулезной инфекции, при генерализованном, внелегочном туберкулезе. Опасна развитием сепсиса и септического шока. В группу риска развития генерализованного заболевания входят больные ВИЧ на поздних стадиях, пациентов, прекративших лечение, поздно обратившихся при появлении признаков. Если для диагностики у ВИЧ-инфицированных проводить микробиологические анализы или пробы на туберкулин, то возможно получение ложноотрицательных результатов и-за угнетенного иммунитета.Им лучше проходить ПЦР исследование.

В сети лабораторий «Литех» можно пройти диагностику по разным анализам крови. Записывайтесь на удобное время.

Оказание услуг по лабораторной диагностике туберкулеза

Диагноз за 2 часа

Диагноз за 2 часа — это реально!

Диагностика туберкулеза проводится в бактериологической лаборатории.

Для того, чтобы в лаборатории выполнили исследование, пациент должен сдать один или несколько образцов диагностического материала. Чаще всего туберкулез поражает легкие, поэтому основной материал для диагностики этого заболевания — мокрота. Результативность исследования зависит от качества мокроты, поэтому ее сбор должен проводиться после инструктажа пациента в специальном помещении под наблюдением медработника. Если у пациента не получается собрать мокроту самостоятельно, ему может быть назначена раздражающая ингаляция.

Микобактерии туберкулеза можно обнаружить разными методами, которые характеризуются разной диагностической чувствительностью и длительностью исследования.

Самый быстрый, простой и недорогой метод, позволяющий выявить самые заразные случаи туберкулезав течение одного рабочего дня – микроскопическое исследование мазка мокроты, окрашенного специальными красителями.

Бактериологическое исследование (посев на яичные питательные среды) служит «золотым стандартом» диагностики туберкулеза. Посев обнаруживает микобактерии туберкулеза в биологическом материале пациента, что позволяет установить диагноз и определить, какими противотуберкулезными лекарствами нужно лечить пациента. Этот метод очень чувствительный, однако исследование длительное, колонии микобактерий на питательной среде обычно вырастают не раньше, чем через 3 недели. Тестирование лекарственной чувствительности выросшей культуры микобактерий туберкулеза занимает

еще 28 дней. Результат исследования в случае отсутствия микобактерий в образце выдается через 8 недель.

Проведение исследования на автоматизированной системе ВАСTЕС MGIT 960 существенно быстрее  по сравнению с посевом. Рост микобактерий в пробирке с жидкой средой регистрируется в среднем уже через5-14 дней. Тестирование лекарственной чувствительности выросшей культуры микобактерий занимает еще 14 дней. Окончательный результат в случае отсутствия микобактерий в образце выдается через 42 дня.

Кроме бактериологических исследований, можно выполнить также молекулярно-генетические исследования на туберкулез, основанные на ПЦР (полимеразной цепной реакции). Это самые быстрые на сегодняшний день методы исследования.

Экспресс-метод Xpert MTB/RIF обнаруживает микобактерии туберкулеза в образце и определяет их устойчивость к 

рифампицину (1 из 2 основных противотуберкулезных лекарственных средств) за 2 часа.

Еще один быстрый молекулярно-генетический метод диагностики туберкулеза – Хайн-тест, названный по имени производителя. Этот метод позволяет обнаружить микобактерии туберкулеза в образце, а также определить  чувствительность  к основным  и к резервным противотуберкулезным лекарственным средствам за  2 дня.

Используемые в современных лабораториях методы диагностики туберкулеза позволяют быстро и эффективно проводить исследование диагностического материала, обнаруживать возбудитель туберкулеза и определять его лекарственную чувствительность, чтобы правильно и своевременно устанавить диагноз и назначить адекватное лечение пациентам с туберкулезом.

Туберкулез излечим, это не приговор, а диагноз. Необходимо вовремя выявить заболевание и начать лечение.

< Предыдущая   Следующая >

Диагностика туберкулеза в Запорожье в МЦ «ШЕКИ» методом ИФА

Туберкулез является одним из старейших инфекционных заболеваний. Вызывается микобактериями. О нем писали Гиппократ и Авиценна, пытаясь найти причину этого коварного заболевания. Практически, туберкулез поражал человека с момента его возникновения на Земле, о чем свидетельствуют останки древних людей. В конце прошлого столетия, когда все думали, что туберкулез вот-вот исчезнет, как бубонная чума, он с новыми силами начал атаку на человека! Сегодня, по данным ВОЗ, от этой болезни умирает людей немногим меньше, чем от СПИДа. Диагностика на ранних стадиях, позволяет провести эффективную терапию и дать возможность человеку жить полноценной жизнью.

Лабораторная диагностика позволяет выявить микобактерии и дает возможность диагностировать заболевание на любой стадии. В лаборатории медицинского центра «ШЕКИ» можно сдать анализ на туберкулез  в Запорожье методом ИФА. Для максимально точной диагностики, важно знать, как правильно подготовиться к сдаче анализа!

Как можно заразиться?

Микобактерия туберкулеза очень живуча и прекрасно себя чувствует и на пыльном тротуаре, и на страницах книг, и в воде. Ее живучесть объясняется ее способностью мутировать, причем, даже уже находясь в организме человека. Это очень усложняет лечение заболевания. Все новые антибиотики быстро вызывают адаптацию микобактерий к новым условиям. Заразиться туберкулезной палочкой можно в любом общественном месте, где побывал человек с открытой формой туберкулеза. Если раньше данная болезнь считался болезнью социально неблагополучных людей, то сегодня, картина резко изменилась и спустившись в метро, легко можно получить такой подарок, как туберкулезная палочка.

Другое дело, что не все, кто является носителем туберкулезной инфекции, болеют. Человек с нормальным иммунитетом может долгие годы не болеть, но при изменении условий, например, сильном стрессе, ослабившем иммунную систему, хроническом заболевании, инфекция может начать свою активную жизнедеятельность.

Что поражает туберкулезная палочка?

По статистике, около 90% всех случаев болезни приходятся на поражение легких. Однако, встречается и туберкулезное поражение костей, мочеполовой системы, сердечнососудистой системы, кожи и др. Поэтому различают легочную форму и внелегочную форму туберкулезной инфекции.
Разновидности заболевания
Различают первичный и вторичный туберкулез. Первичная форма характеризуется острым течением болезни. Часто ею болеют дети младшего возраста, старшей возрастной группы, ослабленные хроническими заболеваниями. При этой форме, человек не заразен.

Вторичный тип заболевания возникает, если человек уже излечившись от одного вида микобактерии, заразился новой разновидностью микобактерии. Иногда это может произойти, когда ремиссия перешла в обострение. Вторичный вид болезни очень заразен и трудно поддается лечению.

Иммуноферментная диагностика (ИФА)

Иммуноферментная диагностика туберкулеза позволяет выявить антитела к микобактерии. Суммарные антитела IgA, IgM, IgG к туберкулезу позволяют с большей долей вероятности поставить диагноз, определив стадию развития болезни, успешность назначенной терапии и др. Наличие различного типа иммуноглобулинов в сыворотке крови позволяет сделать прогноз развития заболевания. У взрослых и детей комбинация данных антигенов различна, поэтому, только высококвалифицированный фтизиатр может, проанализировав результат исследования, сделать правильные выводы!

Сдать анализ крови на туберкулез в Москве

Полное название анализа: Анализ крови на туберкулез (Tuberculosis)

Биоматериал: Соскоб: из церв. канала,из уретры, из влагалища, секрет простаты, соскоб с эрозивно-язвенных элементов, поверхность миндалин, мазок из носоглотки и ротоглотки, отделяемое конъюнктивы, мокрота, моча, слюна, сперма

Туберкулез относится к заболеваниям, которые способны привести к смерти пациента. Возбудитель опасен не только для больного, но и для окружающих его людей, так как заражение происходит воздушно—капельным путем. Поэтому на первое место выходят все способы диагностики данной патологии, так как на начальных стадиях бороться с болезнью намного легче, чем с запущенными процессами.

Туберкулиновая проба не всегда отражает истинное положение дел. В некоторых случаях проводить пробы нельзя по медицинским показаниям. Анализ на туберкулез проводится в двух случаях: для выявления возбудителя и оценки эффективности проводимого лечения.

При инфицировании туберкулезом, в большинстве случаев возникает латентная (неактивная) форма инфекционного заболевания. Хотя и при таком состоянии в редких случаях вероятно проявление таких симптомов как вялость, недомогание, быстрая утомляемость, бледность кожных покровов, худоба, потение, субфебрильная температура и т. д. Возможны заболевания крови – анемия и лейкопения.

Любая форма туберкулеза – это высоко заразительная инфекция, так как патоген присутствует в слюне, мокроте, крови, моче и других биоматериалах зараженного человека. Болезнь несет в себе угрозу будущему нации, по этой причине открываются все новые методы достоверного выявления бактерии. Используется классический культуральный метод, анализ мазка (изучается мокрота человека), ИФО и ПЦР-метод. Последний тип исследования позволяет обнаружить ДНК инфекции даже во фрагментах единичных клеток и полностью исключает вероятность перекрестной реакции, дифференцировать диссеминированные и ограниченные формы туберкулеза.

Аналитические показатели:

  • определяемый фрагмент — специфичные участки ДНК микобактерий;
  • специфичность определения — 100%;
  • чувствительность определения — 100 копий ДНК микобактерий в образце.

Что показывает анализ

При подозрении на туберкулез назначается сразу несколько методик исследования плазмы к которым относят:

  • Биохимический анализ;
  • Квантифероновый тест;
  • Иммуноферментный или ИФА;
  • Полимеразная цепная реакция.

Каждый из перечисленных методов имеет свою цель, но в комплексе они помогают выявить туберкулез в начальной и латентной форме, протекающей без ярко выраженных, характерных для туберкулеза симптомов. Сделать это используя лишь один вид обследования невозможно.

Общий анализ не способен обнаружить палочку Коха, его задача выявить наличие воспалительного процесса в организме. Для врача в данном случае важен показатель СОЭ, лимфоцитов, лейкоцитов и нейтрофилов.

Биохимию имеет смысл проводить в период обострения. Квантифероновый тест необходим для определения в плазме антител к микобактериям туберкулеза. Недостатком данного метод является невозможность определить стадию болезни: острую или ремиссию.

Показания к анализу

Анализ крови на туберкулез проводится в следующих случаях:

  • После положительной реакции пробы;
  • После контакта с больным туберкулезом;
  • Для диагностики туберкулёза, локализованного не в легких, а других органах и системах;

Анализ крови назначают при наличии следующих симптомов:

  • Кашель неизвестного происхождения, продолжающийся более трех недель;
  • Наличие субфебрильной температуры в течение длительного времени;
  • Появления сильной слабости, приводящей к потере трудоспособности;
  • Сильной потере веса, не связанной с диетами и ограничениями в питании;
  • Появления румянца на фоне сильной бледности кожных покровов;
  • Увеличение лимфоузлов;
  • Заострение черт лица.

Забор крови для проверки на туберкулез проводят пациентам, страдающим сахарным диабетом, имеющим статус ВИЧ больных и тем, кому проводилась пересадка органов.

Подготовка к процедуре

Чтобы получить точный результат анализа, рекомендуется соблюдать ряд правил:

  • Забор крови проводится строго натощак, есть можно за 8 часов до сдачи материала. Накануне забора материала исключается прием жирных и острых блюд;
  • За несколько дней до анализа запрещено употреблять алкоголь;
  • Ограничение вводится на физические нагрузки.

За неделю до анализа прекращают прием антибиотиков и противомикробных средств. Если пациент принимал какие—либо лекарства, об этом следует сообщить лаборанту и лечащему врачу, так как некоторые препараты могут искажать результат.

Ложный результат будет получен в том случае, если перед анализом проводилась прививка БЦЖ или выполнялась туберкулиновая проба. Квантифероновый тест можно проводить и после прививки, в этом случае введенный препарат никак не влияет на показатели.

Как проводится анализ

При проведении квантиферонового теста, в крови пытаются обнаружить специфические интерфероны, которые появляются только в случае присутствия в организме палочки Коха. Данный метод заключается в том, что в плазму добавляются антигены. Потом наблюдают за реакцией, происходящей в плазме.

Иммуноферментный метод считается более точным. В этом случае ищут определенные иммуноглобулины, которые вырабатываются при инфицировании палочкой. Но в этом случае реакция может быть запущена не только возбудителем туберкулеза. В данном случае этот тип обследования проводят для определения эффективности лечения.

Полимеразная цепная реакция является при сегодняшнем уровне развития медицины одним из самых точных способов выявления заболевания. Так как стоимость теста достаточно высока, его назначают в случае неясной клинической картины и имеющихся сомнений в диагнозе.

При этом методе обследования в плазме крови определяют наличие частей молекулы ДНК. На первом этапе в плазме определяют наличие палочки Коха. Затем переключаются на генный уровень. В этом случае удается обнаружить ненормальное количество бактерий. Данное обследование позволяет определить и место локализации микроорганизмов. Среди всех сред плазма является наиболее информативный.

