Туберкулез у детей — неутихающая обеспокоенность — Российская газета

Туберкулез у детей и подростков — еще недавно эта тема вызывала глубокую озабоченность специалистов. Но за последние 10 лет удалось резко снизить ее остроту. Однако и нерешенных вопросов еще немало. Об этом «РГ» рассказала главный внештатный детский фтизиатр, руководитель отдела детско-подросткового туберкулеза НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний Минздрава РФ, доктор медицинских наук, профессор Валентина Аксёнова.

Валентина Александровна Аксёнова. Фото: Аркадий Колыбалов

Валентина Александровна, какова сейчас распространенность туберкулеза среди детей и подростков?

Валентина Аксёнова: В доперестроечное время наши показатели были одними из лучших в стране за счет эффективной работы фтизиатрической службы — тогда нам удавалось охватить профилактической вакцинацией 95% новорожденных. Потом начался резкий рост заболеваемости и взрослых, и детей, показатели вакцинации значительно снизились. Это был тяжелый период: к нам приезжали мигранты из регионов, где была высокая заболеваемость, было огромное число случаев туберкулеза в местах лишения свободы и т.д. Но за последние 10-12 лет многое изменилось: нам стали выделять значительные средства, новое оборудование, появились новые методы раннего выявления и профилактики. И заболеваемость среди детей снизилась более, чем в два раза. Сегодня ВОЗ признает нашу страну лидером по снижению заболеваемости туберкулезом.

А остались ли еще регионы, которые вызывают у вас тревогу?

Валентина Аксёнова: Вызывает обеспокоенность Тыва, там пока много туберкулеза, хотя постепенно статистика тоже снижается. В Приморском крае коллеги работают на очень высоком уровне, но там есть туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью, который был завезен из Китая и с которым крайне тяжело бороться. Дальний Восток в целом много сделал для снижения заболеваемости. Когда я первый раз приехала на Камчатку, то поразилась, как они вообще лечат без томографа? Там главные врачи тубдиспансера менялись, «как перчатки». Но зампредседателя правительства края выслушал меня и хорошо отнесся к проблеме. Нашли молодого энергичного главного врача, и сейчас это одна из показательных территорий. Больше меня беспокоят Дагестан, Северная Осетия. Я туда ездила не раз, и там уже многое делается, но пока все сложно. Высоких результатов добились и в системе ФСИН — в местах лишения свободы сейчас показатели лучше, чем в гражданском секторе, создана хорошая фтизиатрическая служба.

Повлияла ли на уровень заболеваемости пандемия коронавируса?

Валентина Аксёнова: Пока сложно сказать, но через два-три года туберкулез покажет, как именно она повлияла. Конечно, мы опасаемся, что будет некий всплеск.

Как ваша служба работала в этих сложных условиях?

Валентина Аксёнова: В России создана рабочая группа, в которую входят двадцать лучших специалистов фтизиатров, а также создана группа главных специалистов федеральных округов. Это позволило нам сохранить единую тактику и в период пандемии, все вопросы мы решаем коллегиально. Сейчас, например, идет очень большая и сложная работа по обновлению СанПиНов. Что это такое? Каждый специалист присылает свои предложения, я их обобщаю — такая работа дает максимальный результат. Поэтому смогли в течение всего трех дней в марте-апреле прошлого года выпустить целую главу временных методических рекомендаций по организации работы службы во время пандемии. Все детские стационары мы постарались сохранить. Всего у нас болеют туберкулезом чуть больше двух тысяч детей на всю Россию. Тяжелый туберкулез лечится в стационаре, легкий — амбулаторно, то есть дома. Но самое важное — профилактическое лечение, а его лучше всего проводить в санатории, потому что не всякая мама будет давать здоровому ребенку горсть таблеток, чтобы предупредить у него развитие туберкулеза. Но это необходимо, как и проведение иммунодиагностики. Было сложно, но в итоге к концу прошлого года охват профилактическими осмотрами детского населения у нас достиг 87%. Все в рабочей группе знали, что перед тем, как пустить в школу или делать ребенку какие-то прививки, надо обязательно вакцинировать его от гриппа. А перед прививкой от гриппа мы обязали всем детям провести иммунодиагностику — поставить кожную пробу.

Но ведь немало мамочек, которые отказываются от прививки БЦЖ, кожных проб, профилактического лечения?

Валентина Аксёнова: Мы это понимали и поэтому прописали в клинических рекомендациях, что прививки и диагностика обязательны. Охват БЦЖ в роддоме в прошлом году составил 82%, как и в прошлые годы, но мы будем добиваться 95%.

Как врачам удается убедить мам, которые отказываются?

Валентина Аксёнова: У нас идет с ними очень строгая борьба. На нас еще в 1997 году жаловались в Верховный суд. Есть такие клинические рекомендации «Выявление и диагностика туберкулеза». И на каждый их пункт родители-антипрививочники подавали в суд. Самое главное, что у них действительно были аргументы — 20 лет назад было много осложнений на эти прививки. Я посвятила много лет изучению этой проблемы: моя диссертационная работа посвящена именно этой проблеме и под моим руководством защищены уже две докторские и несколько кандидатских по этой теме.

И вы смогли выяснить, в чем причины частых осложнений?

Валентина Аксёнова: Мы создали федеральный центр мониторинга осложнений после БЦЖ, который функционирует и сейчас, а также регистр, в который вносится каждое осложнение. Всю эту информацию мы анализировали и пришли к выводу, что основная причина — нарушение техники введения препарата. А оно сложное — вакцина БЦЖ водится внутрикожно, и не все медсестры владеют техникой такой инъекции. Поэтому мы совместно с Роспотребнадзором ввели обязательное обучение раз в два года технике введения вакцины всего среднего медперсонала. Отвечает за это главный фтизиатр региона. На каждый случай осложнения он составляет акт расследования, выясняет причину, и сегодня у нас на всю страну не более 150 осложнений, а тяжелых — не более 50, и они, как правило, связаны и иммунной системой самого ребенка — каким-либо иммунодефицитом. Мы также создали перечень противопоказаний для введения БЦЖ или изменения срока прививки.

Важный вопрос: нужна ли детям, подросткам и взрослым ревакцинация БЦЖ?

Валентина Аксёнова: Вы затронули интересную тему. Моя докторская диссертация была посвящена именно вопросам вакцинации и ревакцинации. Тогда впервые и показала, что осложнение — это нарушение техники. Что касается ревакцинации, то тогда, 30 лет назад, она была рекомендована всем подряд в семь лет, в двенадцать, в 17 и в 25. А если ты в группе риска, то каждые пять лет до возраста 30 лет. Я доказала, что это не нужно, и после защиты диссертационной работы ревакцинацию оставили только в 7 и в 14 лет. И все эти годы я бьюсь за то, что она не нужна вообще. В 2014 году отменили ревакцинацию и в 14 лет, осталась лишь в 7 лет. Сейчас уже достаточно оснований для полной отмены ревакцинации. Это позволит специалистам сосредоточиться на качественном проведении вакцинации в раннем детском возрасте и акцентировать свои усилия на раннее выявление туберкулезной инфекции и проведении профилактических мероприятий особенно в группах риска по развития туберкулеза.

Неужели это означает, что у детей сохраняется пожизненная защита от туберкулеза?

Валентина Аксёнова: Нет, цель прививки БЦЖ иная. У взрослого при туберкулезе поражаются, как правило, легкие. А у детей — внутригрудные лимфатические узлы, и прививка ограничивает процесс на уровне лимфатической системы, чтобы микобактерия не пошла в кровь и не развились тяжелые генерализованные формы заболевания, которые могут привести к смерти ребенка. Потому что там, куда она попала, будет развиваться туберкулезный процесс, и тут уже никакая ревакцинация не поможет. Но есть исследования, что прививка действует и до 15 лет, и до 20. Конечно, мы не просто так отменили ревакцинацию в 14 лет. Первую такую группу детей я наблюдала семь лет и пришла к выводу, что к 14 годам среди них в восемь раз уменьшилось число детей с гиперчувствительностью к иммунодиагностике, потому что там происходило наслаивание аллергии. Чаще всего это и становится причиной положительной пробы Манту, а не заражение микобактерией туберкулеза. Самое главное, что если к семи годам всего не более 10% детей имеет отрицательную пробу Манту и подлежат ревакцинации, то в 14 лет они уже все инфицированы, то есть встретились с микобактерией туберкулеза, и ревакцинировать их бесполезно. И надо сказать, что и ВОЗ пришла к такому же выводу спустя 20 лет после моей докторской.

А почему тогда в подростковом возрасте наблюдается небольшой подъем заболеваемости?

Валентина Аксёнова: В подростковом возрасте идет гормональная перестройка, и чаще болеют именно в связи с этим. И это уже туберкулез легких, как у взрослых.

Если кожные пробы на туберкулез положительные, то родителям говорят: ваш ребенок должен пройти профилактическое лечение. А они часто резко против. Как вы их убеждаете?

Валентина Аксёнова: Таких мам две категории. Одна — те, кто отказываются вообще от всех прививок, и кожные скрининговые пробы путают с прививкой. Приходится доказывать им, что это не прививка, а то же самое, что у взрослых флюорография, то есть метод исследования.

Вторая группа — те, кто требует доказательств. Прежде им было трудно это объяснить, потому что не было научных исследований. Геном микобактерий туберкулеза расшифровали всего 20 лет назад и стали искать, где же те самые белки, которые вызывают туберкулез. Их нашли, сделали из них препарат, который сейчас точно определяет: инфицирован человек или нет. Надо отметить, что создание и внедрение в практику аллергена туберкулезного рекомбинантного (диаскинтест), который вводится внутрикожно также как проба Манту, настоящий прорыв российской медицинской науки, фармацевтики. До его появления все ориентировались только на пробу Манту. Но она мало информативна: реакция может свидетельствовать и о том, что прививка БЦЖ была пять лет назад, и о том, что ребенок встретился с инфекцией, и о том, что у него неспецифическая аллергия. Манту у многих была положительной. Мы профилактически лечили таких детей кучей таблеток, а толку было мало: реакция на пробу все равно оставалась положительной. Сейчас же мы сделали высокоспецифичный тест, который дает положительный результат только если у ребенка есть иммунитет на инфекционный возбудитель и при этом не реагирует на вакцину БЦЖ или нетуберкулезные бактерии. И теперь, когда в классе проводят тестирование, и у всех результат отрицательный, а лишь у одного положительный, его мама бегом бежит к врачам. А если не доверяет диаскинтесту, то может проверить наличие иммунного ответа на возбудитель туберкулеза лабораторным Т.СПОТ.ТБ тестом по анализу крови, который, к слову, также выпускают уже в России. Такой тест также используется у детей, которые страдают аллергией, или с сильно пониженным иммунитетом.

Вы имеете право гордиться достижениями вашей службы. А есть ли еще нерешенные проблемы, которые надо решить?

Валентина Аксёнова: Проблемы возникают постоянно. Появился ВИЧ, и мы видим, что половина таких больных умирает от туберкулеза. Да, специалистам удалось внедрить проведение во время беременности ВИЧ-инфицированным женщинам профилактики, и теперь рождаемость среди них растет, а ВИЧ-инфицированность детишек снизилась до минимума. На это ушло пять-семь лет. Но появился туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), и пока эту проблему мы все еще решаем. Потому что если ребенок находится в очаге с МЛУ туберкулезом, то он и заболевает именно таким туберкулезом. Вторая сторона этой проблемы — все новые препараты, которые применяются в лечении МЛУ, не разрешены для использования у детей. Мы вместе с родителями и с их согласия берем на себя ответственность — пересчитываем дозировки и лечим.

Причем мы согласуем этот подход и на международном уровне — рабочая группа по детскому туберкулезу есть и в ВОЗ, и мы каждый год встречаемся, хотя теперь онлайн. В частности, обсуждаем и проблему разработки детских дозировок, это проблема мировая. Наш институт первым в России включен в международное исследование. И вот недавно у нас был разрешен к применению для детей новый эффективный препарат, но пока только с 6 лет. Мы работаем вместе с нашей фармпромышленностью, и у нас очень хорошо идет разработка комбинированных препаратов для профилактического лечения, которое ежегодно получают до 200 тысяч детей. Еще одна острая проблема — нехватка детских санаториев: хорошие перепрофилировались в ковид-госпитали, плохие просто закрылись. Раньше были у нас лесные школы, профильные детские садики, теперь их нет, и детям некуда поехать, чтобы получать профилактическое лечение, потому что нужно вести его под контролем врачей, иначе бесполезно. Еще одна проблема — дети, которые по разным причинам получают иммуносупрессивную терапию. Мы посмотрели пятьсот таких детей и выявили среди них заболеваемость туберкулезом около 9%, потому что иммунитет у них подавляется, и они очень восприимчивы к любой инфекции. А если такой ребенок уже переболел туберкулезом раньше, нередко находим у него мелкий кальцинат в лимфоузлах. Это такой крошечный «камешек», внутри которого спит микобактерия. Она живет и ждет, когда наступит иммуносупрессия — тогда оболочка разваливается, и она прогрессирует в туберкулез. Это новая группа риска, такие дети сейчас не подлежат наблюдению у фтизиатра, не стоят на учете.

И я борюсь за то, чтобы эти группы неспецифического риска контролировать и выделять среди них детей наибольшего риска. Поверьте, это для нас поважнее пандемии.

У главного детского фтизиатра должны быть мечта. Какая?

Валентина Аксёнова: Мечта у меня есть: чтобы дети не болели. Когда я оказываюсь в тяжелые минуты в церкви, молюсь, чтобы наши дети не болели туберкулезом. Но дети заражаются только от взрослых, они не виноваты. А взрослый часто виноват сам, потому что ведет рискованный образ жизни, случайно инфицируются лишь единицы. Поэтому моя мечта: чтобы мы все ощущали ответственность за свое здоровье, и главное — за здоровье детей.

Диаграмма

Динамика заболеваемости детей и подростков туберкулезом (ед. на 100 тысяч человек возрастной группы)

Источник: Федеральный центр мониторинга туберкулеза, 2020

Автор: Татьяна Батенёва

О значимости вакцины БЦЖ — статьи от специалистов клиники «Мать и дитя»

«В 1921 году во Франции Кальметом впервые была использована вакцина БЦЖ для предупреждения туберкулеза у ребенка 6-ти лет. Дальнейшие наблюдения за этим ребенком в течение 5 лет показали, что туберкулезом он не заболел.

В СССР Вакцинация БЦЖ началась с 1926 года, вначале как научное изыскание.

К тридцатым — сороковым годам были закончены клинические наблюдения за вакцинированными БЦЖ детьми и контрольной группой детей, не получивших вакцину. Установили, что заболеваемость туберкулезом среди детей, получивших вакцину, в 7 раз меньше, чем у невакцинированных. Кроме того, если и появлялись случаи возникновения туберкулёза у привитых детей, то формы туберкулеза были не осложненными с благоприятным исходом.

Предполагались различные методы введения вакцины, в том числе и пероральный. В ходе научных работ установлен наиболее оптимальный способ введения вакцины — внутрикожный. К сожалению, длительность хранения вакцины была непродолжительной, что затрудняло её транспортировку в стране.

С 1937 года начались работы по изысканию методов по удлинению сроков хранения вакцины. В 62 году ВОЗ утвердила требования к сухой вакцине. Каждая страна выпускает вакцину БЦЖ с различным содержанием жизнеспособных микобактерий, участвующих в создании иммунитета. В Российской вакцине БЦЖ (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Н.Ф.) содержится 8 млн/мг живых бактерий. В прививочной дозе отечественной вакцины содержится 500-600 тысяч бактерий, способных к росту на питательных средах.

Клинические наблюдения за реакцией организма на вакцинацию БЦЖ подтверждены данными патоморфологов. Основные изменения развиваются в системе лимфатических узлов, ретикуло-эндотелиальном аппарате печени, селезенки и легких. Изменения в организме при введении вакцины начинаются в первые недели после вакцинации и нарастают через 3-4 месяца.