Нормы и расшифровка результата

Если в ходе ПЦР выявлен:

  • Отрицательный результат, то подозрение на туберкулез полностью не снимается. Пациент должен будет ещё раз пройти обследование и подтвердить отрицательное значение;
  • Если обнаруживаются части генного кода и следы жизнедеятельности бактерий, говорят о положительном результате.

Иммуноферментный анализ также имеет два варианта ответа — положительный и отрицательный. Наличие иммуноглобулина amg свидетельствует о ходе острого процесса из—за инфицирования. При отрицательном значении данные структуры в плазме полностью отсутствуют.

При общем анализе повышается скорость оседания эритроцитов и достигает 50 единиц. Повышается концентрация лейкоцитов и эозинофилов. Число лимфоцитов снижается. При ремиссии число форменных элементов соответствует принятым нормам, но уменьшается уровень гемоглобина. При значительном количестве инфильтратов уменьшаются размеры красных кровяных телец и снижается их количество.

В биохимии изменяется альбумин—глобулиновый коэффициент. Он уменьшается, хотя его норма 1,5—2,3). В стадии ремиссии основные показатели остаются в пределах нормы.

Диагностика и лечение туберкулеза — Клиники Беларуси

Диагностика и лечение туберкулеза

Туберкулез — это широко распространенное в мире инфекционное заболевание, развитие которого провоцируется микобактериями туберкулеза.

Наиболее частой мишенью данного заболевания являются лёгкие, реже – другие органы и системы.

По данным Всемирной Организации здравоохранения (ВОЗ) треть населения всего мира инфицирована микобактериями туберкулеза. Значит ли это, что все они заболеют? Нет, болезнь развивается только у 10% инфицированных.

Важно: туберкулез предотвратим и излечим.

И у ВОЗ есть тому доказательства: с 2000 по 2013 год 37 миллионов человеческих жизней было спасено благодаря своевременной диагностике и адекватному лечению этого заболевания.

Фтизиатры Беларуси — настоящие виртуозы своего дела: за 2014 год заболеваемость туберкулезом в республике снизилась с 37,2 до 34,5 на 100 тысяч населения, смертность – с 5,7 до 4,7 на 100 тысяч. В Беларуси есть все для своевременной диагностики и соответствующего лечения пациента с туберкулезом, что позволяет спасти жизнь человека.

Диагностика туберкулеза.

1.Лабораторная диагностика. В Беларуси успешно работает Республиканская референс-лаборатория, оснащенная современным оборудованием, в которой работают прекрасно подготовленные специалисты, что позволяет обеспечить быструю и качественную бактериологическую диагностику, которая включает в себя:

микроскопию мазка, выполняемую в течение всего одного дня;

бактериологическое исследование (посев) – «золотой стандарт» в диагностике туберкулеза —  занимает от 3 до 8 недель. Использование автоматизированной системы ВАСTЕС MGIT960 позволяет сократить время исследования, по сравнению с классическим посевом, до 5-42 дней. Чем больше микобактерий в образце мокроты, тем быстрее можно получить ответ;

молекулярно-генетические исследования на туберкулез с определением лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза.

Экспресс-метод диагностики туберкулеза с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени Xpert MTB/RIF позволяет обнаруживать микобактерии туберкулеза в образце мокроты и устойчивость к рифампицину в течение 2 часов. Быстрый молекулярно-генетический метод (Хайн-тест) позволяет обнаруживать микобактерии туберкулеза и определять чувствительность к другим противотуберкулезным лекарствам в течение 2 дней. Эти методы выявлют фрагменты ДНК микобактерии туберкулеза. Опираясь на данного исследования результаты можно уверенно поставить диагноз и подобрать индивидуальное лечение конкретно «под человека».

2. Лучевая диагностика. Всем пациентам, у которых подозревают туберкулез органов дыхания, для исключения данного заболевания проводится цифровая рентгенография. При необходимости выполняется компьютерная томография.

Видеоторакоскопия — это  метод хирургического вмешательства с применением эндоскопического оборудования.  Он позволяет проводить диагностику и дифференциальную диагностику неспецифических заболеваний легких и туберкулеза, подтвердить диагноз по результатам гистологического анализа, полученного при видеоторакоскопии биоптата (кусочка ткани пораженного органа).

Лечение туберкулеза. Лечение туберкулеза в Беларуси проводится в соответствие с мировыми стандартами.   Республика Беларусь первой в Европе начала широкое  использование новых противотуберкулезных лекарственных средств (бедаквилина, деламанида, клофазимина, линезолида, имипенема).

Используется метод лечения аутологичными (собственными) мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками.

Контролируемый прием лекарственных средств с индивидуальным подбором для каждого пациента и лечение всеми доступными противотуберкулезными лекарственными средствами в соответствии с мировыми стандартами позволяет добиться успеха в лечении пациента.

Современные методы в руках опытных врачей позволяют правильно установить диагноз, своевременно назначить адекватное лечение туберкулеза с индивидуальным подбором лекарственных средств и излечить пациента от туберкулеза и неспецифических заболеваний легких. Благодаря внедрению современных технологий в ведущих лечебных учреждениях страны достигнута высокая эффективность лечения – прекращение бактериовыделения достигнуто у 100 % пациентов.

ПЦР может быть методом выбора для выявления как легочного, так и внелегочного туберкулеза | BMC Research Notes

  • Всемирная организация здравоохранения: ДОКЛАД ВОЗ 2007 г. Глобальная борьба с туберкулезом. Надзор, планирование, финансирование. 2007, ВОЗ, Женева

    Google ученый

  • Саид В., Ахмед Дж., Насим А. Эндоронхиальный туберкулез: клинические и диагностические аспекты.Pak Armed Forces Med J. 2002, 52: 154-8.

    Google ученый

  • Батт Т., Карамат К.А., Ахмад Р.Н., Махмуд А.: Достижения в диагностике туберкулеза. Пак Джей Патол. 2001, 12 (1): 1-3.

    Google ученый

  • Риккардо Манганелли, Эжени Дубнау, Санджай Тьяги, Фред Рассел Крамер, Иссар Смит: Дифференциальная экспрессия генов 10 сигма-факторов у Mycobacterium tuberculosis.Молекулярная микробиология. 1999, 31 (2): 715-724. 10.1046/j.1365-2958.1999.01212.х.

    Артикул Google ученый

  • Soini H, Musser JM: Молекулярная диагностика микобактерий. Клин Хим. 2001, 47: 809-14.

    ПабМед КАС Google ученый

  • Styrt BA, Shinnick TM, Ridderhof JC, Crawford JT, Tenover FC: Время обработки микобактериальных культур. Дж. Клин Микробиол.1997, 35: 1041-1042.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google ученый

  • Hale YM, Pfyffer GE, Salfinger M: Лабораторная диагностика микобактериальных инфекций: новые инструменты и извлеченные уроки. Клин Инфекция Дис. 2001, 33: 834-846. 10.1086/322607.

    ПабМед КАС Статья Google ученый

  • Сармьенто О.Л., Вейгле К.А., Александр Дж., Вебер Д.Дж., Миллер В.К.: Оценка с помощью мета-анализа ПЦР для диагностики туберкулеза легких с отрицательным мазком.Дж. Клин Микробиол. 2003, 41: 3233-3240. 10.1128/JCM.41.7.3233-3240.2003.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Шах Санджай, Миллер Альберт, Мастеллоне Энтони, Ким Кёнми, Коланино Питер, Хохштейн Лиза, Д’Амато Ричард, AMPLICOR: Биопсия и образцы биологических жидкостей с помощью AMPLICOR.Грудь. 1998, 113: 1190-1194. 10.1378/груд.113.5.1190.

    ПабМед КАС Статья Google ученый

  • Eisenach KD, Cave MD, Bates JH, Crawford JT: Полимеразная цепная реакция амплификации повторяющейся последовательности ДНК, специфичной для Mycobacterium tuberculosis. J заразить Dis. 1990, 161: 977-981. 10.1093/infdis/161.5.977.

    ПабМед КАС Статья Google ученый

  • Квок С. , Хигучи Р.: Избегайте ложноположительных результатов с помощью ПЦР.Природа (Лондон). 1989, 339: 237-238. 10.1038/339237а0.

    КАС Статья Google ученый

  • Coninx R: Туберкулез в сложных чрезвычайных ситуациях. Всемирный орган здравоохранения Быка. 2007, 85: 637-40. 10.2471/БЛТ.06.037630.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Хасан Р., Джабин К., Мехрадж В., Зафар Ф., Малик Ф., Хассан К. и др.: Тенденции устойчивости Mycobacterium tuberculosis , Пакистан, 1990–2007 гг.Int J Infect Dis. 2009, 13: e377-82. 10.1016/j.ijid.2009.01.008.

    ПабМед Статья Google ученый

  • Farnia PF, Mohammadi Z, Zarifi DJ, Tabatabee J, Ganavi K, Ghazisaeedi PK, Farnia M, Gheydi M, Bahadori MR, Velayati AA: Повышение чувствительности прямой микроскопии для обнаружения кислотоустойчивых бацилл в мокроте: использование хитина в пищеварении слизи. Дж. Клин Микробиол. 2002, 40: 508-511. 10.1128/JCM.40.2.508-511.2002.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Selvakumar N, Rahman F, Garg R, Rajasekaran S, Mohan NS, Thyagarajan K, Sundaram V, Santha T, Frieden TR, Narayanan PR: Оценка метода микроскопии оседания сульфата феноламмония для диагностики туберкулеза легких.Дж. Клин Микробиол. 2002, 40: 3017-3020. 10.1128/JCM.40.8.3017-3020.2002.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Торнтон К.Г., Маклеллан К.М., Бринк Т.Л., Локвуд Д.Э., Романьоли М., Тернер Дж., Мерц В.Г., Швальбе Р.С., Муди М., Луэ И., Пассен С.: Новый метод обработки образцов из дыхательных путей для обнаружения микобактерий с использованием C 18 -карбоксипропилбетаин: слепое исследование. Дж. Клин Микробиол.1998, 36: 1996-2003.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google ученый

  • Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bottger EC, Bodmer T: Быстрая идентификация микобактерий до видового уровня с помощью полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа.Дж. Клин Микробиол. 1993, 31: 175-178.

    ПабМед КАС ПабМед Центральный Google ученый

  • Перера Дж., Чандрасекаран Н.В., Карунанаяке Э.Х.: Обнаружение Mycobacterium tuberculosis на основе ПЦР: влияние пробоподготовки. Юго-Восточная Азия J Trop Med. 1994, Общественное здравоохранение, 25: 693-697.

    Google ученый

  • Greco S, Rulli M, Girardi E, Piersimoni C, Saltini C: Диагностическая точность внутренней ПЦР для туберкулеза легких у пациентов с положительным мазком: метаанализ и метарегрессия. J Clin Microbiol Mar. 2009, 47: 569-576.

    КАС Статья Google ученый

  • Джабин К., Шакур С., Чишти С., Аяз А., Хасан Р.: Устойчивый к фторхинолонам Mycobacterium tuberculosis , Пакистан, 2005–2009 гг. [письмо].Emerg Infect Dis [сериал в Интернете]. 2011 г., [дата указана], [http://www.cdc.gov/EID/content/17/3/564.htm]

    Google ученый

  • Молекулярное обнаружение Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты, окрашенных кровью, с помощью анализа GeneXpert PCR

    при 1-2% загрязнении мокроты кровью.

    Десятипроцентное загрязнение мокроты кровью подавляло амплификацию ДНК.

    Четыреххлористый углерод и хлорид гуанидиния не способны разрушать ингибиторы ПЦР, присутствующие в крови.

    Кипячение мокроты при 95°C в течение 5 минут способно нейтрализовать ингибиторы ПЦР, присутствующие в цельной крови.

    Abstract

    В этом исследовании изучалась возможность обнаружения Mycobacterium tuberculosis (MTB) в окрашенной кровью мокроте с помощью анализа GeneXpert (Xpert MTB/Rif G4 v.5) использование соответствующих препаратов, лизирующих кровь (дистиллированная вода и дистиллированная вода/четыреххлористый углерод) и денатурирующих белок (хлористый гуанидиний и нагревание). У лиц, инфицированных MTB, собирали свободную от крови мокроту. Были подготовлены различные уровни мокроты с примесью крови (0%–50%), которые впоследствии были проанализированы с помощью анализатора GeneXpert. Было обнаружено, что GeneXpert воспроизводим при загрязнении крови менее 2%. Однако при загрязнении крови более 5 % результаты GeneXpert были ненадежными с абсолютным ингибированием ПЦР при 20 % загрязнения крови.Кипячение при 95°C в течение 5 минут позволило восстановить ДНК MTB в ранее неопределяемых уровнях, а также в 57% мокроты с пятнами крови пациентов с предыдущими отрицательными результатами GeneXpert.

    Ключевые слова

    Ключевые слова

    кровяные ключевые слова

    Genexpert Assay

    Genexpert Assay

    Genexpert Assay

    Renaturant крови

    Mycobacterium Tuberculosis

    Собещения: CCL 4

    CCL 4

    Carber Terachloride

    GDMCL

    Гуанидинием хлорида

    MED + RIF-R -среда

    ДНК МТБ (устойчивых к рифампицину)

    МТБ

    Mycobacterium tuberculosis

    MTBND

    Mycobacterium tuberculosis не обнаружено

    SPC

    Контроль обработки образцов

    Рекомендуемые статьиВсе права защищены.

    Проспективная многоцентровая прямая проверка транскриптомных биомаркеров туберкулеза легких в крови хозяина с помощью ПЦР в реальном времени

    Дизайн исследования и участники

    четыре южноафриканские когорты (дополнительный рисунок S1). Сначала мы перевели сигнатуры на платформу RT-qPCR и подтвердили эффективность в исследовании «случай-контроль» ВИЧ-неинфицированных и ВИЧ-инфицированных лиц с легочным туберкулезом и без него, когортное исследование перекрестного туберкулеза (CTBC) (дополнительная рис.С1а). Затем мы проспективно проверили сигнатурные характеристики у ВИЧ-неинфицированных добровольцев, участвующих в исследовании Correlate of Risk Targeted Intervention Study (CORTIS-01; ClinicalTrials.gov: NCT02735590; дополнительный рисунок S1b), и у ЛЖВ, включенных в обсервационное исследование CORTIS-HR (дополнительный рисунок. С1д). Наконец, мы оценили влияние микроорганизмов верхних дыхательных путей на транскриптомные сигнатуры у подгруппы ВИЧ-неинфицированных участников, прошедших скрининг для исследования CORTIS-01 (дополнительный рисунок S1c). Отчет об этом исследовании представлен в соответствии с рекомендациями инициативы «Стандарты отчетности по исследованиям диагностической точности» 22 .

    Этическое одобрение

    Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике исследований на людях факультета медицинских наук Кейптаунского университета (HREC 812/2017) и институциональными комитетами по этике исследований на людях в каждом участвующем центре. Письменное информированное согласие было получено от всех участников, и все эксперименты соответствовали принципам, изложенным в Хельсинкской декларации WMA и Белмонтском отчете Министерства здравоохранения и социальных служб США.

    Поперечная когорта ТБ (CTBC)

    Исследование случай-контроль CTBC было описано ранее 23 .Вкратце, взрослые в возрасте ≥18 лет с недавно диагностированным легочным ТБ, подтвержденным с помощью Xpert MTB/RIF мокроты (Cepheid, Саннивейл, Калифорния, США) и/или жидкой культуры микобактерий (индикаторная пробирка для роста микобактерий [MGIT], BACTEC, Beckton Dickinson, Franklin Lakes). , Нью-Джерси, США) были зарегистрированы в клиниках первичной медико-санитарной помощи в Вустере и Масифумелеле, Южная Африка. Здоровые бессимптомные контроли сообщества были набраны из тех же районов. ВИЧ-инфекцию диагностировали с помощью теста «Определить ВИЧ1/2» (Алере, Уолтем, Массачусетс, США).Все участники предоставили письменное информированное согласие, а протоколы были одобрены Комитетом по этике исследований на людях факультета медицинских наук Кейптаунского университета (HREC 126/2006 и 288/2008).

    Корреляция исследования вмешательства, ориентированного на риск (CORTIS)

    Клиническое исследование CORTIS-01 с участием ВИЧ-неинфицированных лиц и обсервационное исследование CORTIS-HR с участием ЛЖВ ранее были описаны 11,12 . Вкратце, здоровые взрослые добровольцы без клинического подозрения на ТБ, проживающие в пяти эндемичных по ТБ сообществах в Южной Африке (Дурбан, Клерксдорп, Равенсмид, Растенбург и Вустер), были набраны путем устных обращений, посещений домов и взаимодействие с неправительственными организациями. Набор не был нацелен на лиц с симптомами, обращающихся за медицинской помощью, или на другие группы высокого риска. Приемлемые участники в возрасте 18–59 лет не имели сопутствующих заболеваний (за исключением ВИЧ) и не имели подтвержденного заболевания туберкулезом или контакта с лицами, больными туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью, в течение предшествующих трех лет. Сигнатура RISK11 измерялась при зачислении, и для дифференциации RISK11-положительных участников от RISK11-отрицательных использовалось предварительно заданное пороговое значение в 60%. ВИЧ-неинфицированная популяция CORTIS-01 была обогащена за счет участников с высоким риском заболевания туберкулезом за счет регистрации всех подходящих RISK11-положительных лиц и рандомизации RISK11-отрицательных участников для включения или не включения в соотношении 1: 7–9.RISK11-позитивные участники были рандомизированы для получения TPT (еженедельно высокие дозы изониазида и рифапентина в течение 3 месяцев, 3HP) или без вмешательства; RISK11-отрицательные участники были рандомизированы в группу без вмешательства или исключены из исследования. В обсервационном исследовании CORTIS-HR ЛЖВ были включены независимо от статуса RISK11 и направлены на стандартную антиретровирусную и профилактическую терапию изониазидом.

    Все участники CORTIS предоставили два образца спонтанно отхаркиваемой мокроты, если это возможно, при включении в исследование и в конце визитов в рамках исследования.Визиты в конце исследования проводились на 15-м месяце наблюдения или в более ранний момент времени для исключенных участников. Оба образца, взятые при включении в исследование у неинфицированных ВИЧ участников (CORTIS-01), были протестированы на Mtb с использованием Xpert MTB/RIF, а у ВИЧ-инфицированных участников (CORTIS-HR) – с использованием Xpert MTB/RIF и культуры MGIT. Два образца, собранные в конце исследовательского визита, были протестированы с использованием Xpert MTB/RIF или Xpert Ultra (Cepheid) и культуры MGIT. Кроме того, исследования на ТБ, вызванные симптомами (два образца мокроты; один для Xpert MTB/RIF и один для культуры MGIT) проводились во время шести плановых визитов в рамках исследования в течение 15 месяцев наблюдения. Симптомы туберкулеза включали, по крайней мере, один из следующих симптомов: постоянный необъяснимый кашель, ночную потливость, лихорадку или потерю веса в течение 2 недель или более или любое кровохарканье. Участники, у которых был диагностирован микробиологически подтвержденный туберкулез, были исключены из исследования и направлены на лечение.

    Когорта респираторных патобионтов

    Когорта респираторных патобионтов, подмножество участников, отобранных для участия в исследовании CORTIS-01 в центре Вустера, ранее была описана 24 .Вкратце, ВИЧ-неинфицированные участники последовательно включались в это подисследование независимо от участия в тесте CORTIS-01 или признаков и симптомов инфекций верхних дыхательных путей. Парные мазки из носоглотки и ротоглотки (FLOQSwabs, Copan Diagnostics, Мурриета, Калифорния, США) собирали и хранили в буфере Primestore (Longhorn Vaccines and Diagnostics, Сан-Антонио, Техас, США) при -80 °C, а также вирусные и бактериальные нуклеиновые кислоты. позже экстрагировали (Qiasymphony Virus/Bacteria Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany) и количественно определяли с использованием набора для мультиплексного анализа RT-qPCR (Respiratory Pathogens 33 Kit, Fast Track Diagnostics, Люксембург) на платформе светоциклера CFX96 Touch System (Bio-Rad). , Геркулес, Калифорния, США), в соответствии с инструкциями производителя.Участники, включенные в исследование CORTIS-01, были обследованы на ТБ на исходном уровне; те, кто был включен только в когорту респираторных патобионтов, не исследовались на туберкулез (дополнительный рисунок S1c). Все участники предоставили письменное информированное согласие, а протоколы были одобрены Комитетом по этике исследований на людях факультета медицинских наук Кейптаунского университета (HREC 327/2017).

    Сбор образцов крови и экстракция РНК

    Цельная венозная кровь была собрана в пробирки PAXgene (PreAnalytiX, Hombrechtikon, Швейцария) при включении во все когорты, заморожена при температуре -20 °C и отправлена ​​в Южноафриканскую инициативу по противотуберкулезной вакцине (SATVI) Кейптаунская лаборатория. Для исследования CTBC РНК выделяли вручную с помощью набора РНК крови PAXgene (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя, хранили при температуре -80 °C, а затем использовали для транскриптомного анализа. Для других когорт РНК экстрагировали с использованием высокопроизводительной, стандартизированной и воспроизводимой полностью автоматизированной процедуры на роботизированной платформе Freedom EVO 150 (Tecan, Маннедорф, Швейцария) с набором Maxwell SimplyRNA (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Одну аликвоту РНК сразу же использовали для синтеза кДНК и измерения сигнатуры RISK11, а вторую аликвоту хранили при -80°C и позже использовали для измерения панели экономных транскриптомных сигнатур.

    Измерение транскриптомных сигнатур ТБ

    Мы перевели измерения восьми экономных транскриптомных сигнатур ТБ — Francisco2 25 , Maertzdorf4 26 (также известный как DIAG4), Penn-Nicholson6 (также известный как RISK6) 409099 23909 также известный как RISK4) 27 , Roe1 28 (только BATF2), Roe3 29 , Sweeney3 30 и Thompson5 31 (также известный как RESPONSE5) — с использованием платформы microRT-qManic. -зондовые анализы для количественной оценки транскриптов и оценки сигнатур были рассчитаны, как сообщалось ранее (таблицы S1–6 в дополнительных данных 1).Подпись Herberg2 32 , предназначенная для различения вирусной и бактериальной инфекции у детей с лихорадкой, также была включена в качестве потенциального различителя между вирусной и микобактериальной инфекцией в когорте респираторных патобионтов. Сигнатуры были прагматически отобраны в 2017 году для включения в эту непосредственную проверку наряду с RISK11 на основе наличия подтвержденных данных о производительности, количества транскриптов (шесть или меньше) и доступности целевых последовательностей для индивидуального дизайна праймер-зонд или предварительно разработанных Анализ TaqMan.

    После синтеза кДНК с обратной транскриптазой EpiScript (Lucigen, Миддлтон, Висконсин, США) представляющие интерес гены (таблицы S2–S3 в дополнительных данных 1) были предварительно амплифицированы с использованием пулов анализов праймер-зонд TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham , Массачусетс, США) и экспрессии генов (порог сырого цикла, Ct), количественно оцененной с помощью микрожидкостной мультиплексной RT-qPCR с использованием Fluidigm (Сан-Франциско, Калифорния, США) 96,96 (96 образцов, мультиплексированных с 96 анализами праймер-зонд) или 192,24 (192 образцы, мультиплексированные с помощью 24 анализов праймер-зонд) чипы Gene Expression на приборе BioMark HD (Fluidigm).

    Дизайн панели анализа праймер-зонд RT-qPCR

    Транскриптомная сигнатура RISK11 была измерена, как описано ранее, с помощью предварительно квалифицированных анализов праймер-зонд экспрессии гена TaqMan 9,10,11 . Показатели сигнатур Roe1 и Roe3 были рассчитаны на основе тех же панелей анализа экспрессии генов Fluidigm 96.96, что и сигнатура RISK11 (таблица S2 в дополнительных данных 1), путем вычитания среднего геометрического необработанных значений Ct четырех генов домашнего хозяйства из среднего необработанного Ct генов. представляющий интерес (таблица S1 в дополнительных данных 1).

    Панель из 24 анализов праймеров-зондов экспрессии гена TaqMan для других семи сигнатур (таблица S3 в дополнительных данных 1) — Francisco2, Herberg2, Maertzdorf4, Penn-Nicholson6 (таблица S4 в дополнительных данных 1), Suliman4 (таблица S5 в дополнительных данных 1). Дополнительные данные 1), Sweeney3 и Thompson5 (таблица S6 в дополнительных данных 1) — были запущены параллельно на чипах для экспрессии генов Fluidigm 192. 24. Анализы праймер-зонд были квалифицированы для обеспечения эффективной амплификации, линейности и возможности мультиплексирования с использованием методов, аналогичных описанным Dominguez et al. 33 . Вкратце, мы использовали пять предварительно амплифицированных образцов кДНК различной концентрации с 12-точечной серией двукратных разведений. Каждая из пяти серий разведений была разделена на восемь сегментов пяти последовательных разведений и проанализирована на линейность итеративным образом с использованием линейной регрессии наименьших квадратов между логарифмом концентрации кДНК и циклом амплификации (Et; 40 – Ct). Анализ прошел квалификацию, если хотя бы один сегмент в серии разведений соответствовал следующим трем критериям: (1) сильная корреляция (Pearson r 2  ≥ 0.99), (2) линейный наклон (коэффициент регрессии между 3,1–3,6) и (3) эффективное усиление ([10 1/наклон – 1] = 90–110%). Все новые анализы праймер-зонд прошли квалификацию с помощью эффективной линейной амплификации (таблица S3 в дополнительных данных 1).