Через 4-6 недель после вакцинации на месте внутрикожного введения вакцины развивается специфическая реакция в виде инфильтрата диаметром 5-8 мм с небольшим узелком в центре. Узелок увеличивается в размерах, превращается в пустулу с казеозным содержимым. Пустула может вскрыться, выделяется капелька густого гноя — казеоза. Над вскрывшейся пустулой формируется геморрагическая корочка, под которой вновь накапливается казеоз. Через 2-3 дня корочка снимается, капелька казеоза удаляется. И так несколько раз. С каждым разом корочка становится меньше в диаметре, постепенно формируется поствакцинальный рубчик. У части детей (около 16% от всех привитых БЦЖ) рубчик не формируется, что обусловлено врожденными особенностями иммунитета. Но это не значит, что ребенок получивший вакцину БЦЖ, у которого в дальнейшем не сформировался поствакцинальный рубчик, не защищен от туберкулеза. Местная прививочная реакция не требует какого-либо вмешательства. У детей с нормальным иммунитетом вакцина БЦЖ не вызывает каких-либо патологий.

В настоящее время помимо вакцины БЦЖ с 1986 года используется вакцина БЦЖ-М для щадящей иммунизации. Эта вакцина отличается от вакцины БЦЖ тем, что в прививочной дозе содержится меньшее количество мертвых микробных тел, что способствует уменьшению неспецифического аллергического воздействия на организм человека.

С 2020 года планируется отмена ревакцинаций БЦЖ и БЦЖ-М в 7 лет и 14 лет. То есть ребенок должен быть привит от туберкулеза единожды, желательно в раннем детском возрасте».

Error (#2)

Уважаемые медики, то, о чем раньше ходили слухи теперь стало нашей реальностью — в связи со сложной эпидемиологической ситуацией правительство временно изменило порядок продления сроков лицензии на 2020 год. В соответствии с постановлением от 3 апреля 2020 г. № 440, в сферах деятельности, требующих обязательного разрешительного контроля, на один год продлевается действие лицензий, сертификатов, аккредитации, регистрации. Это правило действует в отношении разрешений, которые истекают или истекли в период с 15 марта по 31 декабря 2020 года.

ЧТО ЭТО ЗНАЧИТ?

До конца года введен мораторий на получение сертификата специалиста или свидетельства об аккредитации. Воспользоваться им вправе каждый медицинский работник, у которого истекает срок действия разрешающих документов в период с 15 марта по 31 декабря 2020 года.

Важно уточнить, что приказ Минздрава № 327н только предоставляет возможность отсрочить обязанность по сертификации и аккредитации специалиста на один год. Но по прошествии установленного времени медработник должен будет выполнить свои обязательства в полном объеме

КАЗАЛОСЬ БЫ, ОТЛИЧНЫЕ НОВОСТИ ДЛЯ МЕДИКОВ, В ТЕКУЩЕЕ НЕПРОСТОЕ ВРЕМЯ. ОТЧАСТИ – ДА, НО ВАЖНО УЧИТЫВАТЬ СЛЕДУЮЩЕЕ:

1 Гарантированное попадание в систему аккредитации.

Отказавшись от обучения в 2020 году, Вы гарантированно попадаете в систему аккредитации, так как сроки внедрения новой системы оценки компетенций никто не отменял и не переносил. Первые врачи, опробовавшие на себе работу новой системы, оказались, мягко говоря, недовольны ее работой и несогласованностью действий уполномоченных органов.

2 Огромные очереди и паралич образовательной системы.

Следствием этой отсрочки, будет являться коллапс образовательной системы дополнительного образования и аккредитационных центров. К примеру, 1 апреля у Вас кончается действие сертификата, продленного мораторием. У Вас сертификат, с которым Вы не можете работать. Вы обращаетесь в центр ДПО, но там Вам говорят, что ближайшая возможная дата июль-август, то есть 3-4 месяца Вы не сможете работать. Также важно понимать, что вся система прохождения аккредитации не отработана в самих аккредитационных центрах и наплыв обучающих может попросту парализовать работу центров.

3 Рост цен.

Как известно, когда вырастает спрос – вырастает и цена. В условиях всеобщей надобности образовательные центры начнут поднимать цены, не только с целью наживы, но и с целью снижения нагрузки. Многим придется сократить персонал в это непростое время и к обработке сверх объёмов многие окажутся попросту не готовы. Чтобы снизить спрос они будут вынуждены поднимать стоимость своих услуг. Сейчас же, многие учебные центры напротив снижают цены, пытаясь хоть как-то поддержать работников медицины. Это делаем и мы и ниже ознакомим Вас с нашим предложением.

ИТАК, ЧТО ЖЕ ВСЕ-ТАКИ ВЫБРАТЬ? МОРАТОРИЙ СЕЙЧАС И ОБУЧЕНИЕ ПОТОМ ИЛИ ПРОЙТИ ОБУЧЕНИЕ СЕЙЧАС?

МОРАТОРИЙ

Да, мораторий сейчас это небольшая передышка и возможность полностью сконцентрироваться на работе.

Единственный вопрос, какой ценой в будущем? Будет ли потом государство также лояльно к врачам, когда эпидемия стихнет, а действие приказа утратит свою силу или тысячи медиков, в одночасье, окажутся без прав на работу?

ПОЛУЧЕНИЕ СЕРТИФИКАТА

Обучение сейчас – это продление сертификата не на один год, как предлагает Минздрав, а на пять лет! И это гарантированные 5 лет, а не эфемерный год, который может закончиться вместе с пандемией. Получив сертификат сейчас, аккредитацию Вам потребуется проходить только в 2025 году, к тому времени уже будет отработан процесс работы аккредитационных центров и все процедуры будут проходить в штатном режиме, в отличие от 2021 года, в котором будет тотальная неразбериха и огромные очереди из врачей, воспользовавшихся мораторием Минздрава. Мы прогнозируем задержку с прохождением сертификации в 2-3 месяца

Еще одним неочевидным и важным преимуществом получения сертификата сейчас является прописанное в приказе право работать в 2020 году лишь на основании документов. То есть, если врач проходит профессиональную переподготовку, он сразу же может приступить к практической деятельности, без обязательного прохождения аккредитации! Вы можете пройти курс ПП и начать практиковать практически сразу же! Пожалуй, такой возможности не будет больше никогда. Если Ваша специализация не так востребована в текущих реалиях – это отличны шанс для Вас дать карьере новый виток!

ИТОГО

Резюмируя все вышесказанное, каждый медработник может воспользоваться предлагаемой отсрочкой, если в текущих жизненных обстоятельствах для него это наиболее оптимальный вариант. Но, если действие Вашего сертификата заканчивается в 2020 – 2021 годах, как ни крути, лучшим вариантом для Вас будет получение сертификат именно в 2020 году.

Национальный календарь профилактических прививок

Контингенты, подлежащие прививкам	Наименование прививки	Сроки вакцинации	Сроки ревакци-нации
Население, проживающее на энзоотичных по туляремии территориях, а также при- бывшие на эти территории лица, выполняющие следующие работы: — сельскохозяйственные, гидромелиоративные, строительные, другие работы по выемке и перемещению грунта, заготовительные, промысловые, геологические, изыскательские, экспедиционные, дератизационные и дезинсекционные; — по лесозаготовке, расчистке и благоустройству леса, зон оздоровления и отдыха населения. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя туляремии	Против туляремии	С 7 лет (с 14 лет в очагах полевого типа)	Через каждые 5 лет
Население, проживающее на энзоотичных по чуме территориях. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя чумы	Против чумы	С 2 лет	Через 1 год
Лица, выполняющие следующие работы: — по заготовке, хранению, обработке сырья и продуктов животноводства, полученных из хозяйств, где регистрируются заболевания скота бруцеллезом; — по убою скота, больного бруцеллезом, заготовке и переработке полученных от него мяса и мясопродуктов. Животноводы, ветеринарные работники, зоотехники в хозяйствах, энзоотичных по бруцеллезу. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя бруцеллеза	Против бруцеллеза (козье овечьего типа)	С 18 лет	Через 1 год
Лица, выполняющие следующие работы на энзоотичных по сибирской язве территориях: — сельскохозяйственные, гидромелиоративные, строительные, по выемке и перемещению грунта, заготовительные, промысловые, геологические, изыскательские, экспедиционные; — по заготовке, хранению и переработке сельскохозяйственной продукции; — по убою скота, больного сибирской язвой, заготовке и переработке полученных от него мяса и мясопродуктов. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя сибирской язвы	Против сибирской язвы	С 14 лет	Через 1 год
Лица, выполняющие работы по отлову и содержанию безнадзорных животных. Ветеринары, охотники, лесники, работники боен, таксидермисты. Лица, работающее с «уличным» вирусом бешенства	Против бешенства	С 16 лет	Через 1 год, далее через каждые 3 года
Лица, выполняющие следующие работы: — по заготовке, хранению, обработке сырья и продуктов животноводства, полученных из хозяйств, на энзоотичных по лептоспирозу территориях; по убою скота, больного лептоспирозом, заготовке и переработке полученных от него мяса и мясопродуктов; — по отлову и содержанию безнадзорных животных. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя лептоспироза	Против лептоспироза	С 7 лет	Через 1 год
Население, проживающее на энзоотичных по клещевому энцефалиту территориях, а также прибывшие на эти территории лица, выполняющие следующие работы:- сельскохозяйственные, гидромелиоративные, строительные, по выемке и перемещению грунта, заготовительные, промысловые, геологические, изыскательские, экспедиционные, дератизационные и дезинсекционные; — по лесозаготовке, расчистке и благоустройству леса, зон оздоровления и отдыха населения. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя клещевого энцефалита	Против клещевого энцефалита	С 4-х лет	Через 1 год, далее через каждые 3 года
Лица, выполняющие работы по заготовке, хранению, обработке сырья и продуктов животноводства, полученных из хозяйств, где регистрируются заболевания лихорадкой Ку скота. Лица, выполняющие работы по заготовке, хранению и переработке сельскохозяйственной продукции на энзоотичных территориях по лихорадке Ку. Лица, работающие с живыми культурами возбудителей лихорадки Ку	Против лихорадки Ку	С 14 лет	Через 1 год
Лица, выезжающие за рубеж в энзоотичные по желтой лихорадке районы. Лица, работающие с живыми культурами возбудителя желтой лихорадки	Против желтой лихорадки	С 9 месяцев	Через 10 лет
Население, проживающее на территориях с высоким уровнем заболеваемости брюшным тифом. Население, проживающее на территориях при хронических водных эпидемиях брюшного тифа. Лица, занятые обслуживанием канализационных сооружений, оборудования, сетей, выезжающие в гиперэндемичные по брюшному тифу регионы и страны, а также контактным в очагах по эпидпоказаниям. Лица, работающие с живыми культурами возбудителей брюшного тифа	Против брюшного тифа	С 3-х лет, в зависи- мости от вакцин	Через 3 года
Дети, подростки, взрослые в очагах менингококковой инфекции, вызванной менингококком A или C серогруппы. Лица повышенного риска заражения (дети из ДДУ, учащиеся 1 — 2 класса школ, подростки из организованных коллективов, объединенные проживанием в общежитиях, дети из семейных общежитий, размещенных в неблагополучных санитарно-гигиенических условиях) при увеличении заболеваемости в 2 раза по сравнению с предыдущим годом	Против менингококковой инфекции	С 1 года	Через 3 года
Дети, проживающие на территориях с высоким уровнем заболеваемости гепатитом A. Медицинские работники, воспитатели и персонал детских дошкольных учреждений. Работники сферы обслуживания населения, прежде всего занятые в организациях общественного питания, по обслуживанию водопроводных и канализационных сооружений, оборудования и сетей. Выезжающие в гиперэндемичные по гепатиту A регионы и страны, а также контактные в очагах по эпидпоказаниям	Против вирусного гепатита A	С 3-х лет
Дети и взрослые, в семьях которых есть носитель HBsAg или больной хроническим гепатитом B. Дети домов ребенка, детских домов и интернатов. Дети и взрослые, регулярно получающие кровь и ее препараты, а также находящиеся на гемодиализе и онкогема тологические больные. Лица, у которых произошел контакт с материалом, инфицированным вирусом гепатита B. Медицинские работники, имеющие контакт с кровью больных. Лица, занятые в производстве иммунобиологических препаратов из донорской и плацентарной крови. Студенты медицинских институтов и учащиеся средних медицинских учебных заведений (в первую очередь выпускники). Лица, употребляющие наркотики инъекционным путем	Против вирусного гепатита B	В любом возрасте
Лица старше 60 лет, лица, страдающие хроническими соматическими заболеваниями, часто болеющие ОРЗ, дети дошкольного возраста, школьники, медицинские работники, работники сферы обслуживания, транспорта, учебных заведений	Против гриппа	С 6-мес. возраста	Ежегодно
Контактные в очагах эпидемического паротита, ранее не привитые и не болевшие	Против эпидемического паротита	С 1 года
Контактные в очагах кори, ранее не привитые и не болевшие	Против кори	С 1 года
Контактные в очагах дифте- рии, ранее не привитые	Против дифтерии	С 3-х месяцев
Лица, выезжающие в неблагополучные по холере страны (по согласованию с Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России). Население приграничных районов России, в случае возникновения неблагополучной по холере эпидобстановке на сопредельной территории (по решению Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России)	Против холеры	С 2-х лет	Через 6 месяцев

Туберкулез у детей и подростков

 

  Проблемы противотуберкулезной помощи детям тесно связаны со сложившейся эпидемической ситуацией, которая в России с 1991 г. остается напряженной, несмотря на стабилизацию в последние годы. Анализ причин этой ситуации убедительно продемонстрировал, что борьба с туберкулезом – это не только медицинская проблема, во многом она определяется социальными условиями жизни общества, семьи. Семья как часть общества не может быть в стороне от этих проблем. Это обусловлено, с одной стороны, тем, что ответственность  за здоровье ребенка несут родители, с другой стороны, наиболее частым источником заражения детей являются члены семьи.

  Туберкулез известен со времен египетских пирамид, эта болезнь сопровождала человечество всегда. Впервые симптоматику описал Али Ибн Сина. Но ошибся, считая, что это наследственное заболевание. Туберкулез- это инфекция, от которой нельзя застраховаться никому.

  Возбудитель заболевания —  микобактерия туберкулеза – был открыт Робертом Кохом в 1882 году. Ее назвали “палочкой Коха”, но сейчас можно встретить сокращенное название: МБТ или БК. Микобактерии широко распространены в природе. Это полиморфные палочки устойчивые к кислотам, щелочам и спирту. Они сохраняют жизнеспособность при воздействии различных физических и химических агентов. В невысохшей мокроте (при определенных условиях) МБТ могут оставаться жизнеспособными до полугода. А в высохшей мокроте на различных предметах ( мебель, книги, посуда, постельное белье, полотенца, пол, стены и т.д.) они могут сохранять свои свойства в течении нескольких месяцев. В комнате, где больной туберкулезом, например чихнул, микобактерии часами могут находиться в воздухе.

  Особенность  туберкулеза у детей и подростков в том, что они заражаются от взрослых. Поэтому хочется сказать о том, как предупредить развитие заболевания. В профилактической работе выделяется 2 направления: специфическая профилактика            ( иммунизация вакциной БЦЖ, превентивная химиотерапия) и неспецифическая профилактика ( санитарно- просветительная работа). Иммунизация вакциной БЦЖ проводится в род. доме, первая прививка делается новорожденным на 3-7 сутки. Ревакцинация БЦЖ (повторная прививка) проводится в 7 и 14 лет по показаниям. Противопоказаниями к прививке против туберкулеза являются только те состояния ребенка, при которых повышается риск развития осложнений. Их не много: вес ребенка менее 2000 г, острые проявления любых заболеваний и обострения хронических; врожденный первичный иммунодефицит, злокачественные новообразования, прием препаратов снижающих иммунитет и лучевой терапии. Если ребенок инфицирован, то ревакцинацию в 7 лет ему не проводят. Иммунизация вакциной БЦЖ проводится, во-первых, для формирования иммунитета, во-вторых, создают резистентность по отношению к возбудителю. Приобретенный в результате вакцинации иммунитет не постоянен. Искусственный иммунитет со временем ослабевает, и поэтому имеется необходимость в периодической ревакцинации.  Микобактерии штамма БЦЖ удовлетворяют требованиям, предъявляемым к вакцинному туберкулезному штамму, они безвредны, специфичны, аллергогенны, и иммуногены. Вакцина БЦЖ признана во всем мире. Таким образом, основное профилактическое средство от туберкулеза – прививка вакциной БЦЖ. Дети, привитые от туберкулеза, болеют в 15 раз реже и значительно легче, чем не привитые. Прививка защищает, прежде всего,  от туберкулезного менингита и тяжелых распространенных форм болезни. 