    Контроль качества и анализ данных

    Чипы экспрессии генов Fluidigm 192.24 были проанализированы с использованием закрытого скрипта R (bitbucket.org/satvi/sixs) с фильтрами контроля качества, которые оценивали целостность и воспроизводимость каждого чипа.Для извлечения значений Ct применялись следующие параметры: линейная (производная) коррекция базовой линии, пороговое значение качества 0,3 и автоматический (глобальный) метод порогового значения Ct с использованием программного обеспечения Fluidigm Biomark версии 4.5.1. Чипы с заметным отклонением значений Ct анализа праймер-зонд образца внутреннего положительного контроля или сигнатурной оценки RISK6 от исторических анализов, с обнаружением в контроле без матрицы (воды) или контроле без обратной транскриптазы (для обнаружения амплификации геномной ДНК) в повторялись праймер-зонды, охватывающие экзон-экзонные соединения, или с более чем 20% неудачных реакций для конкретного анализа праймер-зонд.Отдельные образцы с более чем 20% неудачных реакций праймер-зонд классифицировались как неудавшиеся, и сигнатурные баллы не рассчитывались. Если менее 20 % реакций праймер-зонд были неудачными для отдельного образца, по возможности рассчитывались баллы сигнатур, и сигнатуры с отсутствующими исходными значениями Ct праймер-зонд считались неудачными для этого образца. Образцы и анализы праймер-зонд проводились в синглетном режиме, и предполагалось, что неудачные результаты сигнатуры для отдельных образцов следуют случайному распределению, поэтому не повторяются и исключаются из анализа.

    Конечные точки

    Для исследования CTBC и подисследования респираторных патогенов заболевание ТБ определялось по одному положительному образцу мокроты на Mtb либо с помощью Xpert MTB/RIF, либо с помощью жидкой культуры при включении. Дополнительными первичными конечными точками, указанными в протоколе, в исследованиях CORTIS были исходное распространенное заболевание ТБ и впервые выявленное заболевание в течение 15 месяцев наблюдения, подтвержденное положительным посевом Xpert MTB/RIF, Xpert Ultra или MGIT в двух или более отдельных образцах мокроты, собранных в течение любого 30-дневный период. Вторичной конечной точкой было микробиологически подтвержденное заболевание туберкулезом по крайней мере в одном образце мокроты. Все положительные результаты трассировки Xpert Ultra были исключены из анализа из-за риска ложноположительных результатов.

    Статистика и воспроизводимость

    Все первичные и вторичные анализы для дополнительных исследований CORTIS-01 и CORTIS-HR были предварительно указаны в плане статистического анализа, но не в исходных протоколах исходного исследования. Анализ дополнительных исследований CTBC и Respiratory Pathobionts носил предварительный характер.Все статистические анализы были выполнены в R (Бостон, Массачусетс, США), версия 3.6.1. Размеры выборки для этого дополнительного исследования не были заранее определены, а были основаны на совокупном наборе участников родительских исследований CTBC и CORTIS. Эффективность сигнатур оценивалась по их способности диагностировать распространенное заболевание ТБ на исходном уровне и прогнозировать прогрессирование до вновь возникшего заболевания ТБ в течение 15 месяцев наблюдения. Для всех анализов ВИЧ-инфицированные (CORTIS-HR) и ВИЧ-неинфицированные (CORTIS-01) участники учитывались независимо.Диагностическая эффективность на исходном уровне оценивалась у всех участников, включенных в исследования CORTIS, с доступными образцами PAXgene. После этого участники, соответствующие определению конечной точки первичной распространенности ТБ, участники, которые не посещали последующие визиты для последующего наблюдения, и участники, рандомизированные в группу 3HP с положительным результатом RISK11 (только CORTIS-01), были исключены из анализа прогностической эффективности первичной конечной точки. За участниками наблюдали до 15 месяцев; те, кто прекратил наблюдение до 15 месяцев и не соответствовал определению первичной конечной точки, подвергались цензуре во время их последнего посещения исследования или последнего сбора отрицательного образца мокроты, но включались в прогностический анализ.

    Из-за увеличения количества RISK11-позитивных лиц в популяции, включенной в CORTIS-01, для анализа характеристик сигнатуры требовалось взвешивание участников для получения оценок, применимых к скрининговой популяции, что фактически увеличивало вес RISK11-отрицательных участников в анализах CORTIS-01 (т. е. обратная вероятность взвешивание). Зачисление в исследование CORTIS-HR и подисследование респираторных патобионтов не зависело от статуса RISK11; анализы для этих когорт не взвешиваются.

    Для оценки эффективности диагностики в исследованиях CTBC, CORTIS-HR и Respiratory Pathobionts область под кривой рабочей характеристики приемника (ROC) (AUC) была создана с использованием пакета pROC 34 в R.Показатели сигнатуры (AUC) между ВИЧ-инфицированными и ВИЧ-неинфицированными участниками исследования CTBC сравнивали с использованием методов, описанных DeLong et al. 35 . Показатели прогностической эффективности в течение 15 месяцев наблюдения в CORTIS-HR были рассчитаны с использованием непараметрических методов анализа зависимой от времени ROC-кривой на основе данных о выживаемости с использованием функции R survAM.estimate в пакете survAccuracyMeasures 36 в R. Binary взвешенный ROC-анализ был выполнен в когорте CORTIS-01 для оценки как диагностических, так и прогностических показателей. В ретроспективном анализе прогностическая эффективность в CORTIS-01 была качественно сравнена между 6, 12 и 15 месяцами наблюдения для первичной конечной точки с использованием идентичных методов.

    Не было предопределенных пороговых значений для экономичных подписей; пороговые значения оптимальной сигнатуры были рассчитаны с использованием минимального евклидова расстояния до 100% чувствительности и специфичности, т. е. точки, ближайшей к левому верхнему углу ROC-кривой, рассчитанной для каждой точки отсечения ( c ) следующим образом: √[(1 − Чувствительность ( c ) ) 2  + (1 − Специфичность ( c ) ) 2 ] 37 .Сигнатурная диагностическая и прогностическая точность также сравнивалась с минимальной и оптимальной TPP ВОЗ для сортировки ТБ или теста направления к специалистам 20 и минимальной и оптимальной TPP ВОЗ для теста на начальный ТБ для прогнозирования прогрессирования заболевания ТБ 21 , соответственно.

    Чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) для каждого порога рассчитывались с использованием бинарных индикаторов конечных точек и стандартных формул. Оценки PPV и NPV рассчитывались на основе наблюдаемой заболеваемости туберкулезом среди участников исследования.95% ДИ для оценок диагностических и прогностических характеристик были рассчитаны с помощью непараметрической процентильной начальной загрузки с 10 000 повторных выборок 38 . Выборка начальной загрузки была стратифицирована по статусу RISK11 в когорте CORTIS-01, но не стратифицирована в когортах CTBC, CORTIS-HR или Respiratory Pathobionts.

    Распределение показателей подписи было описано с использованием медианы и интерквартильного диапазона. Различия между группами были рассчитаны с использованием теста Манна-Уитни U и скорректированы для множественных сравнений с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга 39 . Ранговый коэффициент Спирмена использовался для сообщения о корреляции между оценками подписи; в корреляционные матрицы включались только образцы, прошедшие все анализы; и подписи Roe1 и Roe3 были умножены на -1, чтобы получить положительную корреляцию для всех подписей. Альфа <0,05 считалась значимой во всех анализах.

    Ослепление

    Показатели транскриптомной сигнатуры были измерены лабораторным персоналом, который не знал о статусе ТБ участников. Участники и сотрудники исследования, ответственные за скрининг на ТБ, не были осведомлены об оценках транскриптомных сигнатур.Группа статистического анализа имела доступ к клиническим и демографическим данным (включая статус ТБ), но не знала оценок сигнатур, чтобы обеспечить очистку данных и подготовку сценариев анализа до блокировки базы данных. Сигнатурные баллы и результаты микробиологического исследования ТБ хранились в разных файлах, которые были интегрированы только после очистки и блокировки базы данных исследования, а распределение групп в CORTIS-01 было раскрыто.

    Роль источников финансирования

    Спонсоры этого подисследования не участвовали в разработке протокола, дизайне исследования, сборе данных, анализе данных, интерпретации данных или написании отчета.

    (PDF) Полимеразная цепная реакция периферической крови в диагностике туберкулеза легких

    J Ayub Med Coll Abbottabad 2006;18(2)

    ВЫВОДЫ крупный рогатый скот Вероятность переноса загрязнения

    минимальна, потому что мы повторно тестировали положительные образцы, и

    регулярно включали положительные и отрицательные контроли.

    Отдельные помещения были выделены для процесса выделения ДНК,

    , амплификации и электрофореза, чтобы исключить

    проблемы загрязнения.

    Из-за низкой чувствительности; отрицательный результат ПЦР крови

    не исключает туберкулез легких. Однако этот тест

    может быть полезен в случаях, когда образцы из очага инфекции

    недоступны.

    ССЫЛКИ

    1. Soini H, Musser JM. Молекулярная диагностика микобактерий.

    Клин Хим 2001; 47: 809-14.

    При совместном рассмотрении как положительных, так и отрицательных случаев мазка

    и

    ПЦР-анализ правильно идентифицировал

    12 из 60 положительных случаев посева. Он также определил 2

    случаев с отрицательным посевом как положительные. Сорок восемь пациентов

    с отрицательными результатами ПЦР имели положительные культуры мокроты

    на Mycobaterium tuberculosis, мы подсчитали их как

    ложноотрицательных результатов. Высокие ложноотрицательные результаты могут быть

    из-за низкого уровня инфекции или ранних стадий заболевания.

    Также возможно, что некоторые из этих пациентов могут быть

    инфицированы штаммами Mycobaterium tuberculosis, которые

    не несут последовательности вставки IS6110. Такие штаммы

    встречаются редко, но существуют.

    18

    Кроме того М.

    туберкулез находится в макрофагах в крови. Мы

    провели ПЦР с использованием цельной крови. Концентрирование

    лейкоцитов с использованием лейкоцитарной пленки в качестве образца

    вместо цельной крови увеличивает выход такой

    ПЦР.

    2. Хан М.А. Туберкулез: необходимо активизировать свою программу контроля в

    Пакистане. J Coll Physicians Surg Pak 1996; 6: 3.

    3. Мажар А.Ю., Сарвар М.С.А., Матин А. Исследование туберкулиновой пробы

    после вакцинации БЦЖ у детей. J Coll Physicians Surg

    Pak 1995; 5: 64-6.

    4. Всемирная организация здравоохранения, Доклад ВОЗ об эпидемии туберкулеза

    , Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1997.

    5. Saeed W, Ahmed J, Naseem A.Эндоронхиальный туберкулез: клинические и

    диагностические аспекты. Пак вооруженных сил Med J 2002; 52: 154-8.

    6. Батт Т., Карамат К.А., Ахмад Р.Н., Махмуд А. Успехи в

    диагностике туберкулеза. Пак Дж. Патол, 2001 г.; 12 (1): 1-3.

    7. Пфайффер Г.Э. Амплификация нуклеиновых кислот для диагностики микобактерий

    . J Infect Dis 1999; 39: 21-6.

    8. Грейндж Дж.М. Микобатериум. In: Greenwood D, Slack RCB,

    Peutherer F, редакторы. Медицинская микробиология.Справочник по

    микробиологическим инфекциям: патогенез, иммунитет, лабораторная

    диагностика и контроль. 16-е изд. Эдинбург: Черчилль

    Ливингстон, 2002: 200-13.

    9. Ахмед Н., Моханти А.К., Мухопадхьяй У., Батиш В.К.,

    Гровер С. Быстрое выявление микобатерий

    туберкулеза на основе ПЦР в крови у иммунокомпетентных пациентов с

    туберкулезом легких. Дж. Клин Микробиол, 1998 г.; 36: 3094-5.

    Положительные и отрицательные прогностические значения

    варьируются в зависимости от распространенности заболевания в данном

    сообществе.При очень низкой распространенности

    туберкулеза в популяции тест будет

    иметь хорошую отрицательную прогностическую ценность для исключения заболевания

    , в то время как положительный результат будет менее полезным. В отличие от

    , при использовании в условиях высокой распространенности высокие

    положительные прогностические значения теста сделают

    положительный результат теста полезным для усиления клинического

    подозрения, но отрицательный результат будет менее полезным.

    Это верно и для нашего исследования; положительная

    прогностическая ценность 85,71% делает этот тест очень полезным

    в наших условиях высокой распространенности.

    10. Роберт Г.Д., Конеман Э.В., Ким Ю.К. Микобактерии. In:

    Balows A, Hausler Jr. WJ, Herrmann Kl, Isenburg HD,

    Shadomy HJ, редакторы. Руководство по клинической микробиологии. 5-е изд.

    Вашингтон, округ Колумбия: Американское общество микробиологии, 1991:

    304-39.

    11. Bennedsen J, Thomsen VO, Pfyffer GE, Funke G, Feldmann

    K, Beneke A, et al.Полезность ПЦР в диагностике легочного

    туберкулеза. Дж. Клин Микробиал, 1996; 34: 1407-11.

    12. Сиддики Ш.Х. Противотуберкулезная система BACTEC. Руководство по изделию и процедуре

    . Редакция B. Becton Dickinson Diagnostic Instruments

    Systems, Towson, Md. USA. 1989.