  Если ребенок не был привит в роддоме, прививка проводится в поликлинике после снятия противопоказаний. До прививки и на период выработки иммунитета (2 мес.) необходимо ограничить круг взрослых, общающихся с ребенком и провести их обследование на туберкулез (флюорография). Если ребенок не привит до 6 мес. возраста, то важно в 6 мес. Провести ему туберкулиновую пробу Манту и если она будет положительная проконсультировать у фтизиатра. Так же хотелось бы сказать о том,  что многих родителей пугает “язвочка” на месте прививки. Не пугайтесь!!! На месте введения вакцины постепенно (в течение 4-6 недель) возникают воспалительные изменения, иногда образуется небольшая язвочка. Это нормальное течение вакцинного процесса, не требующее никаких вмешательств.

  Отдельно хочется сказать о том, что дети  с хроническими заболеваниями нуждаются в вакцинации больше, чем здоровые, т. к.  вакцинный процесс протекает, как правило, легко, незаметно для организма, а течение туберкулеза у таких детей. чаще всего, тяжелое и требует значительных усилий медицинских работников и самого больного на пути к выздоровлению. При решении вопроса о выборе прививки о проведении прививки этим детям важно правильно выбрать период, обеспечивающий безопасную вакцинацию (отсутствие обострения хронического заболевания)

   К сожалению, родители определяют свое отношение к профилактическим противотуберкулезным мероприятиям на основании материалов в средствах массой информации, которые представлены не специалистами в области фтизиатрии.  У иммунизированных вакциной БЦЖ детей даже в случаях заболевания туберкулезом течение болезни значительно легче.

  К сожалению, родители отказываются не только от вакцинации, но и от проведения туберкулинодиагностики. Туберкулиновая проба Манту, в простонародии “пуговка” – это специфический диагностический тест, применяемый при массовом обследовании населения на туберкулез. Хотелось бы обратить внимание, что проба Манту-  это не прививка, как считают многие родители, она не содержит живых или убитых микобактерий туберкулеза. Первоочередной задачей массовой туберкулинодиагностики является выделение из общего числа обследованных лиц наиболее угрожаемых по развитию туберкулеза и нуждающихся в рентгелогическом обследовании.  К таким лицам относятся дети и подростки в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции (впервые положительная реакция на пробу Манту с 2 ТЕ, не связанная с иммунизацией против туберкулеза). Требуют внимания пациенты с усиливающейся реакцией на туберкулин (увеличение инфильтрата на 6 мм и более за последний год или постепенное в течение нескольких лет), гиперергической чувствительностью к туберкулину (наличие инфильтрата размером 17 мм и более или любого размера с везикуло-некротической реакцией, регионарным лимфоаденитом или лимфангоита). Таким образом проведение пробы Манту необходимо для: выявления больных туберкулезом; выявления лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза; отбор детей для ревакцинации против туберкулеза.

 От заболевания туберкулезом не застрахован никто!!!  Чем раньше поставлен диагноз, тем лучше прогноз. Поэтому, чтобы обезопасить своего ребенка от этого заболевания, которое может протекать в хронической форме, необходимо, в первую очередь проводить вакцинацию БЦЖ, а  с целью раннего выявления туберкулеза необходимо ежегодное проведение туберкулиновых проб (реакции Манту 2 ТЕ).

   Уважаемые родители! Здоровье ваших детей в ваших руках!

О пробе Манту — T‑SPOT.TB

О ПРОБЕ МАНТУ

Долгое время единственным тестом для скрининга была кожная проба Манту. В настоящее время ее проводят детям до 7 лет, т.к. в 7 лет  решается  вопрос о повторной ревакцинации БЦЖ и проводится она детям, не  инфицированным туберкулезом с отрицательной пробой Манту.

Вакцина БЦЖ (бациллы Кальметта-Герена) существует на протяжении 80 лет и является одной из наиболее широко используемых из всех существующих в настоящее время вакцин, охватывая более 80% новорожденных и детей грудного возраста в странах, где она является компонентом национальной программы иммунизации детей. Вакцина БЦЖ  не предотвращает первичного инфицирования и, что более важно, не предотвращает реактивацию латентной легочной инфекции, являющейся основным источником бациллярного распространения среди населения.  Вакцина БЦЖ только снижает вероятность перехода инфицирования в болезнь. А основной смысл постановки БЦЖ в том, чтобы инфицированные туберкулезом маленькие дети, в случае если инфицирование перейдет в болезнь, не заболели тяжелейшими формами туберкулеза, такими как туберкулезный менингит и диссеминированный туберкулез, когда в болезнь вовлечен весь организм. Такие формы туберкулеза калечащие, а чаще даже смертельны.

Как и любой иммунологический тест  — проба Манту проводится у детей ежегодно.
Принцип реакции Манту состоит во внутрикожном введении в человеческий организм малых доз туберкулина — антигена, полученного из микобактерии туберкулеза, и наблюдения за местной реакцией.

В месте введения препарата в кожу возникает специфическое воспаление, вызванное инфильтрацией лимфоцитами. Но в игру вступают не все Т-лимфоциты, а только те, что уже «знакомы» с палочкой Коха. 

 

 

Противопоказания к проведению реакции Манту:

• кожные заболевания;
• обострение хронических инфекционных заболеваний;
• острые соматические заболевания;
• аллергические реакции и состояния, в том числе бронхиальная астма;
• эпилепсия.

С учетом вышеперечисленных факторов сама по себе положительная реакция Манту не является 100% доказательством инфицирования туберкулезом и имеет  ограничения для постановки.

Недостатки кожных туберкулиновых проб:

• требуется  два посещения врача;
• на результаты кожных проб влияет предшествующая вакцинация БЦЖ
• наличие  иммуносупрессии у пациента может привести к отсутствию кожного иммунного ответа
• субъективность оценки, связанная с техникой выполнения инъекции и последующей интерпретации результатов;
• необходимо соблюдать определенный режим (не рекомендуется соприкосновение с водой) в течение 72 часов;
• частые побочные эффекты, особенно у детей: головная боль и головокружение, подъем температуры до 40°С, лихорадка, рвота, аллергические высыпания на коже, аллергический отек, приступы астмы, зуд в месте инъекции;
• противопоказаны пациентам с распространенными кожными заболеваниями, пациентам с эпилепсией, пациентам при аллергических состояниях и при острых и хронических инфекционных  и соматических  заболеваниях в стадии обострения.

T-SPOT.TB  представляет собой уникальный тест, предназначенный для обследования  на туберкулез, который может быть выполнен во время одного посещения врача.

T-SPOT.TB является единственным анализом крови для диагностики туберкулеза, который обладает более чем 95%-ной чувствительностью и специфичностью, а также надежностью в диагностике туберкулезной инфекции у пациентов различных групп, подтвержденными результатами многочисленных  клинических исследований. 

На результат теста T-SPOT.TB не влияет предшествующая вакцинация БЦЖ и/или наличие иммуносупрессии у пациента.

Вакцинация Ярославль

Стоимость вакцинации в медицинском центре  в разделе услуги.            Вакцинация Ярославль

Возраст	24 ч.	3‑7 дн.	1 мес.	2 мес.	3 мес.	4,5 мес.	6 мес.	7 мес.	9 мес.	12 мес.	18 мес.	20 мес.	2 года	6 лет	7 лет	13 лет	14 лет
Туберкулез
Коклюш, дифтерия, столбняк					1	2	3				1				2*		3*
Полиомиелит					1	2	3				1	2					3
Корь, краснуха, паротит														1		*
Гепатит В	1		2	3			3									*
Грипп							*
Гемофильная инфекция					1	2	3
Пневмококковая инфекция								1*	2				1*
Возраст	24 ч.	3-7 дн.	1 мес.	2 мес.	3 мес.	4,5 мес.	6 мес.	7 мес.	9 мес.	12 мес.	18 мес.	20 мес.	2 года	6 лет	7 лет	13 лет	14 лет

Обозначения:

Вакцинация

Ревакцинация

Вакцинация с особыми условиями

в 6 месяцев — вакцинация от гриппа с этого возраста проводится ежегодно

в 7 месяцев — вакцинация от пневмококковой инфекции проводится вакциной Превенар13

в 2 года — вакцинация от пневмококковой инфекции проводится ранее не привитым детям вакциной Пневмо23

в 7 лет — вторая ревакцинация проводится против дифтерии и столбняка, без компонента кори, вакциной АДС

в 13 лет — вакцинация против краснухи проводится только девочкам

в 13 лет — вакцинация против гепатита В проводится ранее не привитым

в 14 лет — вторая ревакцинация проводится против дифтерии и столбняка, без компонента кори, вакциной АДС

Вопрос вакцинации во все времена вызывал множество волнений и вопросов у родителей детей. Почему же необходимо так важно прививаться? К сожалению, в наше время в мире имеются определенные заболевания, с которыми наш организм не в состоянии справиться самостоятельно без пагубных влияний на здоровье. На сегодняшний день удалось ликвидировать только одну из страшнейших – натуральную оспу, чем в 70-х годах заявила ВОЗ.

На нынешний момент одним из эффективных способов защитить здоровье как ребенка, так и взрослого от большинства инфекционных заболеваний, является вакцинация. Опыт предыдущих лет и многочисленные исследования показывают, что наибольшее количество заболевших – это именно пропустившие в срок или вовсе непривитые люди. Так, например, в восьмидесятые годы многочисленные отказы от применения вакцинации против дифтерии явили собой страшнейшую эпидемию данного заболевания в стране. Было инфицировано более ста тысяч человек, погибло несколько тысяч. Вакцинация Ярославль с целью профилактики представляет собой внедрение в человеческий организм специальных лекарственных средств для создания индивидуального иммунитета и высокого отрицания восприимчивости к различного рода инфекциям и болезням. К сожалению, у маленьких детей, особенно в самом начале жизни, собственный иммунитет не сформировался. В виду этого для малыша очень велик риск заражения какой-либо инфекцией с последующими серьезными осложнениями. Прививки помогут защитить организм ребенка от страшнейших заболеваний, формируя у него стойкий иммунитет к инфекции. Стоит отметить, что прививка гораздо безопаснее, чем перенесенное само заболевание. И далеко не факт, что после него ребенок останется абсолютно здоровым, и не проявятся какие-либо последствия во взрослой жизни.

В нашем медицинском центре мы предлагаем вам пройти иммунизацию детей, которая проводится на основе Национального календаря профилактических прививок Российской Федерации на основе приказа Министерства здравоохранения РФ No 673 от 30 октября 2007 года. Мы вакцинируем своих клиентов прививками зарубежного производства, которые прошли регистрацию в Российской Федерации и полностью разрешенные к применению согласно необходимых документов и постановлений. Эффективность этих прививок проверена и доказана научно.

Перед любой прививкой наши специалисты проводят обязательный осмотр ребенка. Каждый врач руководствуется перечнем медицинских противопоказаний, который утверждается федеральным органом исполнительной власти в области здравоохранения. У каждой вакцины имеется инструкция, которую также учитывает каждый врач. Перед вакцинацией родителям стоит поинтересоваться у врача о проявляемых реакциях и сроках на прививку, что нужно принимать в таких случаях и куда обращаться за медицинской помощью в случае осложнений.

Наш персонал обеспечивает сопровождение своих клиентов в муниципальные учреждения на осуществление пробы Манту и Диаскинтест. Кроме того, мы проводим ревакцинацию БЦЖ и БЦЖ-М. Эти прививки являются защитой от первичных форм туберкулеза и  осуществляются внутрикожно.

Мы осуществляем вакцинацию несовершеннолетних детей исключительно с согласия родителей или их законных представителей, и только на основе Федерального закона «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» No 157-ФЗ. Каждому родителю стоит помнить о том, что окончательное решение на вакцинацию вашего ребенка остается за вами, вы имеете на это полное право. Но, принимая важное решение об отказе в вакцинации, вы подвергаете риску здоровье вашего малыша. Кроме того, вы рискуете получить отказ от посещения вашим ребенком различных образовательных и оздоровительных учреждений, особенно при возникновении массовых заболеваний или угрозы эпидемии.

Помните, что родители — это первые люди, которые в ответе за своих детей. Правильный образ жизни, профилактика заболеваний и своевременное лечение — основа здоровья вашего малыша!

Названия прививок	Инфекции, от которых проводится вакцинация
Аваксим 80 (гепатит А, детская) (Франция)	Профилактика гепатита А
АДС (РФ)	Комплексная профилактика столбняка, дифтерии
АДС-М (РФ)	Комплексная профилактика столбняка, дифтерии
АКДС (РФ)	Комплексная профилактика столбняка, дифтерии, коклюша
Ваксигрипп (Франция)	Профилактика гриппа
Варилрикс (Бельгия) живая	Профилактика ветряной оспы
Гемофильная инфекция-АКТ-ХИБ (Франция) с 2 мес. до 5 лет	Профилактика гнойно-септических заболеваний: артрит, эпиглотит, менингит, сепсис,    пневмония
Гемофильная инфекция-Хиберикс (Бельгия) с 1,5 мес. до 5 лет	Профилактика гнойно-септических заболеваний: менингит, сепсис, артрит, эпиглотит, пневмония
Имовакс Полио (Франция) (инактивированная) с 3 мес.	Профилактика полиомиелита
Имовакс Полио, р-р для в/м и п/к введ. 0.5 мл/доза, 1 доз, амп., 0.5 мл, пач. Картон. (Франция)	Профилактика полиомиелита
Инфанрикс (Бельгия) с 3 мес. До 3 лет 11 мес. 29 дней	Профилактика коклюша, дифтерии, столбняка
Инфанрикс Гекса (Бельгия)	Профилактика 6 наиболее опасных заболеваний у детей: коклюш, дифтерия, столбняк, полиомиелит, гепатит В, гемофильная инфекция
Инфлювак (Нидерланды)	Профилактика заболеваний различных видов гриппа
Клещевой энцефалит ЭнцеВир (РФ)	Профилактика заболевания вирусом клещевого энцефалита
Комбиотех против гепатита В детская (РФ)	Профилактика гепатита В
Окавакс (Япония)	Профилактика ветряной оспы у детей от года, которые не привиты и не болели ранее. Также для взрослых людей, находящихся в закрытых коллективах (воинские части, интернаты)
Паротитно-коревая культуральная живая вакцина (РФ)	Профилактика паротита и кори, проводимая детям двукратно в возрасте 12 месяцев и 6 лет, не имеющих данных заболеваний ранее
Пентаксим (Франция)	Вакцина комбинированная для профилактики 5 наиболее опасных детских заболеваний: дифтерия, столбняк, коклюш, полиомиелит, гемофильная инфекция. Назначается детям с 2 месяцев (по рекомендации ВОЗ)
Полиомиелитная пероральная вакцина 1, 2 и 3 типов, р-р для приема внутрь 0.1 мл/доза, 10 доз, фл. (РФ)	Профилактика полиомиелита
Полиорикс (Бельгия) инактивированная	Профилактика полиомиелита
Превенар 13 (США) –пневмококковая полисахаридная конъюг-ая адсорбированная, тринадцативалентная 0,5 мл	Профилактика пневмонии и других легочных инфекций
Приорикс (Бельгия) живая	Профилактика кори, эпидечического паротита, краснухи
Регевак (РФ) детская	Профилактика гепатита В
ФСМЕ-ИММУН Джуниор (Австрия) с 12-месячного возраста до 16 лет	Профилактика клещевого энцефалита
ФСМЕ-ИММУН Инжект (Австрия)	Профилактика клещевого энцефалита
Хаврикс (Бельгия) инактивированная сезонная акция	Профилактика гепатита А
Энджерикс (взрослый) (Бельгия)	Профилактика гепатита В
Энджерикс В (Бельгия) с рождения и до 19 лет	Профилактика гепатита В
Эувакс (Франция)	Профилактика гепатита В

 

Безопасность ревакцинации БЦЖ: систематический обзор

Вступление: Ревакцинация вакциной Bacillus Calmette-Guérin (БЦЖ) обычно не рекомендуется из-за отсутствия доказанной эффективности повторных доз для защиты от туберкулеза. Однако растет интерес к использованию вакцины БЦЖ из-за ее «нецелевых» эффектов, которые могут включать ревакцинацию. Мы провели систематический обзор безопасности ревакцинации БЦЖ.

Методы: Был проведен поиск в MEDLINE (с 1946 по март 2020 года) и в Атласе мира BCG (обновлен в 2017 году), ограничившись исследованиями введения БЦЖ внутрикожным или чрескожным путем. Были рассмотрены нежелательные явления, а также характеристики пациентов и вакцины.

Полученные результаты: В результате поиска было выявлено 388 статей, 24 из которых соответствовали критериям включения.Они сообщили о 22 исследованиях, включающих восемь рандомизированных исследований, четыре исследования «случай-контроль», четыре обсервационных исследования и шесть серий случаев или отчетов. В целом, были доказательства небольшого увеличения частоты легких местных и системных реакций. У иммунокомпетентных лиц не было зарегистрировано серьезных побочных эффектов.

Выводы: На сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что ревакцинация вакциной БЦЖ сопряжена с минимальным риском.В будущих исследованиях вакцины БЦЖ для новых применений должны быть представлены данные о побочных эффектах, стратифицированные по предыдущему прививочному статусу БЦЖ.

Ключевые слова: Неблагоприятные события; Bacillus Calmette-Guérin; Нецелевые эффекты; Безопасность; Туберкулез.

Ревакцинация медицинских работников БЦЖ в Бразилии для улучшения врожденного иммунного ответа против COVID-19: структурированное резюме протокола исследования для рандомизированного контролируемого исследования | Испытания

Цели

Вакцина БЦЖ, широко используемая в Бразилии для новорожденных, обеспечивает адъювантную защиту от ряда заболеваний, включая детские вирусные инфекции.БЦЖ активирует моноциты и NK-клетки врожденной памяти, которые имеют решающее значение для противовирусного иммунного ответа. Следовательно, следует применять стратегии профилактики COVID-19 у медицинских работников (HW), чтобы предотвратить их недомогание, чтобы они могли продолжать работать во время пандемии. Гипотеза заключается в том, что БЦЖ улучшит врожденный иммунный ответ и предотвратит симптоматическую инфекцию или тяжесть COVID-19.

Основная цель — проверить эффективность и безопасность вакцины БЦЖ для предотвращения или снижения заболеваемости тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом-2 (SARS-CoV-2), в городе Гояния (Бразилия) среди HW, ранее вакцинированных вакциной. БЦЖ, а также ее тяжесть и смертность во время пандемии заболевания.

Вторичные цели — оценить заболеваемость COVID-19 среди этих специалистов и врожденный иммунный ответ, вызванный БЦЖ.

Дизайн исследования

Это испытание фазы II по изменению позиции БЦЖ в качестве превентивной стратегии против COVID-19.

Это открытое рандомизированное клиническое испытание в параллельных группах, сравнивающее HW, вакцинированных БЦЖ, и HW, не вакцинированных.

Участники

В испытании будет набрано 800 HW из Гоянии — Гояс, Бразилия, чтобы достичь в общей сложности 400 HW, включенных после опроса о сопутствующих заболеваниях и лабораторной оценки.

Критерии отбора: Любой HW, имеющий шрам от вакцинации БЦЖ, при непосредственном контакте с пациентами с подозрением на COVID-19 в течение не менее 8 часов в неделю, будь то на больничных койках, в отделении интенсивной терапии, во время транспортировки или госпитализации (медсестры, врачи, физиотерапевты, диетологи, администраторы). и т. д.) с отрицательным тестом на IgM и IgG COVID-19.

Исключаются участники с любой из следующих характеристик:

— имели в течение последних пятнадцати дней какие-либо признаки или симптомы вирусной инфекции, включая COVID-19;

— За последние пятнадцать дней лихорадка;

— были вакцинированы за пятнадцать дней до включения;

— иметь в анамнезе или подтверждении наличие какого-либо иммунодепрессивного заболевания, такого как ВИЧ, представленных солидной опухолью за последние два года или аутоиммунных заболеваний;

— Вы проходите профилактическое лечение антибиотиками, стероидными противовоспалительными средствами или химиотерапией;

— иметь менее 500 нейтрофилов на мл крови;

— ранее были диагностированы туберкулез;

— Вы кормите грудью или беременны;

— Моложе 18 лет;

— Вы участвуете в этом клиническом исследовании в качестве исследователя.

Вмешательство и средство сравнения

HW будет рандомизировано в группу, вакцинированную БЦЖ, или в контрольную группу, не вакцинированную БЦЖ.

Группа, вакцинированная БЦЖ, получит в правую руку, внутрикожно, разовую дозу 0,1 мл, что соответствует приблизительно 2 x10 ⁵ -8 x10 ⁵ КОЕ живой, лиофилизированной, аттенуированной вакцины БЦЖ Москва 361-I , Вакцина Bacillus Calmette Guerin (Институт сыворотки Индии PVT. LTD.).

Невакцинированная контрольная группа не будет вакцинирована.

HW, выделенное в обеих группах, будет отслеживаться в определенные моменты времени до 180 дней после включения.

Привитые и контрольные группы будут сравниваться в соответствии с исходами, связанными с COVID-19.

Основные результаты

Основными исходами являются коэффициент заболеваемости SARS-CoV-2, определенный с помощью ОТ-ПЦР мазка из носоглотки или теста на IgG и IgM быстрого бокового потока, а также наличие общих симптомов COVID-19, тяжесть заболевания и госпитализация в течение 180 дней наблюдения.

Вторичным исходом является врожденный иммунный ответ, возникающий через 15-20 дней после вакцинации.

Рандомизация

Флакон с вакциной содержит примерно 10 доз. Для оптимизации использования вакцины рандомизацию проводили блоками по 20 участников с использованием платформы randomization.com [http://www.jerrydallal.com/random/permute.htm].

Рандомизация была подготовлена ​​до включения любого HW. Результаты были распечатаны и вложены в запечатанные конверты, пронумерованные от BCG-001 до BCG-400.На распечатанных результатах и ​​на конвертах были одинаковые номера. Во время рандомизации каждый участник, отвечающий критериям включения, получит последовательный номер участника [BCG-001-BCG-400]. Запечатанный конверт с присвоенным номером, закрытый для исследователей, будет открыт перед участником, и будет известно расположение рук.

Ослепление (маскирование)

Нет маскировки для участников или для медицинских работников.

Исследование будет закрыто для лабораторных исследователей и тех, кто будет оценивать результаты и проводить статистический анализ.В этом случае будет доступен только идентификационный номер участника.

Числа для рандомизации (размер выборки)

Четыреста медицинских работников будут рандомизированы в две группы. Двести участников будут вакцинированы, а 200 участников вакцинированы не будут.

Статус исследования

Протокол, утвержденный Бразильским этическим комитетом, является седьмой версией, номер CAAE: 31783720.0.0000.5078. В суд набираются с 20 сентября , 2020.Протокол клинического исследования был зарегистрирован 5 августа ^-го , 2020. Предполагается, что набор завершится к марту 2021 года.

Регистрация исследования

Номер протокола был зарегистрирован 5 августа ^-го , 2020 в REBEC (Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos). Регистрационный номер: RBR-4kjqtg и регистрационный номер исследования ВОЗ UTN: U1111-1256-3892.

Полный протокол

Полный протокол прилагается в виде дополнительного файла, доступного на веб-сайте испытаний (дополнительный файл 1).В интересах ускорения распространения этого материала привычное форматирование было удалено; это письмо представляет собой краткое изложение ключевых элементов полного протокола.

Клофазимин повышает эффективность ревакцинации БЦЖ с помощью Т-клеток памяти, подобных стволовым клеткам

Abstract

Туберкулез (ТБ) — одна из самых смертоносных болезней, ежегодно уносящая около 2 миллионов смертей во всем мире. Большинство людей в эндемичных по ТБ регионах вакцинированы вакциной Bacillus Calmette Guerin (BCG) , которая является единственной доступной вакциной.БЦЖ эффективна против менингеального и диссеминированного туберкулеза у детей, но защитные реакции относительно недолговечны и не защищают от легочного туберкулеза у взрослых. Продолжительность эффективности вакцины в решающей степени зависит от количества T-клеток центральной памяти (T _CM ), основным источником которых являются стволовые клетки памяти T (T _SM ). Эти клетки T _SM проявляют повышенную способность к самообновлению, а также быстро реагируют на антиген и генерируют защитные полифункциональные Т-клетки, продуцирующие IFN-γ, TNF-α, IL-2 и IL-17.Теперь очевидно, что Т-хелперные клетки Th 1 и Th27 необходимы для защиты хозяина от ТБ. Недавние сообщения показали, что клетки Th27 сохраняют молекулярную сигнатуру клеток T _SM , которые в конечном итоге дифференцируются в эффекторные клетки, продуцирующие IFN-γ. БЦЖ неэффективна для индукции ответа клеток Th27, что может объяснить ее неадекватную эффективность вакцины. Здесь мы показываем, что ревакцинация БЦЖ наряду с лечением клофазимином способствует дифференцировке T _SM , которая непрерывно восстанавливает T _CM и эффекторные клетки памяти T (T _EM ) и резко увеличивает эффективность вакцины у животных, примированных БЦЖ.Анализ этих клеток T _SM показал, что они преимущественно являются предшественниками защитных клеток хозяина Th2 и Th27. Взятые вместе, эти результаты показали, что лечение клофазимином во время ревакцинации БЦЖ обеспечивает превосходную защиту хозяина от туберкулеза за счет увеличения длительно сохраняющихся клеток T _SM .

Информация об авторе

Туберкулез (ТБ) — одна из самых смертоносных болезней, ежегодно уносящая около 2 миллионов смертей во всем мире. Bacillus Calmette Guerin (БЦЖ) — единственная доступная вакцина, которая эффективна против менингеального и диссеминированного туберкулеза у детей.Следовательно, подавляющее большинство людей в регионах, эндемичных по туберкулезу, вакцинированы БЦЖ. Однако защитные иммунные ответы хозяина со временем снижаются из-за постепенного истощения Т-клеток центральной памяти (T _CM ), которые отвечают за долгосрочную защиту хозяина. Здесь мы приводим доказательства того, что ревакцинация БЦЖ вместе с клофазимином, одобренным препаратом для лечения лепры и лекарственно-устойчивого туберкулеза, индуцирует подобные стволовым клеткам Т-клетки памяти (T _SM ). Клетки T _SM являются предшественниками клеток T _CM и обеспечивают долгосрочную защиту хозяина от туберкулеза за счет непрерывной подачи клеток T _CM .Интересно, что эти клетки T _SM были получены из продуцирующих IL-17 Т-хелперных (Th) 17 клеток. Эти клетки T _SM дифференцировались в клетки T _CM и эффекторной памяти T (T _EM ) и поддерживали стабильный пул критически важных клеток Th2 и Th27 для обеспечения оптимальной защиты хозяина от ТБ.

Образец цитирования: Ахмад С., Бхаттачарья Д., Гупта Н., Рават В., Тусиф С., Ван Каер Л. и др. (2020) Клофазимин повышает эффективность ревакцинации БЦЖ с помощью Т-клеток памяти, подобных стволовым клеткам.PLoS Pathog 16 (5): e1008356. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356

Редактор: Дэвид М. Левинсон, Портлендский медицинский центр, штат Вирджиния, Орегонский университет здравоохранения и науки, США

Поступила: 13 мая 2019 г .; Принята к печати: 27 января 2020 г .; Опубликовано: 21 мая 2020 г.

Авторские права: © 2020 Ahmad et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом, предоставленным GD Департаментом биотехнологии правительства Индии (грант BT / PR6312 / MED / 29/605/2012) и грантом, предоставленным Специальному центру молекулярной медицины, JNU, Индия (основной исследовательский грант). Совет по научным и промышленным исследованиям (CSIR), Индия, предоставил стипендию для младших исследователей и стипендию для старших исследователей SA и CSIR-Senior Research Associateship (схема пула ученых; номер пула: 8802 / A) для DB.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Mycobacterium tuberculosis (M . tb) , этиологический агент туберкулеза (ТБ), ежегодно вызывает почти 2 миллиона смертей во всем мире. Треть мирового населения инфицирована латентной формой ТБ, которая представляет собой огромный резервуар для последующей реактивации [1].Такие состояния, как ВИЧ-инфекция, которые ослабляют иммунитет, могут привести к реактивации ТБ [2]. В отсутствие коинфекции ВИЧ примерно у 10% латентно инфицированных лиц туберкулез развивается в течение жизни [2]. Однако коинфекция ВИЧ увеличивает эту вероятность до более чем 30% [3], либо путем прямого устранения Т-хелперных (Th) клеток CD4 ⁺ , либо путем модуляции других иммунных ответов хозяина [4,5]. Хотя одна треть мирового населения латентно инфицирована M . tb , подавляющее большинство людей не заболевают активным туберкулезом, что позволяет предположить, что иммунитет играет роль в устойчивости хозяина.Th-клетки играют ключевую роль в защитном иммунитете хозяина против туберкулеза [6]. Предыдущие отчеты, включая исследования нашей группы, продемонстрировали, что клетки Th2 играют важную роль в устойчивости хозяина к инфекции ТБ [7–10]. Однако, хотя у подавляющего большинства пациентов с ТБ наблюдается ответ Th2, у многих пациентов болезнь продолжает прогрессировать [11]. Эти наблюдения показывают, что ответы клеток Th2 важны, но недостаточны для защиты хозяина. Недавние сообщения показали, что помимо клеток Th2, клетки Th27 играют важную роль в защите хозяина, особенно при вторичной инфекции и вакцинации [12,13].Однако Th3 и регуляторные T (Treg) клетки способствуют прогрессированию заболевания, противодействуя этим защитным иммунным ответам хозяина [8]. БЦЖ вызывает достаточные ответы Th2, но неэффективна для индукции оптимальных ответов Th27, которые необходимы для генерации ответов долговременной памяти [12,13]. Кроме того, БЦЖ индуцирует антиген-специфические Treg и клетки Th3, продуцирующие IL-4, которые могут ингибировать антиген-специфические клетки памяти [14]. Ранее мы и другие сообщали, что ингибирование ответов Treg и Th3 вместе с иммунизацией БЦЖ усиливает клетки Th2 и Th27, что способствует ответам Т-клеток памяти, которые в конечном итоге переводятся в усиленную защиту хозяина [14].