    13. Сиддики Ш.Х. Тест BACTEC NAP. В: Isenburg HD, редактор.

    Справочник по процедурам клинической микробиологии. Том 1.

    Вашингтон, округ Колумбия: Американское общество микробиологии, 1992:

    3.13.1-3.13.4.

    Значительное число (34/96) подозрительных

    случаев оказались отрицательными как по результатам посева, так и по

    ПЦР, несмотря на установленные нами строгие критерии клинического

    подозрения.

    могли быть причиной этого по двум причинам. Во-первых, большой

    процент населения является туберкулинположительным из-за латентной

    латентной туберкулезной инфекции. Другая возможность может состоять в том, что

    очевидные радиологические данные были перенесены в прошлом, излечены от

    туберкулеза, а люди на самом деле

    не болели туберкулезом.Наконец, возможность

    противомикробных препаратов не могла быть рассмотрена, потому что такие

    пациентов уже были исключены из исследования.

    14. Батт Т., Ахмад Р.Н., Казми С.Ю., Афзал Р.К., Махмуд А. Ан до

    Дата диагностики туберкулеза. J Coll Physicians Surg

    Pak 2003; 13: 728-34.

    15. Bennedsen J, Thomsen VO, Pfyffer GE, Funke G, Feldmann

    K, Beneke A, et al. Полезность ПЦР в диагностике легочного

    туберкулеза.Дж. Клин Микробиал, 1996; 34: 1407-11.

    16. Pottumarthy S, Wells VC, Morris AJ. Сравнение семи

    тестов для серологической диагностики туберкулеза. J Clin Microbiol

    2000; 38: 2227-31.

    17. Condos R, mcClune A, Room WN, Schluger NW. Анализ периферической крови

    ПЦР для выявления пациентов с активным туберкулезом легких

    . Ланцет 1996; 347: 1082-5.

    18. Малик Н., Карамат К.А., Батт Т., Аббаси С., Усман Дж. Распространенность

    и характер лекарственной чувствительности типичных и атипичных

    микобактерий в Равалпинди/Исламабад.Пак Дж. Патол, 1998 г.; 9:

    4-8

    _____________________________________________________________________________________________________________________________

    Адрес для переписки:

    Доктор Мумтаз Ахмад Хан, отдел микробиологии, Afip, Rawalpindi, 051-57, Факс: 051 9271247

    Email: [email protected] , [email protected]

    28

    Диагностика туберкулеза легких с помощью сиквенс-специфической очистки бесклеточной ДНК мочи трудно обнаружить из-за короткой длины (

    <100 п.н.) и низкой концентрации ТБ-специфических фрагментов.Мы стремились улучшить диагностическую чувствительность вкДНК мочи туберкулеза за счет увеличения извлечения коротких фрагментов во время подготовки образцов. Мы разработали высокочувствительный метод очистки, специфичный для последовательности, в котором используются гибридизационные зонды, иммобилизованные на магнитных шариках, для захвата короткой вкДНК ТБ (50 п.н.) со средней эффективностью 91,8%. В сочетании с ПЦР с короткой мишенью предел обнаружения анализа составлял ≤5 копий вкДНК в 10 мл мочи. В клиническом когортном исследовании в Южной Африке наш анализ вкДНК мочи показал 83.7% чувствительность (95% ДИ: 71,0–91,5%) и 100% специфичность (95% ДИ: 86,2–100%) для диагностики активного легочного ТБ при использовании мокроты Xpert MTB/RIF в качестве эталонного стандарта. Обнаруженная концентрация вкДНК составляла 0,14–2804 копий/мл (медиана 14,6 копий/мл) и обратно коррелировала с количеством CD4 и количеством дней до положительного результата посева. Чувствительность была незначительно выше у ВИЧ-позитивных (88,2%) по сравнению с ВИЧ-отрицательными пациентами (73,3%) и не зависела от количества CD4. Чувствительность оставалась высокой при отрицательном мазке мокроты (76.0%) и ЛАМ-отрицательных по моче (76,5%). Благодаря улучшенной подготовке проб вкДНК мочи является жизнеспособным биомаркером для диагностики ТБ. Наш анализ имеет самую высокую на сегодняшний день точность из всех тестов вкДНК мочи на туберкулез и может обеспечить быструю диагностику туберкулеза без использования мокроты среди ключевых групп пациентов с недостаточным уровнем обслуживания.

    ВВЕДЕНИЕ

    Туберкулез (ТБ) является ведущей причиной глобальной смертности от инфекционных заболеваний: по оценкам, в 2019 г. было зарегистрировано 10 миллионов случаев заболевания и 1,4 миллиона случаев смерти (1).По оценкам, 30% случаев ТБ остаются недиагностированными или не регистрируются, отчасти из-за ограничений в быстрой диагностике (1). Текущие тесты на ТБ основаны на образцах мокроты, которые трудно собрать у людей, живущих с ВИЧ, тяжелобольных пациентов и детей, и они могут не выявить внелегочный ТБ (ВЛТБ). Экспресс-тесты на основе мокроты ( e . g ., микроскопия мазка, Xpert MTB/RIF) также имеют более низкую чувствительность в тех же недостаточно обслуживаемых группах пациентов, которые чаще болеют олигобациллярным ТБ (2–4).На консенсусном совещании ВОЗ экспресс-тест без использования мокроты был определен как один из наиболее приоритетных целевых продуктов для диагностики ТБ (5).

    Моча является привлекательным альтернативным образцом для диагностики ТБ, поскольку ее легко собрать и риск передачи инфекции минимален. У пациентов с активным туберкулезом фрагменты внеклеточной ДНК (вкДНК) выделяются в кровь, часть которых фильтруется через почки и выводится с мочой в виде трансренальной вкДНК (6–8). Туберкулезная вкДНК была обнаружена в моче как ВИЧ-отрицательных, так и ВИЧ-положительных пациентов с легочным ТБ, но диагностическая чувствительность была непостоянной (0–79%) (8–13).Высокая изменчивость методологии и последующая эффективность исследований ограничивали понимание вкДНК мочи туберкулеза и препятствовали ее клиническому внедрению (14, 15).

    ВкДНК мочи является сложной мишенью из-за короткой длины и низкой концентрации ТБ-специфических фрагментов. В то время как вкДНК плазмы имеет максимальную длину фрагмента 167 п.н., вкДНК мочи более фрагментирована (7, 16, 17). Недавно новые методы подготовки библиотек секвенирования показали, что очень короткие, ранее неопределяемые фрагменты составляют большую часть вкДНК, чем предполагалось ранее (18–21).Большинство фрагментов внДНК мочи составляют менее 100 п.н. с пиковой длиной фрагмента в пределах 30-110 п.н. (16, 17, 21, 22). Хотя длина фрагмента вкДНК ТБ еще не охарактеризована, ожидается, что бактериальная вкДНК будет особенно фрагментирована (пик <60 п.н.), поскольку она менее защищена ДНК-ассоциированными белками (21, 23).

    Чувствительность от низкой до умеренной, о которой сообщалось в предыдущих исследованиях вкДНК мочи на туберкулез, вероятно, частично связана с методами подготовки образцов и/или амплификации, которые не являются оптимальными для короткой вкДНК мочи (6, 14).Мы предположили, что можем повысить чувствительность диагностики туберкулеза на основе вкДНК, улучшив восстановление короткой вкДНК на этапе выделения ДНК. Мы разработали высокочувствительный метод очистки, специфичный для последовательности, в котором используются ДНК-зонды, иммобилизованные на магнитных шариках, для выделения специфической для туберкулеза вкДНК посредством гибридизации. Комбинируя специфичную для последовательности очистку с ПЦР с короткой мишенью, мы можем надежно обнаружить ≤5 копий короткой (50 п.н.) вкДНК в 10 мл мочи (24).

    Здесь мы впервые определили диагностическую точность нашего анализа вкДНК туберкулеза в клинических образцах мочи.Наши результаты демонстрируют преимущества нашего подхода к очистке, специфичной для последовательности, вносят вклад в растущее количество доказательств, необходимых для установления внДНК мочи в качестве биомаркера туберкулеза, и послужат основой для будущих клинических исследований в расширенных популяциях ( e . g . , дети, лица с ВЛТБ).

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Дизайн исследования и участники

    Участники были зарегистрированы в больнице Эдендейл в Питермарицбурге, Южная Африка (одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований Университета Квазулу-Натал, № BE475/18).Были набраны взрослые (≥18 лет), соответствующие определению случая активного легочного ТБ. В качестве контрольной группы были включены взрослые с исключенным диагнозом ТБ и без подозрения на активную форму ТБ. Отдельная контрольная группа здоровых людей была зарегистрирована в Вашингтонском университете, Сиэтл, США (одобрено Институциональным наблюдательным советом Вашингтонского университета, № 48840). Участниками были взрослые (≥18 лет) с низким риском заражения ТБ, что определялось рождением в стране с низким риском ТБ и отсутствием в анамнезе диагноза латентного ТБ, лечения активного или латентного ТБ или проживания с человеком с активным ТБ.Все участники дали письменное информированное согласие. Образцы были деидентифицированы перед тестированием в Вашингтонском университете, где проводилось это исследование.

    Определения случаев

    ТБ-положительные участники (Южная Африка) определялись как лица с положительным результатом теста Xpert MTB/RIF (Cepheid, Саннивейл, Калифорния, США) в течение 5 дней после регистрации и наличием одного или нескольких симптомов ТБ (лихорадка, ночная потливость, кашель и потеря веса). Пациенты с >72 часов противотуберкулезного лечения были исключены.У ТБ-отрицательных участников (Южная Африка) был первичный диагноз, отличный от ТБ, и не было клинических подозрений на ТБ. Здоровые контроли (США) были набраны на добровольной основе и не обращались за медицинской помощью.

    Клинические данные, анализ мокроты и липоарабиноманнан мочи (LAM)

    Клинические данные были собраны для всех участников, зарегистрированных в Южной Африке. К ним относятся дата рождения, пол, масса тела, рост, самоотчет истории ТБ, наличие симптомов ТБ (лихорадка, ночная потливость, кашель, потеря веса), продолжительность лечения ТБ, результат теста на ВИЧ и количество клеток CD4 + ( только для участников, живущих с ВИЧ).Отхаркиваемая мокрота была отправлена ​​в Южно-Африканскую национальную лабораторную систему здравоохранения (NHLS) для подтверждения посева твердых и жидких микобактерий и микроскопии мазка КУМ. Посев микобактерий проводили в провинциальной справочной лаборатории NHLS по туберкулезу с использованием твердой агаровой среды Миддлбрук 7 ч 21 мин и жидкой пробирки для индикатора роста микобактерий BACTEC (MGIT) 960 (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Культуры инкубировали до 42 дней. Планшеты с культурами считывали через 3 и 6 недель, и М.tuberculosis был идентифицирован из твердых или жидких культур с использованием ниацина и нитрата. Участники считались культурально-позитивными с ростом либо из твердой, либо из жидкой культуры. Микроскопия мазка была выполнена в лаборатории NHLS в больнице Эдендейл на обеззараженных образцах с использованием красителей Циля-Нильсона и аурамина и считалась положительной, если одно из окрашиваний выявляло КУМ. Анализ мочи проводили с использованием Alere Definition TB LAM Ag (Abbott Laboratories, Чикаго, США). Сбор клинических данных, исследование мокроты и LAM-тестирование мочи не проводились для контрольной группы здоровых людей, зарегистрированных в США.

    Сбор и хранение мочи для анализа вкДНК

    Каждому участнику было предложено предоставить образец мочи при регистрации. Как можно скорее после сбора мочу смешивали с ЭДТА и трис-HCl pH 7,5 до конечных концентраций 25 мМ и 10 мМ соответственно. Моча хранилась в пробирках ДНК LoBind (Eppendorf, Гамбург, Германия) при температуре -20°C в месте сбора до отправки. Образцы были отправлены на сухом льду в Вашингтонский университет, где они хранились при температуре -80°C до проведения анализа.Непосредственно перед анализом мочу оттаивали при 37°С и центрифугировали при 8000 g в течение 5 минут для осаждения клеточного дебриса. Бесклеточный супернатант мочи переносили в новые пробирки LoBind для ДНК объемом 15 мл (Eppendorf) и характеризовали с помощью полосок с реагентами для мочи Fisherbrand 10-SG (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) для измерения уровней глюкозы, билирубина, кетонов, удельный вес, кровь, рН, белок, уробилиноген, нитриты и лейкоциты.

    Очистка вкДНК ТБ из гибридизационного захвата последовательности мочи

    Моча (10 мл) была проанализирована в трех повторах для каждого участника, причем отдельные повторы обрабатывались в разные дни.ВкДНК мочи, специфичную для ТБ, была извлечена с использованием нашего собственного метода гибридизации, специфичного для последовательности, как описано ранее (24). Мы опубликовали подробный, готовый к использованию протокол на http://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bep4jdqw.