Хотя БЦЖ имеет ограниченную эффективность против легочного туберкулеза у взрослых, она эффективна против диссеминированного и менингеального туберкулеза у детей раннего возраста [8]. Тем не менее, несмотря на широко распространенную вакцинацию БЦЖ, взрослое население не защищено от легочного туберкулеза. Хорошо известно, что ответы долговременной памяти критически зависят от Т клеток центральной памяти (T _CM ), а не от эффекторных клеток памяти (T _EM ). Эффективность вакцины М . tb зависит от соотношения T _CM : T _EM [15,16].Клетки T _EM очень активны и отвечают за клиренс антигена, тогда как клетки T _CM имеют решающее значение для длительного иммунитета и способны к самовосстановлению. Увеличение пула T _CM указывает на снижение бактериальной нагрузки и усиление долговременных антиген-специфических ответов Т-клеток памяти [16]. Весьма вероятно, что ограниченная защита БЦЖ от легочного туберкулеза у взрослых связана с ее неспособностью генерировать адекватный пул M . tb антигенспецифические клетки T _CM .Хотя БЦЖ индуцирует некоторые клетки T _CM , эти клетки могут со временем уменьшаться из-за постоянного воздействия микобактерий окружающей среды, обнаруженных в эндемичных по ТБ регионах [17–19]. Недавно была охарактеризована новая подгруппа Т-клеток памяти, Т-стволовые клетки памяти (T _SM ). Эти клетки наделены свойствами, подобными стволовым клеткам, способны к самообновлению и проявляют способность дифференцироваться в широкий спектр подмножеств памяти [20–23]. Клетки T _SM хорошо известны среди вирусных, паразитарных и опухолеспецифических Т-клеток [20–23].Стебель клеток T _SM может быть использован терапевтически для повышения эффективности вакцин от различных заболеваний. Однако в отношении ТБ имеются ограниченные знания о клетках T _SM .

Полифункциональные CD4 ⁺ Т-клетки, которые продуцируют IFN-γ, TNF-α и IL-2, критически важны для защитного иммунитета против туберкулеза [24,25]. Одна из основных проблем с вакциной БЦЖ заключается в том, что хроническая инфекция вызывает истощение защитных полифункциональных Т-клеток хозяина из-за индукции различных ингибирующих рецепторов, таких как PD-1 и TIM-3 [26].Истощение Т-клеток развивается как постепенная потеря пролиферации, продукции цитокинов и активности цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) во время хронической инфекции. Нейтрализация этих ингибирующих молекул может восстановить активность и полифункциональность истощенных Т-клеток, чтобы обеспечить улучшенную защиту хозяина [26].

Патогенез туберкулеза включает два компонента: разрушение тканей из-за самого инфекционного агента и разрушение тканей из-за воспалительного процесса, опосредованного иммунными ответами хозяина.Таким образом, в некоторых условиях противовоспалительные или иммуномодулирующие агенты могут усиливать защиту хозяина в сочетании с обычными антибиотиками [27]. Недавно мы сообщили, что иммуномодулятор клофазимин может повышать эффективность вакцины БЦЖ за счет увеличения антиген-специфических клеток T _CM при туберкулезе [28,29]. Клофазимин в основном использовался для лечения лепры, и ВОЗ недавно рекомендовала его использование в качестве антибиотика при лекарственно-устойчивом туберкулезе [30]. Клофазимин представляет собой липофильное соединение, которое связывается с бактериальной ДНК и может проникать в клетки-хозяева, нарушая окислительно-восстановительный потенциал и генерируя антимикробные реактивные формы кислорода [31].Клофазимин также является фармакологическим ингибитором калиевого канала Kv1.3, который преимущественно экспрессируется в клетках T _EM , а блокада Kv1.3 клофазимином увеличивает популяцию T _CM [28]. В соответствии с этим наблюдением, животные с дефицитом Kv1.3 имеют увеличенную популяцию T _CM , и эти животные устойчивы к T _EM -зависимому аутоиммунному энцефалиту [32].

В соответствии с этими выводами и с учетом широко распространенной вакцинации БЦЖ мы попытались изучить, может ли бустерная доза БЦЖ с добавлением клофазимина повысить эффективность вакцины БЦЖ и обеспечить долгосрочную защиту хозяина от туберкулеза.Мы обнаружили, что клофазимин увеличивает распространенность клеток T _CM и T _SM , при этом оказывая незначительное влияние на клетки T _EM . Животные также проявляли заметно повышенную эффективность вакцины против M . tb проблема. Следовательно, включение клофазимина во время ревакцинации БЦЖ повышает эффективность вакцины.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, утвержденными совещанием Институционального комитета по этике животных, проведенным в Университете Джавахарлала Неру (JNU), Нью-Дели, Индия (утверждение Кодекса IAEC № 19/2014), а также в Международном центре генной инженерии и биотехнологии (ICGEB), Нью-Дели, Индия (номер утверждения ICGEB / IAEC / 08/2016 / TACF-JNU).Эти протоколы для животных были одобрены на основе рекомендаций национального комитета по этике животных Индии и строго следуют указаниям Департамента биотехнологии правительства Индии. Все мыши, использованные для экспериментов, были подвергнуты этической эвтаназии путем удушения углекислым газом в соответствии с правилами учреждения и Департамента биотехнологии (правительство Индии).

Мыши

Самок мышей C57BL / 6 в возрасте от шести до восьми недель и трансгенных мышей OT-II TCR были приобретены в животноводческих помещениях JNU и ICGEB.Всех мышей, использованных для экспериментов, содержали в условиях барьера в учреждении для заражения туберкулезом аэрозолями (TACF) ICGEB и гуманно лечили в соответствии с указанными протоколами ухода за животными TACF, руководящими принципами ICGEB.

Эксперименты по иммунизации БЦЖ и введение лекарств

Мышей иммунизировали подкожно 1 × 10 ⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) БЦЖ (SBRI, Сиэтл, Вашингтон, США) в 100 мкл стерильного PBS. После 60 дней отдыха этих мышей снова иммунизировали 0.5 × 10 ⁶ (КОЕ) БЦЖ в 100 мкл стерильного PBS. После 1 дня отдыха этим мышам вводили клофазимин внутрибрюшинно в дозе 5 мг / кг массы тела и изониазид (INH) внутрибрюшинно в дозе 25 мг / кг в 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) один раз в неделю для общей 4 недели. Впоследствии мышей отдыхали в течение 30 дней. Затем этих мышей заражали аэрозольным путем с M . tb, штамм h47Rv, как описано ниже, и органы собирали после эвтаназии для определения бактериальной нагрузки и иммунных фенотипов в различные моменты времени.Для исследований in vitro концентрация клофазимина и INH составляла 20 мкг / мл соответственно и овальбумина 50 мкг / мл.

М . туберкулез Инфекция мышей низкими дозами аэрозоля

М . tb Штамм h47Rv (ATCC 27294; Американская коллекция типовых культур) был любезным подарком от Университета штата Колорадо. Инфицирование мышей выполняли в соответствии с моделью заражения аэрозолем с низкой дозой с использованием аэрозольной камеры Мэдисона (Университет Висконсина, Мэдисон) с распылителем, предварительно откалиброванным примерно на 90–120 КОЕ на мышь. М . tb Штамм h47Rv выращивали до средней логарифмической фазы (оптическая плотность при 600 нм, приблизительно 0,6) в среде Миддлбрука 7H9 с 0,1% Твина 80 (Sigma), 0,2% глицерина и 10% олеиновой кислоты Миддлбрука, альбумина, декстрозы и среда для обогащения каталазы (OADC, Difco ^™ , США). Бактерии хранили при -80 ° C в 20% глицериновой смеси для дальнейших экспериментов. Для аэрозольной инфекции культуры дважды промывали PBS и превращали в одноклеточную суспензию, пропуская через иглу 26 калибра 10 раз.Далее 15 мл M . tb Одноклеточная суспензия h47Rv (100 × 10 ⁶ клеток) была помещена в резервуар распылителя аэрозольной камеры Мэдисона, откалибрована для доставки желаемых КОЕ бактерий в легкие мышей, содержащихся в камере, за 15 минут. циклы. Через 24 часа после аэрозольного заражения 3 мыши были умерщвлены для количественного определения доставки патогена в легкие путем измерения КОЕ в гомогенатах легких. Было обнаружено, что мыши инфицированы примерно 110–120 КОЕ M . tb в легких. Мышей содержали в изоляторах биобезопасности.

Определение количества патогенов по количеству КОЕ

Произвольно выбранных мышей умерщвляли в различные моменты времени, после чего органы собирали, гомогенизировали в PBS с фильтром 0,2 мкм, содержащем 0,05% Твина 80, и высевали на чашки Миддлбрука 7h21, содержащие среду для обогащения 10% OADC (Difco ^™ , США. ). Гомогенаты клеток легких и селезенки высевали на чашки 7ч21 и инкубировали при 37 ° С в течение приблизительно 21 дня.Подсчитывали КОЕ и оценивали количество патогенов в легких и селезенке.

Проточная цитометрия

Селезенки и легкие выделяли у мышей и мацерировали с помощью замороженных предметных стекол в ледяной среде RPMI-1640 (Gibco; Invitrogen), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, для приготовления суспензии одноклеточных. Эритроциты лизировали буфером для лизиса, инкубируя при комнатной температуре в течение 1-2 минут, а затем промывали средой RPMI-1640. Эти свежие лимфоциты подсчитывали и культивировали в течение ночи в присутствии полного растворимого антигена h47Rv (CSA).Для окрашивания поверхности 1 × 10 ⁶ клеток на лунку культивировали в 12-луночных планшетах. Перед окрашиванием клетки дважды промывали буфером FACS и затем окрашивали антителами, направленными против поверхностных маркеров. Для окрашивания поверхности лимфоциты окрашивали моноклональными антителами. После добавления антител клетки выдерживали 40 минут при комнатной температуре. Затем клетки снова промывали буфером и повторно суспендировали в буфере FACS. Для внутриклеточного окрашивания 2 × 10 ⁶ клеток культивировали на лунку и стимулировали полным растворимым антигеном h47Rv в течение ночи, с добавлением 1 мкг / мл брефельдина A (Bio-legend) в течение последних 6 часов культивирования.Для внутриклеточного окрашивания окрашенные поверхности клетки фиксировали 100 мкл фиксирующего буфера (Bio-legend) в течение 30 минут, а затем дважды промывали буфером для пермеабилизации (Bio-legend), повторно суспендировали в 200 мкл буфера для пермеабилизации. и окрашивали флуоресцентно меченными антителами. После окрашивания клетки снова промывали буфером FACS и ресуспендировали в буфере FACS. Интенсивность флуоресценции меченных флуорохромом клеток измеряли с помощью проточной цитометрии (FACS-LSR Fortessa; BD Biosciences).Для получения клеток использовали программное обеспечение BD FACS-DIVA, а анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star). Для определения двойных положительных (IFN-γ и TNF-α, IL-2 и IFN-γ, или TNF-α и IL-2 продуцирующих клеток из компартмента CD4 ⁺ T _CM или T _EM ) и тройного положительные клетки (клетки, продуцирующие IFN-γ, TNF-α и IL-2 из компартмента CD4 ⁺ T _CM и CD4 ⁺ T _EM ), использовали стандартный логический алгоритм [33].

Антитела и реагенты

Мы использовали антитела против следующих маркеров: CD3 (BD; clone145-2C11), CD4 (Bio legend, клон GK1.5; или FITC, клон RM4-5), CD8 (Bio legend; клон 536.7), CD44 (Bio legend clone, IM7), CD62L (клон Biogend клон MEL-14), CD25 (клон Bio legend 3C7), IFN-γ (клон Biogend cloneXMG1.2), IL-2 (клон Bio legend JES6-5h5), IL-6 ( Biogend clone MPS-20F3), IL-17 (Biogend clone tc11-18h20.1), IL-4 (Biogend clone11b11), TNF-α (Biogend clone MP6XT22), TGF-β (Biogend clone TW7- 16B4), CD45RA (BD, клон 14.8), CD95 (BD, клон Jo2), CD122 (BD, клон TM-β), CD127 (BD, клон SB / 199), PD-1 (клон Biogend, 29F.1A12), Tim-3 (Bio legend , клон B8.2C12), Foxp3 (Bio legend, Clone MF-14). OADC был от DIFCO, а RPMI-1640 и FBS были получены от Gibco-BRL, овальбумин от Sigma и клофазимин от Sigma.

Цитокиновый анализ

цитокинов в культуральном супернатанте анализировали с помощью мультиплексного анализа на основе микрогранул Luminex, используя коммерчески доступные наборы в соответствии с инструкциями производителя (BioPlex, Bio-Rad, Mouse Cytokine Group-1).Образцы обрабатывали на системе Bio-Rad Bio-plex 200.

q-ПЦР

Количественный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени выполняли с использованием термоциклера Bio-Rad Real-Time (Bio-Rad, США). Реакцию проводили согласно протоколу производителя. Ферментная обратная транскриптаза и мастер-смесь SYBR green были закуплены у Bio-Rad (США). Относительный уровень экспрессии мРНК был нормализован к уровню внутреннего контроля GAPDH с использованием метода порогового значения цикла 2-ΔΔCt. Последовательности праймеров были следующими: tcf7 : вперед: TACTATGAACTGGCCCGCAAG, обратный: CCTGTGGTGGATTCTTGATG; IL-17 : Вперед: TACCTCAACCGTTCCACG Обратное: TTTCCCTCCGCATTGACACA; t-bet Нападающий, GCCAGGGAACCGCTTATATG; Обратный GACGATCATCTGGGTCACATTGT,

ROR γ t : Вперед: CTGCTGAGAAGGACAGGGAG, Назад: AGTTCTGCTGACGGGTGC, и GAPDH : Вперед: AAGGGCTCATGACCACAGTC, и Назад: CAGGTGATGATG.

Гистологические исследования

Кусочки легких мышей через 60 дней после заражения перфузировали, удаляли и фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение 12 часов, затем переносили в 70% этанол, делали парафиновые блоки, нарезали срезы размером 6 мкм и окрашивали гематоксилином и эозин согласно нашей предыдущей работе. Аналогичным образом было проведено окрашивание КУБ [34].

In vitro эксперименты с перитонеальными макрофагами

Мышам C57BL / 6 в возрасте от шести до восьми недель давали i.п. введение 1 мл тиогликолятной среды (4%). Через 5 дней макрофаги собирали из перитонеального лаважа. Макрофаги один раз промывали холодным PBS и суспендировали в холодном RPMI-1640. Клетки подсчитывали, высевали на 12-луночные планшеты и поддерживали при 37ºC в среде RPMI-1640 с добавлением пенициллин-стрептомицина (1000 единиц / мл) и 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки. После инкубации в течение ночи неприлипающие клетки промывали. Прилипшие клетки обрабатывали CSA (20 мкг / мл) с последующей обработкой клофазимином.Затем клетки хранили при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . После 48 часов обработки макрофаги собирали для проточной цитометрии.

Эксперименты по совместному культивированию Т-клеток мышей OT-II

Обработанные и необработанные макрофаги (описанные в предыдущем разделе) культивировали совместно с CD4 ⁺ Т-клетками в соотношении 1: 3. CD4 ⁺ Т-клетки очищали из спленоцитов трансгенных мышей OT-II с использованием волокна нейлоновой шерсти (анализ Pro). Для определения овальбумин-специфических иммунных ответов клетки стимулировали овальбумином в концентрации 50 мкг / мл.После 48 часов совместного культивирования эти клетки собирали для проточной цитометрии.

Спектрофотометрический анализ

Клофазимин имеет пиковый спектр поглощения при 450 нм. В разные моменты времени (5 дней и 31 день) после лечения клофазимином остаточные количества клофазимина в сыворотке мышей определяли с помощью УФ-спектрофотометра (VARIAN) [35].

Определение остаточного клофазимина в жировых тканях

Клофазимин проявляет максимальную биодоступность в жировой ткани.В различные моменты времени (5 дней и 25 дней) после лечения клофазимином остаточные количества клофазимина в жировой ткани мышей определяли с помощью прямой визуализации и спектроскопии. Контрольных мышей и мышей, получавших клофазимин, умерщвляли и визуализировали их подкожные и мезентрические жировые тела. После взятия равных масс жировой ткани (10 мг) у разных групп мышей клофазимин экстрагировали, как описано Baik et al. [36]. Эти экстрагированные продукты суспендировали в метаноле, и спектры поглощения определяли УФ-спектрофотометрией (VARIAN).

Статистический анализ

Все данные были получены в результате ≥3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения Graph pad, и значения представлены как средние значения со стандартными отклонениями. Существенные различия между средними значениями групп определяли с помощью дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Тьюки. Различия считались статистически значимыми при P≤0,05.