    Иммобилизация зондов захвата на магнитных шариках

    Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher) трижды промывали равным объемом промывочного буфера с высоким содержанием соли (1M NaCl, 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 0,05% (об./об.). ) Tween-20) и ресуспендировали в равном объеме промывочного буфера с высоким содержанием соли.Двойные биотинилированные зонды захвата BP1 и BP2 (таблица 1), нацеленные на противоположные нити двухцепочечной области-мишени IS 6110 , были предварительно смешаны в ТЕ-буфере с низким содержанием ЭДТА до концентрации 50 мкМ каждый. К гранулам добавляли 25 пмоль каждого зонда (0,5 мкл смеси зондов) на 50 мкл эквивалента гранул. Гранулы немедленно встряхивали и вращали в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать захватывающие зонды на гранулах. Гранулы промывали три раза равным объемом промывочного буфера с высоким содержанием соли и ресуспендировали в равном объеме промывочного буфера с высоким содержанием соли.

    Таблица 1: Зонд, праймер и целевые последовательности. a
    Захват вкДНК туберкулеза, специфичный для последовательности

    2,5 мл 5 М NaCl (конечная концентрация 1 М), 127 мкл 10% (об./об.) Tween-20 (конечная концентрация 0,1%) и 50 мкл подготовленные гранулы добавляли к каждому образцу мочи объемом 10 мл и осторожно перемешивали. Образцы денатурировали в термоблоке, установленном на 120°C, в течение 15 минут, так что температура мочи достигала >90°C. вкДНК ТБ гибридизовали для захвата зондов вращением при комнатной температуре в течение 30 минут.

    Промывка для удаления мочи и нецелевой ДНК

    Образцы центрифугировали в течение 5 минут при 5000g для осаждения гранул. Весь супернатант, кроме 1 мл, удаляли и выбрасывали. Гранулы ресуспендировали в оставшемся супернатанте и переносили в пробирки LoBind для ДНК объемом 1,5 мл (Eppendorf). Пробирки помещали на магнитную стойку Invitrogen Dynamag-2 (Thermo Fisher) на 1 минуту и ​​удаляли оставшийся супернатант. Гранулы дважды промывали 1 мл промывочного буфера с высоким содержанием соли и один раз 1 мл промывочного буфера с низким содержанием соли (15 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8.0). Для каждой промывки пробирки переворачивали 10–20 раз или до тех пор, пока на стенках пробирок не оставалось агрегата шариков, кратковременно центрифугировали и помещали на магнитную стойку на 1 минуту перед удалением промывочного буфера. После последней стадии промывки шарики центрифугировали и удаляли любой остаточный буфер.

    Элюирование очищенной вкДНК ТБ

    Очищенную вкДНК ТБ элюировали, используя 20 мкл свежеприготовленного 20 мМ NaOH. Шарики смешивали с NaOH путем встряхивания, кратковременно центрифугировали и помещали на магнитную стойку.Элюат переносили непосредственно в лунки для ПЦР и частично нейтрализовали 3,5 мкл 100 мМ HCl.

    Амплификация вкДНК ТБ мочи с использованием ПЦР с короткой мишенью

    Весь объем (~24 мкл) каждого образца мочи объемом 10 мл анализировали в одной лунке ПЦР. Каждые 50 мкл реакционной смеси содержали 1,25 ед. ДНК-полимеразы горячего старта OneTaq (New England Biolabs [NEB, Ipswitch, MA, USA]), 1X реакционный буфер OneTaq GC (NEB; 80 мМ Tris-SO 4 , 20 мМ (NH 4). ) 2 SO 4 , 2 мМ MgSO 4 , 5% глицерин, 5% диметилсульфоксид, 0.06% IGEPAL CA-630 и 0,05% Tween-20, pH 9,2), 0,8 мМ dNTP (NEB), 0,4X EvaGreen (Biotium, Fremont, CA, США), 200 нМ прямого праймера (таблица 1) и 200 мМ обратный праймер (табл. 1). КПЦР проводили в системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) с использованием начального периода инкубации 94°C в течение 3 минут, с последующими 50 циклами амплификации при 94°C в течение 30 минут. секунд, 64°C в течение 30 секунд и 68°C в течение 1 минуты. Значения цикла количественного определения (C q ) определяли с использованием программного обеспечения CFX Maestro версии 1.1 (Bio-Rad Laboratories) при пороге 500 RFU, и восстановленные копии рассчитывали с использованием стандартной кривой для каждой ПЦР. Продукты ПЦР подтверждали анализом кривых плавления после амплификации от 65°C до 95°C с шагом 0,5°C каждые 5 секунд.

    Критерии для положительных образцов

    Критерии для положительных образцов были установлены перед анализом, и оператор анализа не знал о клиническом состоянии образцов до тех пор, пока обработка не была завершена и не были сделаны вызовы образцов.Отдельные реплики считались положительными, если было обнаружено ≥1 одноцепочечной ДНК-копии вкДНК ТБ и температура плавления (T 90×110 m 90×111 ) соответствовала температуре ожидаемого нативного ампликона ТБ (76°C). Отдельные реплики считались отрицательными, если обнаруживалось недостаточное количество вкДНК ТБ (≤1 копия одноцепочечной ДНК) и/или T m не соответствовал ожидаемому нативному ампликону ТБ. Образец считался положительным, если по крайней мере два из трех повторов, проанализированных в разные дни, были положительными на основании приведенных выше определений.Образцы с нулевым или одним положительным повтором считались отрицательными.

    Дизайн праймеров для ПЦР, средства контроля и меры предосторожности для предотвращения ложноположительных результатов

    Мы разработали праймеры для ПЦР, нацеленные на последовательность вставки IS 6110 , которая является установленной мишенью для диагностики ТБ, присутствующей в множественном, вариабельном количестве копий в ~99% от Микобактерии туберкулеза комплексные штаммы (25). Наши праймеры для ПЦР (таблица 1) амплифицируют короткую мишень размером 40 п.н. в субрегионе IS 6110 , который является консервативным и специфичным для комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB) (26).Чтобы избежать ложных срабатываний из-за неспецифической амплификации, мы использовали заблокированные основания нуклеиновых кислот (LNA), чтобы точно соответствовать T m праймеров, и выбрали температуру отжига (T a ) немного выше праймера T m , чтобы стимулировать специфическое усиление без ущерба для эффективности усиления. Окончательный набор праймеров и оптимизированные условия ПЦР приводят к средней эффективности ПЦР 97,1% (95% ДИ: 95,7–98,6%) и отсутствию амплификации безматричных контролей (NTC) или 10 нг геномной ДНК человека как минимум до 45 циклов. .Чтобы избежать ложноположительных результатов из-за контаминации, мы придерживались надлежащей лабораторной практики для ограничения контаминации ( e , g , разделения комнат до и после ПЦР, регулярной дезинфекции рабочих поверхностей и пипеток, стерильных отфильтрованных наконечников для пипеток, аликвотирования реагентов). в одноразовые объемы). Кроме того, мы разработали синтетический положительный контроль (50 п.н., используемый в качестве контрольного пика во время экстракции и для стандартных кривых ПЦР), который можно амплифицировать с помощью той же пары праймеров, но отличить от эндогенной последовательности-мишени ТБ (40 п.н.) по расплаву. анализа (таблица 1), чтобы любое потенциальное заражение положительным контролем не приводило к ложноположительным результатам.Каждый эксперимент включал положительный контроль (объединенная ТБ-отрицательная моча с добавлением 10 3 копий двухцепочечной синтетической матрицы положительного контроля [Таблица 1]) и отрицательный контроль (вода без добавленной мишени), которые использовались на протяжении всего процесса экстракции. наряду с клиническими образцами мочи. NTC PCR (n=3) также были включены в каждый эксперимент.

    Статистический анализ

    Чувствительность и специфичность рассчитывались с использованием положительного результата Xpert MTB/RIF мокроты и наличия одного или нескольких симптомов ТБ в качестве эталонного стандарта.95% доверительные интервалы для чувствительности и специфичности были рассчитаны с использованием гибридного метода Уилсона/Брауна. Чувствительность сравнивали между группами с помощью точного критерия Фишера. Обнаруженную концентрацию вкДНК рассчитывали на основе средних значений вкДНК-положительных образцов. Обнаруженные концентрации вкДНК сравнивали между группами с помощью теста Манна-Уитни. Корреляции с обнаруженной концентрацией вкДНК оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Отношения шансов сравнивали со значением 1 с использованием точного критерия Фишера с 95% доверительными интервалами, определенными с использованием метода Баптисты-Пайка.Весь статистический анализ был проведен с использованием GraphPad Prism v8.1.2 (Сан-Диего, Калифорния, США) с уровнем значимости 0,05.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Аналитические характеристики сиквенс-специфического анализа вкДНК ТБ

    Обзор нашего анализа вкДНК показан на рис. 1A-B. Восстановление добавленного положительного контроля составило 91,8% (95% ДИ: 75,9–107,6%) в 15 независимых экспериментах (рис. 1С).

    Рис. 1: Захват и обнаружение коротких фрагментов вкДНК в моче с использованием специфичной для последовательности очистки и ПЦР с короткой мишенью.

    (A) Обзор протокола специфичной для последовательности очистки и ПЦР с короткой мишенью (40 п.н.) для вкДНК ТБ. (B) Схема, иллюстрирующая детали конструкции захватывающего зонда, предназначенного для вводимого элемента, специфичного для комплекса MTB IS 6110 . (C) Почти полное выделение короткой специфической для ТБ ДНК, введенной в мочу с использованием очистки, специфичной для последовательности. Положительный контроль (10 90 239 3 90 240 копий двухцепочечной ДНК размером 50 п.н. в 10 мл объединенной мочи) включали в каждый эксперимент вместе с клиническими образцами.Восстановление положительного контроля рассчитывали как процент от ввода (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 15). Ключевые особенности дизайна, оптимизация анализа и дополнительная аналитическая характеристика нашего метода очистки, специфичного для последовательности, для вкДНК описаны в (24).

    Участники исследования

    Мы зарегистрировали 73 участника в двух центрах: больнице Эдендейл в Южной Африке (49 больных туберкулезом, 10 больных туберкулезом) и Вашингтонском университете в США (14 здоровых людей из контрольной группы с низким риском заражения туберкулезом).Демографические и клинические данные участников приведены в Таблице 2.

    Таблица 2: Сводка участников исследования.

    Чувствительность и специфичность последовательно-специфического анализа вкДНК ТБ

    Сводная информация о диагностической точности нашего анализа вкДНК в моче ТБ представлена ​​в Таблице 3. Полные результаты для каждого участника, включая парные клинические данные и обнаруженную концентрацию вкДНК, приведены в Дополнении. Набор данных S1. Используя Xpert MTB/RIF в мокроте в качестве эталонного стандарта, мы обнаружили специфическую для туберкулеза вкДНК мочи с 83.7% чувствительность (n=41/49; 95% ДИ: 71,0–91,5%) и 100% специфичность (n=24/24; 95% ДИ: 86,2–100%). В моче ТБ-отрицательных контролей в Южной Африке (n=10) или здоровых контролей в США (n=14) не было обнаружено специфической для ТБ вкДНК.

    Таблица 3: Чувствительность и специфичность анализа вкДНК мочи туберкулеза.

    Чувствительность была незначительно выше у ВИЧ-положительных пациентов по сравнению с ВИЧ-отрицательными пациентами (88,2% [n=30/34; 95% ДИ: 73,4–95,3%] против 73,3% [n=11/15; 95% ДИ: 48,1 – 89,1%]; р=0,23). Чувствительность была одинаковой у ВИЧ-позитивных пациентов с количеством CD4 ≤200 и >200 клеток/мм 3 (87.5% [n=20/22; 95% ДИ: 52,1–99,4%] против 83,3% [n=10/12; 95% ДИ: 55,2 – 97,0%]). Чувствительность составила 77,8% (n=28/36; 95% ДИ: 61,9–88,3%) у пациентов, ранее не получавших лечения. Если для определения случая ТБ также требовался положительный результат посева мокроты, общая чувствительность повышалась до 88,2% (n=30/34; 95% ДИ: 73,4–95,3%). Мы обнаружили ТБ-специфическую вкДНК в моче всех пациентов с положительными результатами мазка мокроты на КУМ (n = 19/19) и/или результатами LAM в моче Alere (n = 15/15). Чувствительность оставалась высокой у пациентов с отрицательным мазком (76.0% [n=19/25; 95% ДИ: 56,6–88,5%]) и ЛАМ-отрицательные (76,5% [n=26/34; 95% ДИ: 60,0–87,6%]) пациенты. Снижение чувствительности у пациентов с отрицательным мазком по сравнению с пациентами с положительным мазком было значительным (p = 0,029), а у пациентов с отрицательным мазком по сравнению с пациентами с положительным мазком — нет (p = 0,087). См. Таблицу S1 для статистического анализа чувствительности по группам.

    Мы оценили факторы, связанные с положительным результатом вкДНК ТБ, и обнаружили, что только положительный результат мазка на КУМ был значимо связан с положительным результатом вкДНК ТБ (отношение шансов >1, p=0.029). ВИЧ-статус, количество CD4, статус лечения, результат посева и результат LAM не были значимо связаны с положительным результатом вкДНК мочи (таблица S2).