Результаты

Клофазимин повышает эффективность ревакцинации БЦЖ

Иммунизация БЦЖ является обязательной для новорожденных в Индии и других странах Южной Азии, которые являются эндемичными для M . tb инфекция. Индуцированные БЦЖ защитные реакции хозяина со временем снижаются, что может быть связано с генетикой человека и микобактерий, различными коинфекциями или постоянным воздействием микобактерий окружающей среды, которые могут вызывать истощение Т-клеток долговременной памяти [37]. Таким образом, восстановление этих пулов Т-клеток памяти может усилить защиту от туберкулеза. Поскольку люди в этих эндемичных странах уже вакцинированы БЦЖ, мы рассмотрели возможность введения бустерной дозы БЦЖ (ревакцинация БЦЖ) в контексте, который улучшает иммунный ответ хозяина.Клофазимин — хорошо известный антибиотик, который в настоящее время используется для лечения лепры [38,39]. Недавно клофазимин был одобрен для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза. Интересно, что клофазимин также является отличным иммуномодулятором, который усиливает ответы T _CM , снижая при этом ответы T _EM [28], и проявляет эффективность против аутоиммунных заболеваний, таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит [32]. В некоторых условиях длительного приема клофазимин проявлял биодоступность до 70 дней [40], но однократная доза или короткий 8-дневный режим лечения демонстрировали биодоступность от 8 до 10 дней [41, 42].Несмотря на его длительную биодоступность и отложение в тканях, Swanson et al. установили, что только свободный клофазимин в сыворотке крови обладает активным противомикробным действием и что клофазимин, выпавший в осадок в тканях в виде кристаллов или связанный с белками в тканях или даже сыворотке, лишен антимикробных свойств [40]. На основании этих результатов мы рассмотрели, может ли клофазимин повысить эффективность бустерной дозы БЦЖ у ранее иммунизированных мышей. Животных подкожно иммунизировали БЦЖ и отдыхали в течение 60 дней, а затем этим животным вводили бустер-дозу БЦЖ (0.5×10 ⁶ КОЕ) и лечили четырьмя дозами клофазимина с недельными интервалами. Мы выбрали интервал в одну неделю между каждой дозой, чтобы обеспечить достаточную биодоступность. Затем этих животных давали отдыхать в течение дополнительных 30 дней с последующей аэрозольной провокацией низкой дозой вирулентного M . tb штамм h47Rv ( рис. 1A ). Бактериальную нагрузку в легких и селезенке определяли в различные моменты времени после контрольного заражения. Как и ожидалось, мы наблюдали, что животные, получавшие клофазимин, резко снизили КОЕ как в легких, так и в селезенке во все моменты времени (, рис. 1В, ).Однако распространение бактерий ТБ из легких в другие органы было более ограничено у животных, получавших клофазимин и ревакцинированных БЦЖ, что и ожидалось, поскольку распространение бактерий происходит медленно, и в это время возникают адекватные антиген-специфические адаптивные иммунные ответы, которые эффективно уничтожают бактерии. уже присутствует. Гистологический анализ легких показал, что лечение клофазимином значительно уменьшило гранулематозные области ( Рис. 1C и 1D) . Мы обнаружили, что M . Инфекция tb индуцировала обширные гранулематозные области во всех срезах легких, тогда как инфекция у вакцинированных БЦЖ животных и мышей, получивших первичную и бустерную вакцинацию БЦЖ, снизила гистопатологию.Важно отметить, что животные, получавшие клофазимин во время ревакцинации БЦЖ, демонстрировали более выраженную патологию с небольшим количеством гранулематозных областей (, рис. 1С, ). Окрашивание гистологических срезов кислотоустойчивыми бациллами (КУБ) подтвердило эти результаты, поскольку у мышей, получавших клофазимин, было снижено количество бактерий по сравнению с необработанными животными ( рис. 1С, нижние панели). – , чтобы убедиться, что наблюдаемое улучшение эффективности вакцины у животных, получавших клофазимин, не было связано с остаточным клофазимином, который проявляет прямую антимикробную активность, мы проанализировали содержание клофазимина в сыворотке и жировой ткани животных.Мы не смогли обнаружить клофазимин в сыворотке через 31 день после лечения клофазимином (S1 фиг.), , и только остаточные количества присутствовали в жировых тканях через 5 дней после лечения клофазимином ( S2 фиг.). Следовательно, наблюдаемая эффективность вакцины, скорее всего, связана с улучшенными иммунными ответами, вызванными клофазимином.

Рис. 1. Клофазимин усиливает способность ревакцинации БЦЖ защищать от туберкулеза.

(а) Схематическое изображение эксперимента.Мышей иммунизировали БЦЖ и отдыхали 60 дней. Затем вводили однократную бустерную дозу БЦЖ с последующим лечением клофазимином (1 инъекция в неделю) в течение одного месяца, и, наконец, животных давали отдыхать в течение еще одного месяца. Затем мышей заражали h47Rv аэрозольным путем с низкой дозой инокулята примерно 100–120 колониеобразующих единиц (КОЕ) на мышь. После этого мышей умерщвляли в различные моменты времени (30 или 60 дней), собирали легкие и селезенку и оценивали бактериальную нагрузку и иммунологические параметры.(b) Количество КОЕ в легких и селезенке в разные промежутки времени. (c) Окрашивание гематоксилином и эозином срезов легких, показывающих гранулематозные области, и окрашивание срезов легких на микобактерии по КУБ. Стрелками обозначено наличие M . тб . (г) Относительные гранулематозные области в разных экспериментальных группах. Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент. Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом ANOVA с апостериорным анализом Тьюки.* обозначает P ≤ 0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.g001

Клофазимин усиливает ответы на долгосрочную память при ревакцинации БЦЖ

В эндемичных по ТБ регионах клетки T _CM резко истощаются у лиц, вакцинированных БЦЖ, по неизвестным причинам. Тем не менее, вероятно, что постоянное воздействие микобактерий окружающей среды может нарушить защитную для хозяина популяцию клеток T _CM [17–19].Более того, основным недостатком вакцины БЦЖ является ее неспособность индуцировать высококачественные клетки T _CM [16]. Долгосрочная эффективность вакцины в первую очередь зависит от баланса между клетками T _CM и T _EM , образованными во время иммунизации [43]. Чтобы получить представление о влиянии клофазимина на Т-клетки памяти, мы исследовали кинетику клеток T _CM и T _EM в легких и селезенке. В этот эксперимент мы также включили ревакцинацию БЦЖ с лечением INH в качестве контрольной группы, поскольку INH является одним из важных противотуберкулезных препаратов.Мы собрали селезенку в различные моменты времени и проанализировали клетки T _CM (CD44 ^hi CD62L ^hi ) и T _EM (CD44 ^hi CD62L ^low ) в обеих клетках CD4 ⁺ ( Рис. 2A ) или CD8 ⁺ подмножеств Т-клеток (, рис. 2B ). Через 30 и 60 дней после инфицирования количество клеток селезенки T _CM значительно увеличилось у животных, получавших клофазимин во время ревакцинации БЦЖ, в линиях Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ по сравнению с животными, получившими вакцинацию БЦЖ. , Ревакцинация БЦЖ или ревакцинация БЦЖ с лечением изониазидом (, рис. 2A и 2B, ).По мере того как время прогрессировало с 30 до 60 дней, соотношение T _CM : T _EM Т-клеток CD4 ⁺ значительно увеличивалось с 1: 4 до 1: 3 у животных, получавших клофазимин во время ревакцинации БЦЖ. Напротив, для животных, которые получали только ревакцинацию БЦЖ или ревакцинацию БЦЖ с лечением изониазидом, соотношение T _CM : T _EM оставалось стабильным на уровне 1: 4 или 1: 5, соответственно, как через 30, так и через 60 дней после заражения. . Более того, у животных, иммунизированных БЦЖ, соотношение T _CM : T _EM со временем уменьшалось с 1: 5 (30 день) до 1: 6 (60 день) (рис. 2C ).В Т-клетках CD8 ⁺ соотношение T _CM : T _EM показало аналогичную тенденцию с течением времени (рис. 2D) . Однако у животных, иммунизированных БЦЖ, снижение соотношения T _CM : T _EM было более выраженным в Т-клетках CD8 ⁺ по сравнению с Т-клетками CD4 ⁺ ( рис. 2C и 2D ). В этом эксперименте мы использовали INH, чтобы проверить, играют ли антимикробные свойства лекарств какую-либо роль в иммуномодуляции. Мы обнаружили, что INH не проявлял каких-либо основных иммуномодулирующих свойств, тогда как клофазимин увеличивал эффективность ревакцинации БЦЖ, модулируя иммунную систему хозяина.Кроме того, для подтверждения наших результатов мы также определили иммуномодулирующие свойства клофазимина и INH in vitro в селезеночных культурах инфицированных животных. Неожиданно мы обнаружили, что клофазимин резко увеличивал соотношение T _CM по сравнению с T _EM , а также количество клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IFN-γ и IL-17 ( S3, рис. ). Напротив, INH не проявлял иммуномодулирующих эффектов. Таким образом, мы пришли к выводу, что клофазимин оказывает существенное иммуномодулирующее действие и что в наших экспериментальных условиях он не оказывает каких-либо прямых антибактериальных эффектов.Мы также измерили экспрессию рецептора цитокина IL-7 α (CD127), поскольку CD127 отвечает за стабильное поддержание или выживание клеточного клона T _CM [44]. Мы обнаружили, что мыши, получавшие клофазимин, экспрессировали более высокие уровни CD127 на своих клетках T _CM , чем в других экспериментальных группах ( S4, рис. ). Мы также исследовали состояние Т-клеток памяти в легких через 60 дней после инфицирования и обнаружили аналогичную тенденцию, что и в селезенке ( S5, рис. ). Таким образом, лечение клофазимином во время бустерной иммунизации БЦЖ модулирует ответы памяти Т-лимфоцитов, увеличивая соотношение T _CM : T _EM , что может обеспечить долгосрочную защиту от туберкулеза.

Рис. 2. Клофазимин увеличивает эффективность ревакцинации БЦЖ для оптимизации соотношения клеток T _CM : T _EM .

Селезенки собирали в разные моменты времени после аэрозольной пробы. Были приготовлены суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb Лизат (CSA), окрашенный антителами против CD4, -CD8, -CD44 и -CD62L и проанализированный методом проточной цитометрии. (а) Популяции T _EM и T _CM среди клеток CD4 ⁺ в разные моменты времени.(b) Популяции T _EM и T _CM среди клеток CD8 ⁺ в разные моменты времени. (c) Характер изменений процентного содержания популяций клеток CD4 ⁺ T _EM и T _CM в различные моменты времени. (d) Характер изменений процентного содержания популяций клеток CD8 ⁺ T _EM и T _CM в различные моменты времени. Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент.Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом ANOVA с апостериорным анализом Тьюки. На фигурах a и b сравнения клеток T _CM были выполнены между группой БЦЖ + ревакцинация БЦЖ + CF + h47Rv и всеми другими экспериментальными группами. * обозначает P ≤0,05. INH, изониазид; CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.g002

Клофазимин усиливает полифункциональные клетки T

_CM и T _EM во время ревакцинации БЦЖ

Т-клетки памяти демонстрируют глубокое функциональное разнообразие, которое зависит от множества факторов, включая их состояние дифференцировки, способность тканевого самонаведения, долгосрочное выживание и экспрессию цитокинов (IFN-γ, TNF-α и IL-2).Продукция этих трех основных цитокинов (IFN-γ, TNF-α и IL-2) полифункциональными Т-клетками имеет решающее значение для защиты от туберкулеза [45].

Мы коррелировали функциональное состояние Т-клеток памяти путем определения клеток, продуцирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, среди клеточных компартментов T _CM и T _EM различных экспериментальных групп животных. Клетки T _CM , выделенные от животных, получавших клофазимин во время ревакцинации БЦЖ, показали достоверную (P ≤0.05) повышенные уровни TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ тройной положительный (37%), TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ (14%), IFN- γ ⁺ IL-2 ⁺ (9%) и TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ (10%) двойные положительные Т-клетки по сравнению со всеми другими группами ( Рис. 3A ). Напротив, животные, получавшие только ревакцинацию БЦЖ, показали значительно повышенные (P ≤0,05) уровни IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ , дважды положительные (6%) клетки T _CM по сравнению с инфицированными h47Rv и однократными BCG. вакцинированные животные (1,4%) соответственно (, фиг. 3A, ).Однако для клеток T _EM у мышей, получавших ревакцинацию БЦЖ с клофазимином, наблюдалось значительно (P ≤0,05) повышенные уровни TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ тройной положительный результат (29%). и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ (4%), TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ (19%) и TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ 10% ) дважды положительные Т-клетки по сравнению с животными, ревакцинированными БЦЖ (15%, 2%, 14% и 9% соответственно) ( Fig. 3B ). Тем не менее, величина различий для трижды положительных клеток и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ дважды положительных клеток среди клеток T _CM (9%) была выше, чем среди клеток T _EM (4% ).Однако величина двойных положительных клеток TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ (19%) была выше среди клеток T _EM . Эти результаты показали, что у мышей, получавших ревакцинацию БЦЖ клофазимином, наблюдалось усиление IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ тройных положительных клеток в популяциях T _CM и T _EM ( фиг. 3A и 3B ).

Рис. 3. Клофазимин усиливает способность ревакцинации БЦЖ увеличивать процент полифункциональных Т-клеток CD4 ⁺ .

Селезенки собирали и получали суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb, лизат (CSA) и окрашенный антителами против CD4, -CD44, -CD62L, -TNF-α, -IFN-γ и -IL-2. (а) Процент цитокин-продуцирующих клеток CD4 ⁺ T _CM . (b) Процент цитокин-продуцирующих клеток CD4 ⁺ T _EM . Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент.Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом ANOVA с апостериорным анализом Тьюки. * обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.g003

Хорошо известно, что антигенспецифические полифункциональные эффекторные Т-клетки M.tb истощаются из-за индукции ингибирующих рецепторов, таких как PD-1 и Tim- 3 [26]. Поскольку добавление клофазимина во время ревакцинации БЦЖ индуцирует более высокие уровни антиген-специфических эффекторных Т-клеток, мы определили, имеют ли эти клетки истощенный фенотип.Примечательно, что экспрессия этих молекул как клетками CD4, так и CD8 у животных, которым вводили комбинацию ревакцинации БЦЖ плюс клофазимин, была ниже по сравнению с любой из других экспериментальных групп (S6 фиг.). Это наблюдение предполагает, что антиген-специфические Т-клетки, индуцированные после ревакцинации БЦЖ и лечения клофазимином, не истощаются и являются функционально активными.

Клофазимин индуцирует Т-клетки памяти, подобные стволовым клеткам, во время ревакцинации БЦЖ

Недавно была открыта новая подгруппа Т-клеток памяти, Т-стволовые клетки памяти (T _SM ), обладающие улучшенной способностью к регенерации, дифференцировке, а также долговременной стабильностью [20–23].Считается, что это подмножество Т-клеток является предшественником клеток T _CM и T _EM [20]. Клетки T _SM обычно экспрессируют CD45RA и CCR7 и, таким образом, фенотипически напоминают наивные Т-клетки, но их совместная экспрессия маркеров стволовых клеток, таких как CD95 и CXCR3, отличает их от наивных Т-клеток [20], и эти клетки также экспрессируют CD122. (Рецептор IL-2 β), что способствует их самообновлению [22,46]. Антиген-специфические клетки T _SM хорошо охарактеризованы в вирусных, паразитарных и опухолеспецифических Т-клетках CD8 ⁺ [20–23], и в недавнем отчете описан M . tb -специфические клетки CD4 ⁺ T _SM как источник клеток T _CM и T _EM [29]. Чтобы исследовать эти клетки, мы сначала идентифицировали CD4 ⁺ CD62L ⁺ CD45RA ⁺ наивные Т-клетки, а затем проанализировали экспрессию CD95 и CD122 ( Рис. 4A ). Мы обнаружили значительное увеличение (P ≤0,05) клеток CD4 ⁺ T _SM (CD62L ⁺ CD45RA ⁺ CD95 ⁺ CD122 ⁺ ) у животных, получавших ревакцинацию БЦЖ и клофазимин (40%) по сравнению с с мышами, получавшими только вакцинацию БЦЖ (27%) или ревакцинацию (33%) ( Рис. 4A ).Неокрашенный контроль CD122 и CD95 показан отдельно со всеми другими неокрашенными контролями различных экспериментов (S7 фиг.).