    Количественное определение концентрации ТБ-специфической вкДНК в моче

    Обнаруженная концентрация ТБ-специфической вкДНК была вариабельной и смещенной в сторону низких концентраций, со средним значением 146 копий в 10 мл мочи (таблица 4). Концентрация вкДНК имела умеренную обратную корреляцию с количеством CD4 (-0,43 [95% ДИ: от -0,68 до -0,10; p = 0.011]) (рис. 2А) и дней до получения положительного результата посева (-0,36 [95% ДИ: от -0,64 до -0,0060; p = 0,041]) (рис. S1), но нет значимой корреляции с днями противотуберкулезного лечения, КУМ оценка мазка или оценка мочи Alere LAM (таблица S3). Концентрация вкДНК была выше у пациентов, получавших какое-либо лечение, по сравнению с пациентами, ранее не получавшими лечения (p=0,045), и у пациентов с LAM-положительными в моче по сравнению с LAM-негативными пациентами в моче (p=0,0045), но существенно не различалась у пациентов, сгруппированных по ВИЧ-статус, количество CD4, результат посева, результат мазка или пол (рис.2Б).

    Таблица 4: Обнаруженные концентрации вкДНК мочи, специфичной для ТБ.Рис. 2: Обнаруженные концентрации вкДНК мочи, специфичной для туберкулеза.

    (A) Концентрация вкДНК ТБ, обнаруженная в моче каждого участника, стратифицированная по ВИЧ-статусу и ранжированная по количеству CD4. Отмечалась умеренная обратная корреляция между количеством CD4 и обнаруженной концентрацией вкДНК ТБ (коэффициент Спирмена r = -0,43 [95% ДИ: от -0,68 до -0,10], p = 0,011), но вкДНК ТБ можно было обнаружить независимо от ВИЧ-статуса и количества CD4 . Каждая точка представляет один из трех повторов, обработанных в разные дни для каждого образца.Обратите внимание, что точки, представляющие повторы с аналогичными обнаруженными концентрациями, могут перекрываться. Повторы, названные положительными, показаны синим цветом, а повторы, названные отрицательными, показаны красным. Пунктирная линия указывает пороговое значение 1 копия на 10 мл, используемое для определения положительных повторов. Легенда под графиком указывает статус обнаружения внДНК по реплике (считается положительной, если ≥1 копия одноцепочечной ДНК была обнаружена с температурой плавления, соответствующей температуре ожидаемого ампликона IS 6110 ) и по образцу (считается положительной, если ≥2 из 3). повторы были положительными). (B) Сравнение обнаруженной концентрации вкДНК ТБ по группам (столбики указывают медиану и IQR средних значений образцов с положительными по вкДНК образцами). Обнаруженная концентрация вкДНК ТБ была значительно выше у пациентов, получавших какое-либо лечение, по сравнению с пациентами, ранее не получавшими лечения, и у пациентов с LAM-положительным статусом по сравнению с LAM-отрицательными пациентами (* означает P Манна-Уитни <0,05; ** означает P Манна-Уитни <0,05). 0,01), но на него не влияли ВИЧ-статус, количество CD4, результат посева, результат мазка или пол (ns означает незначимость).См. Таблицу S4 для рассчитанных P-значений для каждого сравнения.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Улучшенное обнаружение короткой вкДНК в моче с использованием последовательности-специфической очистки

    Чтобы максимизировать чувствительность обнаружения вкДНК в моче туберкулеза, важно использовать методы, предназначенные для обнаружения низких концентраций коротких фрагментов (6, 14, 15). Ожидается, что уменьшение минимальной длины мишени улучшит диагностическую чувствительность вкДНК (8, 27–29). Например, уменьшение длины ампликона ПЦР на скромные 10 п.н. (от 49 п.н. до 39 п.н.) привело к более чем 10-кратному увеличению обнаруженной ТБ-специфичной вкДНК (29).Важно отметить, что в дополнение к амплификации коротких мишеней методы подготовки образцов должны также с высокой эффективностью извлекать короткую вкДНК из мочи. Обычные методы выделения ДНК на основе кремнезема снижают извлечение коротких фрагментов и поэтому не оптимальны для внДНК мочи (30).

    Мы стремились повысить диагностическую чувствительность обнаружения вкДНК мочи туберкулеза путем улучшения извлечения короткой вкДНК на этапе выделения ДНК. Мы разработали метод очистки, специфичный для последовательности, в котором используются зонды гибридизационного захвата, иммобилизованные на магнитных шариках, для извлечения короткой вкДНК с высокой аналитической чувствительностью.Ранее мы продемонстрировали, что очистка, специфичная для последовательности, улучшает выделение коротких фрагментов вкДНК (25–150 п.н.) из мочи по сравнению с альтернативными методами выделения вкДНК из мочи, включая протокол, используемый для вкДНК мочи туберкулеза (31). В недавней статье, подробно описывающей наш метод очистки для конкретных последовательностей, мы описали его ключевые особенности, предоставили готовый к использованию протокол и подробно охарактеризовали его аналитические характеристики (24). В этом исследовании наш специфичный для последовательности подход восстановил почти всю ДНК положительного контроля размером 50 п.н., специфичную для мишени (91.в среднем 8% восстановления) и в некоторых клинических образцах удалось обнаружить до одной копии внДНК ТБ в 10 мл мочи.

    Диагностическая точность и сравнение с предыдущими исследованиями вкДНК ТБ мочи

    В этом исследовании мы впервые протестировали наш сиквенс-специфический анализ вкДНК ТБ в клинических образцах мочи. Чувствительность и специфичность нашего анализа для диагностики активного туберкулеза легких составляли 84% и 100% соответственно, что является самой высокой зарегистрированной диагностической точностью теста вкДНК на туберкулез.Для сравнения результаты предыдущих исследований вкДНК мочи на туберкулез представлены в таблице 5 (8–12). Подробный обзор предыдущих исследований см. в (14).

    Таблица 5: Сравнение с предыдущими исследованиями, направленными на вкДНК мочи для диагностики туберкулеза легких. a

    Предыдущие исследования показали возможность обнаружения специфической для ТБ вкДНК мочи у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных пациентов, но их чувствительность была разной из-за методов подготовки образцов и/или амплификации, неоптимальных для коротких мишеней (6, 14, 15).Каннас и др. . использовали собственный метод с использованием силикагелевой смолы (на основе смолы для очистки ДНК Promega Wizard), который, как сообщается, предназначен для улучшения связывания короткой вкДНК, но не сообщил о его аналитических характеристиках ( и , г , процент извлечения) (8). В то время как метод Wizard совершенствует традиционные методы на основе диоксида кремния, наши предыдущие испытания показали ограниченное извлечение (<35%) фрагментов размером ≤150 п.н. (31). Он также сильно зависел от состава мочи и, вероятно, не работал в образцах с высоким pH и/или низкой концентрацией нецелевой ДНК (31).Лабаггер и др. . и Patel и др. . использовали аналогичный метод на основе кремнеземной смолы, но не указали смолу или условия связывания (9, 10). Возможно, что их метод страдает теми же ограничениями, что и метод Волшебников, используемый Каннасом и др. , хотя мы не смогли экспериментально проверить это. Они сообщили об извлечении примерно 30–50% и пределах обнаружения 3 копий/мл (цель 75 п.н.) (9) и 1,25 копий/мл (гДНК ТБ, содержащая до 42 целевых повторов) (10).Наш метод очистки, специфичный для последовательности, увеличивает процент извлечения в 2 раза и более и улучшает предел обнаружения до ≤0,5 копий/мл вкДНК размером 50 п.н. (порог отсечения положительности 0,1 копий/мл, используемый здесь). Наш метод позволяет амплифицировать весь объем, элюированный из 10 мл мочи, в одной лунке для ПЦР, что обеспечивает максимальную чувствительность при обнаружении образцов с низкой концентрацией.

    Прошлые исследования также включали несколько участников с отрицательным мазком, и, таким образом, не проверялась способность обнаруживать вкДНК в моче у лиц с малобациллярным ТБ, которым наибольшая польза от теста, не основанного на мокроте.В частности, наиболее перспективным является исследование Cannas et ​​al . включали только 5% (2/43) участников с отрицательным мазком. Наши результаты показывают, что чувствительность обнаружения вкДНК выше у лиц с положительным мазком по сравнению с лицами с отрицательным мазком, поэтому смещение зачисления в сторону участников с положительным мазком может привести к переоценке чувствительности анализа. Напротив, мы продемонстрировали более высокую чувствительность при включении 61% (30/49) участников с отрицательным мазком.

    Хотя это и не тестировалось здесь напрямую, дополнительным преимуществом нашего подхода, специфичного для последовательностей, является то, что он может помочь обеспечить специфичность за счет удаления ДНК, не являющейся мишенью.Для повышения чувствительности диагностики ТБ по мокроте использовалась специфичная для последовательности очистка путем удаления высоких концентраций нецелевой ДНК, которая может привести к ингибированию последующей амплификации (34), но она не применялась в моче, где основное преимущество нецелевой ДНК Удаление ДНК должно было бы снизить вероятность последующей неспецифической амплификации. Подтверждение специфической амплификации коротких мишеней без следа для флуоресцентного зонда обнаружения может быть затруднено, но дополнительный уровень специфичности, предлагаемый очисткой, специфичной для последовательности, может помочь в преодолении этой проблемы.

    Сравнение с существующими экспресс-тестами на ТБ

    Наш анализ вкДНК мочи может диагностировать ТБ у лиц, которые могут быть пропущены другими экспресс-тестами ( e . g ., микроскопия мазка, LAM мочи). Мы обнаружили ТБ-специфическую вкДНК в моче всех пациентов с положительным мазком и LAM-положительным. Важно отметить, что чувствительность оставалась высокой как у пациентов с отрицательным мазком (76,0%), так и у пациентов с отрицательным результатом мазка (76,5%). Профиль целевого продукта для экспресс-теста на ТБ без анализа мокроты на основе биомаркеров описывает оптимальные требования для ТБ легких у взрослых: ≥98% для ТБ с положительным мазком, ≥68% для ТБ с отрицательным мазком и чувствительность ≥80%. для ВИЧ-ассоциированного ТБ (5).Наши результаты показывают, что за счет использования оптимизированного метода экстракции с продемонстрированной высокой эффективностью для коротких фрагментов анализы на основе вкДНК мочи могут достичь достаточной чувствительности для соответствия этим критериям и повысить точность диагностики по сравнению с микроскопией мазка.

    В отличие от LAM-тестов мочи, которые обладают недостаточной чувствительностью, особенно у ВИЧ-отрицательных лиц (35), тесты вкДНК могут диагностировать ТБ независимо от ВИЧ-статуса и количества CD4. Мы наблюдали несколько более высокую чувствительность у ВИЧ-позитивных (88.2%) по сравнению с ВИЧ-отрицательными (73,3%) пациентами, но разница была недостоверной и количество ВИЧ-отрицательных пациентов было небольшим. Несмотря на умеренную обратную корреляцию между числом CD4 и обнаруженной концентрацией вкДНК, специфичной для туберкулеза, не было различий в чувствительности для ВИЧ-позитивных пациентов с числом CD4 ≤200 по сравнению с >200 клеток/мм 3 . Напротив, имеющийся в продаже тест Alere Definition TB LAM имеет суммарную чувствительность 42% у ВИЧ-позитивных лиц, при этом чувствительность обратно пропорциональна количеству клеток CD4 (36).ВОЗ рекомендует использовать его только у людей, живущих с ВИЧ, но не в качестве общего скринингового теста на ТБ (37). Текущие усилия направлены на повышение чувствительности обнаружения LAM в моче. Тест Fujifilm SILVAMP TB LAM повышает чувствительность по сравнению с Alere LAM как у ВИЧ-позитивных (70% против 42%), так и у ВИЧ-отрицательных (53% против 11%) людей (38, 39). Однако в качестве тестов, основанных на антигенах, анализы LAM могут быть не в состоянии достичь чувствительности, обеспечиваемой тестами амплификации нуклеиновых кислот.