Рис. 4. Клофазимин усиливает способность ревакцинации БЦЖ увеличивать частоту клеток T _SM .

Селезенки собирали и получали суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb, лизат (CSA) и окрашенный антителами против CD4, -CD62L, -CD45RA, -CD95 и -CD122. (а) Типичная стратегия стробирования для выделения CD4 ⁺ CD45RA ⁺ CD62L ⁺ CD95 ⁺ CD122 ⁺ T _SM клеток из популяции лимфоцитов и процентного содержания клеток T _SM в различных экспериментальных группах .(b) Процент перитонеальных макрофагов, продуцирующих IL-6 и TGFβ, культивируемых в присутствии или в отсутствие клофазимина. (c) Перитонеальные макрофаги примировали M . tb антиген в присутствии или в отсутствие клофазимина в течение 4 часов. Затем примированные макрофаги совместно культивировали с Т-клетками трансгенных мышей OT-II в присутствии овальбумина в течение ночи. Наконец, был проанализирован процент клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IL17, и (d) экспрессия ROR γ t была определена с помощью анализа qPCR.Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент. Для экспериментов in vitro были выполнены по крайней мере 3 биологические реплики и 3 технические реплики. Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. * обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.g004

Недавно сообщалось, что IL-17 является одним из ключевых игроков в генерации Т-клеток памяти.IL-17 способствует образованию клеток T _SM путем активации пути передачи сигналов Wnt / β-catenin, который ограничивает антиген-специфические Т-клетки наивным компартментом и в конечном итоге сдвигает их в сторону клеток T _SM [47]. Мы исследовали, играет ли клофазимин роль в генерации Т-клеток, продуцирующих IL-17. Комбинация IL-6 и TGF-β необходима для дифференцировки Т-клеток, продуцирующих IL-17 [48]. Мы проверили, влияет ли клофазимин на продукцию этих цитокинов в макрофагах.Мы провоцировали макрофаги полным растворимым антигеном (CSA), обрабатывали их клофазимином и посредством внутриклеточного окрашивания оценивали цитокины IL-6 и TGF-β. Мы обнаружили, что лечение клофазимином увеличивало процент клеток, продуцирующих IL-6, тогда как уровни TGF-β практически не изменялись при лечении клофазимином (рис. 4B) . Кроме того, когда эти обработанные клофазимином и необработанные макрофаги совместно культивировали с Т-клетками, выделенными от трансгенных мышей OT-II TCR, в присутствии овальбумина, мы обнаружили незначительное увеличение количества трансгенных Т-клеток, продуцирующих IL-17 ( Рис. 4C ), экспрессирующих высокие уровни фактора транскрипции RORγt ( Fig. 4D ) в группе, получавшей клофазимин.Таким образом, наши результаты предполагают, что лечение клофазимином создает нишу для генерации IL-17-продуцирующих Т-хелперных 17 клеток, которые способствуют дифференцировке клеток Т _SM .

Клофазимин усиливает ответы IFN-γ и IL-17 во время ревакцинации БЦЖ

Хорошо известно, что ответы Th2 обеспечивают защиту хоста от M . tb инфекция. Однако ответы Th27 также необходимы для защиты от вторичной инфекции и генерации ответов долговременной памяти [49,50].Таким образом, мы количественно оценили различные субпопуляции CD4 ⁺ Т-клеток на основе их сигнатурной продукции цитокинов в наших экспериментальных группах через 60 дней после заражения. Мы обнаружили, что количество клеток, продуцирующих IFN-γ и IL-17, было значительно увеличено ( рис. 5A и 5B ), тогда как количество продуцирующих IL-4 клеток Th3 было снижено у животных, которые получали ревакцинацию БЦЖ и лечение клофазимином ( рис. 5A ). Это наблюдение побудило нас измерить популяцию Treg. Мы обнаружили, что популяция Treg (CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ клетки) также значительно уменьшилась ( Fig. 5C ).В совокупности эти данные показали, что лечение клофазимином увеличивает защитный иммунный ответ IFN-γ и IL-17, который способствует образованию Т-клеток памяти. Мы также измерили цитокины из супернатантов культуры спленоцитов и обнаружили, что лечение клофазимином значительно повышало уровни IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-12 и IL-6 и снижало уровни IL-10. Более того, было стабильное поддержание IL-1β среди животных, получавших различное лечение (, фиг. 5D, ). Повышение уровней IL-2, TNF-α и IFN-γ (рис. 5D) подтвердило открытие, что лечение клофазимином увеличивает уровни полифункциональных Т-клеток памяти.Более того, повышенный уровень IL-6 (фиг. 5D) свидетельствует о том, что лечение клофазимином создает цитокиновую среду, которая способствует образованию клеток Th27.

Рис. 5. Клофазимин усиливает способность ревакцинации БЦЖ увеличивать распространенность антиген-специфических клеток Th2 и Th27.

Селезенки собирали и получали суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb лизата (CSA), супернатанты собирали для анализа мультиплексирования цитокинов, клетки окрашивали антителами против CD4, CD25 -IL-4, -IFN-γ, -IL-17 и Foxp3 и анализировали с помощью проточной цитометрии.(а) Схематическое изображение данных FACS и гистограмм для процента клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IL-4 и IFN-γ, в различных экспериментальных группах. (b) Схематическое изображение данных FACS и гистограмм для процента клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IL-17, в различных экспериментальных группах. ( c ) Схематическое изображение данных FACS и столбчатых диаграмм для процентного содержания клеток CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ в различных экспериментальных группах.( d ) Концентрация различных поляризующих цитокинов, измеренная с помощью мультиплексного анализа. Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент. Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. * обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.g005

Клофазимин способствует превращению продуцирующих IL-17 клеток Th27 в T

_SM -подобные клетки

Недавно было показано, что клетки Th27 трансформируются в менее дифференцированные, наивные Т-клетки, которые сохраняют сигнатуры клеток памяти, подобных стволовым клеткам, в среде опухоли [51,52].Чтобы проверить, могут ли клетки Th27 трансформироваться в клетки T _SM во время вакцинации БЦЖ, мы исследовали экспрессию IL-17 в клетках T _SM . Мы стробировали клетки на клетках с наивным фенотипом CD45RA ⁺ CD62L ⁺ и анализировали продукцию IL-17 среди клеток CD95 ⁺ . Мы обнаружили, что животные, получавшие ревакцинацию БЦЖ и клофазимин, содержали значительно большее количество продуцирующих IL-17 клеток T _SM по сравнению со всеми другими группами (, рис. 6A, ).Кроме того, чтобы предоставить дополнительные доказательства того, что клетки, продуцирующие IL-17, являются клетками Th27 и постепенно дифференцируются в клетки T _SM , мы исследовали экспрессию RORγt, сигнатурного фактора транскрипции клеток Th27, и tcf-7 . , нижестоящий компонент пути Wnt / β-catenin, который способствует пластичности клеток. Мы обнаружили, что лечение клофазимином во время ревакцинации БЦЖ усиливало экспрессию как RORγt, так и tcf-7 ( Fig. 6B ). Этот результат согласуется с опубликованным отчетом о том, что в микроокружении рака продуцирующие IL-17 клетки Th27 трансформируются в клетки T _SM из-за экспрессии tcf-7 [47].Мы также проанализировали экспрессию t-bet , который является маркером сигнатуры клеток Th2, чтобы проверить возможность того, что клетки Th27, которые трансформируются в клетки T _SM , могут в конечном итоге преобразоваться в клетки Th2, защищающие хозяина. Неожиданно мы обнаружили значительно увеличенную экспрессию tcf-7 и t-bet в Т-клетках мышей, которые получали ревакцинацию БЦЖ и клофазимин (, рис. 6В, ). Недавние исследования также показали, что пластичность клеток Th27 играет роль в приобретении усиленных ответов Т-клеток памяти [51,53].Чтобы подтвердить наш результат, мы определили статус другого маркера пластичности клеток, CD27. Мы обнаружили, что лечение клофазимином значительно увеличивало уровень экспрессии CD27 в клетках, продуцирующих IL-17 ( Рис. 6C) . Чтобы обеспечить дополнительную поддержку этого представления и обеспечить понимание способности клеток, продуцирующих IL-17, трансформироваться в клетки, продуцирующие IFN-γ, мы исследовали состояние экспрессии IL-17 среди клеток, продуцирующих IFN-γ. Наши данные ясно показали 3-кратное повышение экспрессии IL-17 ⁺ IFN-γ ⁺ двойных положительных клеток у обработанных клофазимином БЦЖ — ревакцинированных животных по сравнению с вакцинированными БЦЖ или ревакцинированными БЦЖ животными животные ( Рис. 6D ).Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что лечение клофазимином во время ревакцинации БЦЖ усиливает Т-клетки, продуцирующие IL-17, которые затем превращаются в клетки T _SM , которые обеспечивают ответы долговременной памяти, превращаясь в защитные для хозяина, продуцирующие IFN-γ Th2. клетки.

Рис. 6. Клофазимин увеличивает способность ревакцинации БЦЖ увеличивать превращение Т-клеток, продуцирующих IL-17, в Т-клетки, продуцирующие T _SM и IFN-γ.

Селезенки собирали и получали суспензии единичных клеток.Клетки культивировали в течение ночи с M . tb лизата (CSA), затем окрашивали антителами против CD4, -CD62L, -CD45RA, -CD95 и -IL-17 и анализировали с помощью проточной цитометрии. (а) Схематическое изображение данных FACS и столбчатых диаграмм для клеток IL-17 ⁺ с сигнатурой T _SM в различных экспериментальных группах. (b) Экспрессия генов tcf-7 , ROR γ t , t-bet и IL-17 в различных экспериментальных группах.(c) Процент клеток IL-17 ⁺ CD27 ⁺ CD4 ⁺ в различных группах животных. (d) Процент клеток IL-17 ⁺ IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ в различных группах животных. Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент. Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. * обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1008356.g006

Обсуждение

M . tb эволюционировал вместе со своим человеческим хозяином с доисторической эры [54] и приобрел различные механизмы для изменения защитных иммунных ответов хозяина, чтобы выжить и размножаться внутри хозяина. БЦЖ, единственная доступная вакцина, используется с момента ее создания в 1921 году, но ее эффективность против легочного туберкулеза у взрослых неудовлетворительна. Однако он достаточно эффективен для защиты от туберкулезного менингита и диссеминированного туберкулеза у детей раннего возраста.Отсутствие эффективности БЦЖ против туберкулеза легких у взрослых может быть связано с: (i) недостаточной силой иммунного ответа, (ii) короткоживущим иммунным ответом, (iii) индукцией анергии в Т-клетках памяти из-за высокой экспозиции антигена и / или (iv) антиген-специфические клетки памяти присутствуют на периферии, но не могут мигрировать к месту инфекции в легком. Ранее мы и другие показали, что БЦЖ вызывает сильные ответы Th2, но вызывает только ограниченные ответы Th27, которые необходимы для оптимальной эффективности вакцины [17,18].

В большинстве регионов мира, где распространен туберкулез, вакцинация БЦЖ требуется по закону. Хотя БЦЖ индуцирует небольшой пул долговременных клеток T _CM , со временем эти клетки истощаются из-за хронического воздействия микобактерий окружающей среды [17–19]. Недавно мы показали, что клофазимин увеличивает пул Т _CM у животных, вакцинированных БЦЖ [28]. Недавнее клиническое испытание также показало, что ревакцинация БЦЖ в подростковом возрасте увеличивает защитный иммунный ответ от ТБ по сравнению с однократной неонатальной дозой вакцины БЦЖ в условиях высокой передачи [55].Однако значительное количество литературы предполагает, что добавление иммуномодулятора улучшает эффективность вакцины БЦЖ [14]. Основываясь на этих концепциях, мы лечили мышей низкой дозой клофазимина во время ревакцинации БЦЖ, которая аналогичным образом вызвала увеличение популяции T _CM без значительных изменений в популяции T _EM . Недавно качество ответов Т-клеток памяти было оценено путем измерения продукции антиген-специфических цитокинов. Хотя продукция цитокинов является важной функцией Т-клеток памяти, их способность к самонаводству также имеет решающее значение.Поэтому мы исследовали полифункциональные свойства клеток T _CM и T _EM . Предыдущие исследования установили, что TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ трехположительные полифункциональные Т-клетки обладают наиболее мощной защитой от туберкулеза [45]. В этом контексте в некоторых сообщениях указано, что TNF-α ⁺ IFN-γ ⁺ дважды положительные Т-клетки коррелируют с высокой бактериальной нагрузкой, тогда как IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ или IL-2 ⁺ Т-клетки коррелируют с низкой бактериальной нагрузкой и повышенными реакциями долговременной памяти [56].Наши результаты продемонстрировали, что лечение клофазимином увеличивало IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ , тройные положительные полифункциональные Т-клетки в компартментах T _CM и T _EM , что приводит к реакции долговременной памяти. Более того, эти клетки не проявляли истощенного фенотипа и были функционально активными.

Недавно была обнаружена еще одна подгруппа Т-клеток памяти, которая обладает характеристиками как наивных Т-клеток, так и стволовых клеток, названная клетками Т _SM .Эта подгруппа Т-клеток памяти была идентифицирована для Т-клеток CD8 ⁺ во время вирусной инфекции [20,22]. Дальнейшие исследования также идентифицировали эту подгруппу в популяции Т-клеток CD4 ⁺ [20,22,29]. Наиболее интересным признаком клеток T _SM является то, что они могут дифференцироваться в клетки T _CM или T _EM и могут широко размножаться. Клетки T _SM являются единственной субпопуляцией Т-клеток памяти, способной воссоздавать всю гетерогенную популяцию Т-клеток памяти [22,57].Таким образом, клетки T _SM теперь считаются наиболее важным подмножеством Т-клеток для обеспечения долговременной памяти [22]. Наше исследование показало, что это подмножество Т-клеток памяти расширяется клофазимином после ревакцинации БЦЖ. Интересно, что эти клетки T _SM сохранили молекулярную подпись клеток Th27, что, вероятно, способствует защите от болезней [50,58]. Предыдущие сообщения показали, что клетки Th27 демонстрируют активированную передачу сигналов Wnt / β-catenin, которая помогает ограничивать Т-клетки в наивном компартменте и способствует генерации клеток T _SM [47,51].Также было показано, что молекулярная сигнатура клеток Th27 может подавляться с одновременным усилением транскриптов типа Th2 (т.е. tbx21 и IFN-γ), и в конечном итоге такие долгоживущие клетки ex-Th27 приобретают экспрессию T-bet и превращаются в Клетки Th2 [47]. В нашем исследовании мы обнаружили, что лечение клофазимином увеличивает частоту клеток T _SM , а также клеток Th27. В настоящее время становится все более очевидным, что клетки Th27 трансформируются в долгоживущие и менее дифференцированные Т-клетки памяти, которые в долгосрочной перспективе ведут себя очень похоже на клетки памяти, которые дифференцировались от клеток Th2.Несмотря на ограниченную пластичность, клетки Th27 демонстрируют более высокую ответную реакцию по сравнению с клетками Th2. Из-за активации передачи сигналов Wnt / β-catenin и экспрессии Tcf-7 в клетках Th27 эти клетки проявляют повышенную пластичность [47] и могут дедифференцироваться в наивные Т-клетки или Т-клетки ранней памяти. Здесь мы представили доказательства того, что клофазимин увеличивает пластичность клеток Th27 во время ревакцинации БЦЖ. Эта стратегия поддерживает стабильный пул клеток T _CM или T _EM за счет увеличения популяции T _SM .Наша предыдущая работа вместе с работой других групп показала, что ответы клеток Th2 и Th27 преимущественно необходимы для усиления защитных ответов Т-клеток памяти [12]. Улучшенные ответы памяти были вызваны подавлением клеток Th3 и Treg [14]. В этом исследовании мы обнаружили тенденцию к увеличению количества клеток Th2 и Th27 и уменьшению количества клеток Treg и Th3, индуцированных клофазимином после ревакцинации БЦЖ. Анализ цитокинов из культурального супернатанта также подтвердил, что защитные клетки Th2 и Th27 были увеличены у животных, получивших ревакцинацию БЦЖ и клофазимин, как уровни цитокинов типа Th2 IL-12 и IFN-γ и Th27 поляризующих цитокинов IL-1β и IL. -6 были увеличены [59].В этом контексте несколько предыдущих исследований показали, что комбинация TGF-β и IL-6 способствует дифференцировке клеток Th27 и ингибирует дифференцировку Treg-клеток у мышей [48,59], тогда как TGF-β плюс ретиноевая кислота ингибирует клетки Th27. дифференцировка и способствует Treg-клеткам [60]. Повышенные уровни IL-6, IL-1β и умеренные уровни TGF-β, обнаруженные у мышей, получавших клофазимин и ревакцинацию БЦЖ, могут способствовать дифференцировке клеток Th27 с реципрокным снижением дифференцировки Treg-клеток.Этот паттерн подмножеств Th-клеток может индуцировать превосходные ответы Т-клеток памяти, которые обеспечивают долгосрочную защиту от M . tb инфекция. Кроме того, увеличение количества клеток Th27 может помочь в генерации клеток T _SM , как обнаружено в других моделях болезни [50]. Также очевидно, что клетки T _SM превращаются в клетки T _CM или T _EM , а также вызывают реакции долговременной памяти путем самовосстановления. Хотя кажется, что клетки T _SM имеют решающее значение для долгосрочной эффективности вакцины, использование этих клеток для улучшения вакцины еще не завершено.