    Вклад в доказательства использования внДНК мочи в качестве биомаркера ТБ

    На сегодняшний день полезность внДНК мочи в качестве биомаркера ТБ была ограничена, отчасти из-за непоследовательных методов и результатов предыдущих исследований вкДНК мочи ТБ.Наше исследование вносит вклад в доказательства того, что вкДНК мочи является биомаркером туберкулеза двумя способами: 1) демонстрация возможности высокой чувствительности и специфичности с помощью оптимальных преаналитических методов и 2) разработка надежного количественного метода для дальнейшего изучения вкДНК мочи туберкулеза. . Предыдущие исследования вкДНК мочи ТБ были сосредоточены на измерении диагностической точности и в большинстве случаев не сообщали о концентрациях вкДНК мочи ТБ. Лабаггер и др. . измеренные концентрации для ограниченного числа лиц, ранее не получавших лечения (n = 7), которые варьировались от 1 до 41 копий/мл (медиана 6.5 копий/мл) (9). Здесь мы количественно определили ТБ-специфическую вкДНК, чтобы лучше оценить клинический диапазон (<1 – 2804 копий/мл; медиана 14,6 копий/мл), и провели анализ, чтобы определить, какие переменные коррелируют с концентрацией вкДНК. Мы обнаружили, что концентрация вкДНК была выше у LAM-положительных пациентов по сравнению с LAM-отрицательными пациентами, но результат LAM не влиял на чувствительность вкДНК. Мы обнаружили вкДНК у всех пациентов, недавно начавших противотуберкулезное лечение, с более высокой концентрацией по сравнению с пациентами, ранее не получавшими лечения, что подтверждает возможность использования вкДНК для мониторинга лечения, как предполагалось ранее (9).После начала успешного лечения концентрация вкДНК может временно увеличиваться, а затем медленно снижаться по мере устранения инфекции (9). Наше исследование не показало корреляции между днями лечения и концентрацией вкДНК, но включало только участников с ≤3 днями лечения и не отслеживало отдельных участников с течением времени.

    Хотя вкДНК определялась независимо от ВИЧ-статуса или количества CD4, обнаруженная концентрация имела умеренную обратную корреляцию с количеством CD4.Мы также обнаружили, что концентрация вкДНК имела умеренную обратную корреляцию с количеством дней до положительного результата посева, что позволяет предположить, что уровни экскретируемой вкДНК могут быть связаны с бактериальной нагрузкой. Мы не наблюдали корреляции с оценкой мазка мокроты КУМ или оценкой мочи Alere LAM, но размеры выборки для этих анализов были небольшими. Мы ожидаем, что наш анализ можно будет использовать для продолжения изучения тенденций вкДНК мочи туберкулеза в подгруппах и ответа на важные нерешенные вопросы, касающиеся оптимальных методов сбора образцов, методов обработки и условий хранения, которые были в центре внимания недавней работы (40–42). .В качестве предостережения, концентрации вкДНК, измеренные с помощью нашего анализа, могут быть искажены переменным числом копий IS 6110 (0–25 копий) (25) и различиями в статусе гидратации участников. В будущем типирование штаммов и нормализация концентрации вкДНК по отношению к креатинину в моче может помочь лучше выявить тенденции концентрации вкДНК.

    Ограничения исследования и будущая работа

    Симптомы ТБ требовались в дополнение к положительному результату Xpert для определения случая ТБ, чтобы снизить риск ложноположительного результата Xpert, но возможно, что некоторые из них все же могли проявиться.Использование самых строгих критериев положительного результата на ТБ, требующих как положительного результата Xpert, так и положительного результата посева, приведет к незначительному увеличению чувствительности вкДНК (88%). Несколько ТБ-позитивных, вкДНК-отрицательных образцов (ложноотрицательные) едва не преодолели отсечку положительности вкДНК, что указывает на возможность будущего улучшения клинической чувствительности. В настоящее время мы используем два подхода для дальнейшего улучшения способности нашего анализа обнаруживать низкие концентрации вкДНК: уменьшение длины мишени ПЦР (до 25 п.н. с использованием ультракороткой схемы ПЦР, описанной в (31)) и мультиплексирование для нацеливания на несколько геномных областей.Дополнительным преимуществом мультиплексирования будет повышение инклюзивности за счет возможности обнаружения штаммов ТБ, не соответствующих стандарту IS 6110 .

    Это исследование служит ценной демонстрацией осуществимости нашего подхода, основанного на конкретных последовательностях, но размер выборки и область применения были ограничены. Будущие исследования будут направлены на дальнейшую проверку нашего анализа с более крупными размерами выборки (включая большее количество ВИЧ-отрицательных участников и отрицательных контролей) и расширенными популяциями, особенно теми, которые недостаточно охвачены текущими экспресс-тестами на основе мокроты (включая детей и пациентов с EPTB).Туберкулезная вкДНК была обнаружена в моче (13) и плазме (43–45) лиц с внебольничным туберкулезом, в том числе в клиническом случае ребенка с туберкулезным средним отитом (46), но проспективных исследований в этой области еще не проводилось. дети. Наш анализ также в настоящее время требует обученного пользователя и лабораторного оборудования. В будущем мы стремимся упростить наш лабораторный тест в формате, более подходящем для использования в условиях ограниченных ресурсов.

    Заключение

    Очистка, специфичная для последовательности, улучшает восстановление короткой вкДНК мочи и повышает чувствительность диагностики ТБ по вкДНК мочи.Наш анализ имеет самую высокую на сегодняшний день точность из всех тестов вкДНК мочи на туберкулез и может позволить проводить диагностику туберкулеза на основе мочи в популяциях с дефицитом мокроты и малобациллярных популяциях. Это исследование заложит основу для расширенных клинических исследований и будущей разработки экспресс-теста. Кроме того, наша работа служит ценным вкладом в клинические данные о внДНК мочи в качестве биомаркера туберкулеза. Возможность диагностировать ТБ среди ключевых групп населения с недостаточным уровнем обслуживания ( e . g ., дети, люди, живущие с ВИЧ, люди с внебольничной формой туберкулеза) с использованием образцов мочи позволит решить неотложную потребность, которая была определена как один из самых приоритетных пробелов в диагностике ТБ (5). Чувствительный тест на основе мочи, основанный на описанном здесь методе очистки, специфичном для последовательности, может внести значительный вклад в улучшение доступности образцов, расширение доступа к экспресс-диагностике ТБ и сдерживание эпидемии ТБ.

    Доступность данных

    Все соответствующие данные содержатся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

    БЛАГОДАРНОСТЬ

    Мы благодарны участникам исследования за их вклад в это исследование. Мы благодарим Департамент здравоохранения Квазулу-Наталь и персонал больницы Эдендейл за их партнерство, а также Нормана Д. Браулта и Джеймса Лая за их вклад в раннюю разработку метода очистки, специфичного для последовательности. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, финансировалось Фондом Билла и Мелинды Гейтс под номером награды OPP1152864 и Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здравоохранения под номером премии R21AI125975.Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Это исследование частично финансировалось за счет гранта CFAR на развитие 2018 года от Вашингтонского университета / Центра исследований СПИДа Фреда Хатча, программы, финансируемой NIH, под номером награды AI027757, которая поддерживается следующими институтами и центрами NIH: NIAID, NCI, NIMH. , НИДА, НИЧД, НХЛБИ, НИА, НИГМС, НИДДК. АО была поддержана финансированием программы стипендий для выпускников Национального научного фонда.Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и интерпретации данных или принятии решения о представлении работы для публикации.

    Анализы крови на туберкулез | Серологические тесты на туберкулез

    Что такое серологические анализы или анализы крови на туберкулез?

    Анализы крови на туберкулез, также называемые серологическими тестами, представляют собой тесты, которые проводятся на образцах крови. Серологические или серодиагностические тесты на ТБ означают диагностику ТБ путем изучения образца крови и, в частности, поиска антител в образце крови.Некоторые заболевания, такие как ВИЧ, можно очень легко диагностировать, взяв образец крови, а затем выполнив процедуру поиска антител в образце крови. Но вы не можете диагностировать туберкулез таким образом.

    Тестирование на туберкулез путем обнаружения антител в крови чрезвычайно сложно. У людей может быть ответ антител, предполагающий, что у них активный туберкулез, даже если это не так. Антитела могут также вырабатываться против других организмов, что опять-таки может ошибочно указывать на то, что у них активный ТБ

    .

    В результате коммерческие серологические тесты на ТБ, иногда называемые серодиагностическими тестами (например, Anda-TB IgG), дают очень изменчивые результаты, что обычно означает низкую чувствительность и специфичность.  Если тест имеет низкую чувствительность, это означает, что будет значительное количество «ложноотрицательных» результатов. Это означает, что результат теста указывает на то, что у человека нет туберкулеза, хотя он действительно болен туберкулезом. Точно так же низкая специфичность означает, что будет значительное количество «ложноположительных» результатов. Это предполагает, что у человека туберкулез, хотя на самом деле его нет.

    В июле 2011 года Всемирная организация здравоохранения выпустила предупреждение о том, что такие анализы крови не следует использовать для диагностики активной формы туберкулеза.Сказали что:

    «Результаты тестов противоречивы, неточны и представляют опасность для жизни пациентов».
    Д-р Mario Ravihlione, директор Департамента ВОЗ «Остановить туберкулез»

    Использование анализов крови для диагностики туберкулеза в Индии

    В июне 2012 года Министерство здравоохранения и благосостояния семьи Индии запретило производство, импорт, распространение и использование наборов серологических тестов для диагностики ТБ. Однако к началу декабря тесты все еще широко использовались в некоторых штатах, таких как Андхра-Прадеш, и председатель RNTCP в Южной Индии сказал, что:

    «Анализ крови для диагностики туберкулеза был запрещен правительством шесть месяцев назад, но он до сих пор не применяется.
    Профессор К. Субхакар

    В конце декабря 2012 г. Министерство здравоохранения и благосостояния семьи разместило рекламу в национальных газетах, как показано ниже, снова объясняя, что использование наборов для серологических тестов на ТБ запрещено из-за недостаточной точности тестов. Газетные объявления также содержали ряд вопросов и ответов.

    Они объяснили, что это не означает, что для диагностики туберкулеза нет тестов на туберкулез. Они объяснили, что можно использовать анализы мокроты, культуральные исследования и более новые молекулярные тесты, а также что бесплатная диагностика и лечение туберкулеза доступны через NTEP (RNTCP).

    ТБ реклама о запрете серологических анализов крови на ТБ © RNTCP

    Обновление страницы

    Последнее обновление этой страницы: март 2021 г.
    Автор Аннабель Канабус

    Социальные сети

    Если эта страница показалась вам полезной, расскажите другим людям о TBFacts.org, а если у вас есть веб-сайт, дайте ссылку на нас по адресу https://tbfacts.org/serological-test-tb/.

    Какие другие невалидированные тесты существуют для проверки на ТБ у крупного рогатого скота?

    ПЦР-тест

    Анализ или тест полимеразной цепной реакции (ПЦР) может стать быстрым, недорогим и очень чувствительным инструментом для выявления инфекции bTB.Нажмите здесь, чтобы узнать больше об этом в исследовании Института сельского хозяйства и биологических наук.

    ПЦР выявляет небольшие количества ДНК из смешанных образцов, и этот метод часто сочетается с иммуно-магнитной сепарацией (ИМС), которая увеличивает концентрацию образцов, что приводит к повышению чувствительности теста.

    Возможно использование ПЦР с образцами фекалий и окружающей среды. Тем не менее, работа по проверке ПЦР в образцах барсука была ограничена. Исследования по оценке чувствительности ПЦР в образцах фекалий барсуков проводились в Ирландской Республике.

    Defra финансирует исследования в области ПЦР с 2007 года для обнаружения бактерий M. bovis в образцах окружающей среды, таких как поселения барсуков и туалеты. В то время как было продемонстрировано, что ПЦР идентифицирует M. bovis в образцах с шипами в лаборатории со 100% специфичностью (на 100% достоверно, что положительный результат теста означает наличие болезни) и 97% чувствительностью (97% успешно идентифицирует больные образцы) , было обнаружено, что он менее чувствителен для образцов в полевых условиях.

    В небольшом исследовании окружающей среды ПЦР в реальном времени смогла идентифицировать болезнь во всех 12 отобранных зараженных поселениях и туалетах. Однако использование образцов из окружающей среды в этом контексте подверглось критике. Зараженные барсуки периодически выделяют M. bovis , что затрудняет интерпретацию проб из окружающей среды.

    На следующем этапе необходимо определить, как применять анализ ПЦР для крупномасштабного эпиднадзора за ВТБ среди диких животных.

    Подробнее о ПЦР:

    Тест на антитела IDEXX

    Тест IDEXX еще не был официально признан ЕС, но в 2012 году получил одобрение МЭБ (Всемирной организации здравоохранения животных) в качестве дополнительного теста на ТБ у крупного рогатого скота.Это означает, что APHA может использовать его в исключительных случаях с разрешения владельца стада. Это третий тест, используемый при хронических нарушениях стада после повторных кожных проб и, по крайней мере, одного раунда анализа крови на гамма-интерферон.

    Тест на антитела Enferplex

    Это еще один анализ крови, с помощью которого можно обнаружить антитела к бактериям bTB в сыворотке и, возможно, в молоке инфицированных коров. Он также был одобрен МЭБ в качестве дополнительного теста, но пока официально не признан ЕС.Этот тест можно использовать только в частном порядке с одобрения APHA, поскольку в настоящее время он не одобрен Defra.

    Тест на актифаг

    Бактериофаг или фаг — это вирус, поражающий бактерии. Он делает это, заражая своего бактериального хозяина, вводя свою ДНК в бактериальную клетку, которая затем вынуждена производить новые фаговые частицы. После создания нового фага вирусы разрывают бактериальную клетку. Это высвобождает новый фаг в окружающую среду, что, в свою очередь, может заразить больше бактерий.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.