Таким образом, поскольку оптимальная защита хозяина от ТБ требует ответов Th2 и Th27, вакцины-кандидаты должны быть нацелены на индукцию клеток T _CM , способных продуцировать цитокины Th2 и Th27. Поскольку клетки T _EM дают начало эффекторным клеткам, которые могут вызывать воспаление, могут быть желательны вакцины, которые стимулируют ответы T _CM по сравнению с ответами T _EM . Недавние сообщения показали, что клетки T _CM и T _EM происходят из клеток T _SM , подмножества долгоживущих, самообновляющихся Т-клеток памяти.Следовательно, успешная вакцина-кандидат может включать клетки T _SM , которые могут давать Т-клетки, продуцирующие цитокины Th2 и Th27. Поскольку тестирование новых вакцин-кандидатов занимает несколько десятилетий, подходы, в которых используются лица, ранее вакцинированные БЦЖ, заслуживают внимания. В нашем новом подходе используется клофазимин, одобренный препарат, который показал эффективность для усиления защитных иммунных ответов во время ревакцинации у мышей. Аналогичный подход может быть использован для повышения эффективности вакцины БЦЖ у людей и требует дальнейших исследований.

Дополнительная информация

S1 Рис. Остаточный клофазимин

в сыворотке не влияет на бактериальный клиренс.

Чтобы определить, остается ли остаточный клофазимин в нашей экспериментальной системе, мы иммунизировали животных БЦЖ и отдыхали в течение 60 дней, как аналогичный метод эксперимента по оценке эффективности вакцины. Аналогичным образом была введена однократная бустерная доза БЦЖ с последующим лечением клофазимином (1 инъекция в неделю) в течение одного месяца в дозе 5 мг / кг. Этих животных отдыхали еще 30 дней.Через 5 дней и 30 дней после окончания периода лечения мы умерщвляли животных и количественно определяли остаточный клофазимин в сыворотке крови с помощью спектроскопии. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку неинфицированных и необработанных мышей, а в качестве положительного контроля сыворотку от неинфицированных мышей собирали через 5 дней от одномесячной дозы (5 мг / кг) обработки клофазимином для спектроскопического анализа.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s001

(TIF)

S2 Рис. Остаточные уровни клофазимина в жировых тканях животных, получавших клофазимин.

Для определения остаточного количества клофазимина в жировых тельцах мы использовали четыре группы животных, из которых две группы получали внутрибрюшинное лечение клофазимином в течение одного месяца (1 инъекция в неделю) в дозе 5 мг / кг, а две другие группы получали управление автомобилем. Через 5 дней и 25 дней после окончания периода лечения мы умерщвляли животных, получавших клофазимин, и количественно определяли остаточный клофазимин в жировых тельцах с помощью спектроскопии. В качестве отрицательного контроля для спектроскопического анализа использовали жировые тела от контрольных животных-носителей.(а) Фотографии жировых тканей животных, использованных для экспериментов, после 5 дней лечения. (б) Спектроскопический анализ остаточного клофазимина после 5 дней лечения. (c) Фотографии жировых тканей животных, использованных для экспериментов, после 25 дней лечения. (d) Спектроскопический анализ остаточного клофазимина после 25 дней лечения. Красные и синие линии в спектральном анализе являются техническими копиями образца.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s002

(TIF)

S3 Фиг.Клофазимин оказывает существенное иммуномодулирующее действие в культурах in vitro.

Селезенки собирали у животных, инфицированных h47Rv, через 30 дней и заражали лизатом M.tb (CSA) в присутствии INH или клофазимина и окрашивали анти-CD4, -CD44, -CD62L, -IFN-γ и антитела против IL-17 и проанализированы с помощью FACS. (а) Схематическое изображение данных FACS и гистограмм для процентного содержания клеток CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^hi T _CM клеток.(b) Схематическое изображение данных FACS и гистограмм для процентного содержания IL-17-продуцирующих CD4 ⁺ Т-клеток. (c) Схематическое изображение данных FACS и гистограмм для процента Т-клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IFN-γ. Все значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. * обозначает P ≤0,05. INH, Изониазид.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s003

(TIF)

S4 Фиг. Клофазимин усиливает экспрессию цитокинового рецептора IL-7 CD127 у животных, ревакцинированных БЦЖ.

Селезенки собирали в разные моменты времени после аэрозольной пробы. Были приготовлены суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb лизата (CSA) и окрашивали анти-CD3, анти-CD4, -CD8, -CD44 и -CD62L антителами для анализа T _CM и T _EM с помощью FACS. После получения клеток T _CM мы измерили экспрессию рецептора цитокина IL-7 (CD127). Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент.Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. На этой фигуре сравнения экспрессии CD127 в CD44 ^hi CD62L ^hi CD4 ⁺ или CD8 ⁺ линии Т-клеток были выполнены между группой БЦЖ + ревакцинация БЦЖ + CF + h47Rv и всеми другими экспериментальными группами. * обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s004

(TIF)

S5 Рис. Клофазимин усиливает популяцию Т

_CM в легких реиммунизированных БЦЖ мышей.

Через 60 дней после инфицирования легкие собирали и получали суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb лизат (CSA). Клетки окрашивали антителами против CD4, -CD8, -CD62L и -CD44 и анализировали проточной цитометрией. Процент CD44 ^hi CD62 ^lo T _EM и CD44 ^hi CD62L ^hi T _CM клеток среди CD4 ⁺ (a) и CD8 ⁺ (b) Т-клеток. Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент.Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. На этой фигуре сравнения клеток линии T _CM CD4 ⁺ или CD8 ⁺ были выполнены между группой БЦЖ + ревакцинация БЦЖ + CF + h47Rv и всеми другими экспериментальными группами. * обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s005

(TIF)

S6 Рис. Антиген-специфические активированные клетки CD4

⁺ у животных, получавших клофазимин и вакцинированных БЦЖ, не имели фенотипа истощения.

Селезенки собирали и получали суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в течение ночи с M . tb, лизат (CSA) и окрашенный антителами к CD4, -PD1 или -Tim3. Экспрессию PD1 и Tim3 определяли с помощью анализа FACS. Все данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов, и каждая группа включала не менее 5 мышей в каждый эксперимент. Все значения представлены как Среднее ± SD. Статистический анализ выполняли методом дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. На этой фигуре сравнивали экспрессию ингибирующих молекул PD1 и Tim3 в клетках линии CD4 ⁺ между группой БЦЖ + ревакцинация БЦЖ + CF + h47Rv и всеми другими экспериментальными группами.* обозначает P ≤0,05. CF, клофазимин.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s006

(TIF)

S7 Рис. Неокрашенные контроли различных экспериментов.

(i) неокрашенный контроль T _CM и T _EM анализ (a) CD4 и (b) CD8-зависимых клеток. (ii. a) неокрашенный контроль CD95 и CD122-управляемых клеток T _SM , (ii. b) неокрашенный контроль IL-6- и TGF-β — , продуцирующих перитонеальные макрофагальные клетки и (ii.c) продуцирующие IL-17 клетки CD4 ⁺ . (iii. a) неокрашенный контроль IFN-γ — или продуцирующих IL-4 клеток CD4 ⁺ и (iii. b) клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IL-17. (iii. c) Неокрашенный контроль клеток CD4 ⁺ CD25 ⁺ и клеток, экспрессирующих FOXP3, в клетках CD4 ⁺ CD25 ⁺ . (iv. a) Неокрашенный контроль клеток, продуцирующих IL-17, с сигнатурным маркером CD95 клеток T _SM . (iv. b) неокрашенный контроль клеток, продуцирующих IL-17, экспрессирующих CD27 в клетках CD4 ⁺ и (iv.c) неокрашенный контроль клеток CD4 ⁺ , продуцирующих двойные цитокины IL-17 и IFN-γ.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008356.s007

(TIF)

Список литературы

1. 1. ВОЗ (2010) Глобальный доклад по борьбе с туберкулезом, 2010 г. Резюме. Cent Eur J Public Health 18: 237. pmid: 21361110
2. 2. Павловски А., Янссон М., Скольд М., Роттенберг М.Э., Каллениус Г. (2012) Сочетанная инфекция туберкулеза и ВИЧ. PLoS Pathog 8: e1002464.pmid: 22363214
3. 3. Zumla A, Raviglione M, Hafner R, von Reyn CF (2013) Туберкулез. N Engl J Med 368: 745–755. pmid: 23425167
4. 4. Becker Y (2004) Изменения в балансе цитокинов Т-хелперов 1 (Th2) и Т-хелперов 2 (Th3) во время ВИЧ-1-инфекции указывают на аллергический ответ на вирусные белки, который может быть обращен ингибиторами цитокинов Th3 и модификаторами иммунного ответа. — обзор и гипотеза. Гены вирусов 28: 5–18. pmid: 14739648
5. 5.Бхаттачарья Д., Данавиа С., Муэма Д.М., Акилимали Н.А., Мудли П., Тумби Н. и др. (2017) Клеточная архитектура спинальных гранулем и иммунологический ответ у больных туберкулезом, инфицированных ВИЧ. Front Immunol 8: 1120. pmid: 28955338
6. 6. Mutis T, Cornelisse YE, Ottenhoff TH (1993) Микобактерии индуцируют CD4 + Т-клетки, которые являются цитотоксичными и демонстрируют Th2-подобный профиль секреции цитокинов: гетерогенность цитотоксической активности и уровней секреции цитокинов. Eur J Immunol 23: 2189–2195.pmid: 8103743
7. 7. Haanen JB, de Waal Malefijt R, Res PC, Kraakman EM, Ottenhoff TH, de Vries RR et al. (1991) Отбор микобактериями подмножества Т-хелперов типа 1 человека Т-клеток человека. J Exp Med 174: 583–592. pmid: 1831489
8. 8. Бхаттачарья Д., Двиведи В.П., Майга М., Майга М., Ван Каер Л., Бишай В.Р. и др. (2014) Низкомолекулярная направленная иммунотерапия против рецидивирующей инфекции Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem 289: 16508–16515. pmid: 24711459
9. 9.Cooper AM, Dalton DK, Stewart TA, Griffin JP, Russell DG, Orme IM (1993) Диссеминированный туберкулез у мышей с нарушенным геном интерферона гамма. J Exp Med 178: 2243–2247. pmid: 8245795
10. 10. Двиведи В.П., Бхаттачарья Д., Чаттерджи С., Прасад Д.В., Чаттопадхьяй Д., Ван Каер Л. и др. (2012) Mycobacterium tuberculosis направляет дифференцировку Т-хелперных клеток 2, индуцируя продукцию интерлейкина-1бета в дендритных клетках. J Biol Chem 287: 33656–33663. pmid: 22810226
11. 11.Ravindran R, Krishnan VV, Khanum A, Luciw PA, Khan IH (2013) Исследовательское исследование иммуномодулятора плазмы и профилей антител у больных туберкулезом. Clin Vaccine Immunol 20: 1283–1290. pmid: 23761664
12. 12. Чаттерджи С., Двиведи В.П., Сингх Й., Сиддики И., Шарма П., Ван Каер Л. и др. (2011) Ранний секретируемый антиген ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis способствует защитным ответам Т-хелперов 17 зависимым от toll-подобным рецептором-2 образом. PLoS Pathog 7: e1002378.pmid: 22102818
13. 13. Khader SA, Cooper AM (2008) IL-23 и IL-17 при туберкулезе. Цитокин 41: 79–83. pmid: 18218322
14. 14. Бхаттачарья Д., Двиведи В.П., Кумар С., Редди М.К., Ван Каер Л., Мудли П. и др. (2014) Одновременное ингибирование дифференцировки Т-хелперов 2 и Т-регуляторных клеток небольшими молекулами повышает эффективность вакцины Bacillus Calmette-Guerin против туберкулеза. J Biol Chem 289: 33404–33411. pmid: 25315774
15. 15. Алерс Дж. Д., Беляков И. М. (2010) Вечные воспоминания: стратегии оптимизации памяти Т-клеток вакцины.Кровь 115: 1678–1689. pmid: 19
    5
16. 16. Henao-Tamayo MI, Ordway DJ, Irwin SM, Shang S, Shanley C, Orme IM (2010) Фенотипическое определение субпопуляций эффекторных и Т-лимфоцитов памяти у мышей, хронически инфицированных Mycobacterium tuberculosis. Clin Vaccine Immunol 17: 618–625. pmid: 20107011
17. 17. Masopust D, Ha SJ, Vezys V, Ahmed R (2006) История стимуляции диктует фенотип Т-лимфоцитов CD8: последствия для первичной вакцинации. J Immunol 177: 831–839.pmid: 16818737
18. 18. Wirth TC, Harty JT, Badovinac VP (2010) Регулирование количества и фенотипа CD8 + Т-клеток во вторичных иммунных ответах. Eur J Immunol 40: 1916–1926. pmid: 20411564
19. 19. Вирт Т.К., Сюэ Х.Х., Рай Д., Сабель Дж. Т., Баир Т., Харти Дж. Т. и др. (2010) Повторяющаяся стимуляция антигеном индуцирует ступенчатую диверсификацию транскриптома, но сохраняет основной признак дифференцировки CD8 (+) Т-клеток памяти. Иммунитет 33: 128–140. pmid: 20619696
20. 20.Гаттинони Л., Лугли Е., Джи Й., Поз З., Паулос С.М., Куигли М.Ф. и др. (2011) Подмножество Т-клеток памяти человека с подобными стволовым клеткам свойствами. Nat Med 17: 1290–1297. pmid: 21926977
21. 21. Lugli E, Dominguez MH, Gattinoni L, Chattopadhyay PK, Bolton DL, Song K и др. (2013) Превосходная персистенция стволовых клеток Т-памяти поддерживает долгоживущую Т-клеточную память. Дж. Клин Инвест 123: 594–599. pmid: 23281401
22. 22. Gattinoni L, Speiser DE, Lichterfeld M, Bonini C (2017) Т-стволовые клетки памяти в здоровье и болезнях.Nat Med 23: 18–27. pmid: 28060797
23. 23. Mateus J, Lasso P, Pavia P, Rosas F, Roa N, Valencia-Hernández CA и др. (2015) Низкая частота циркулирующих CD8 + Т-стволовых клеток памяти у пациентов с хроническим диабетом и тяжелыми формами заболевания. PLoS Negl Trop Dis 9: e3432. pmid: 25569149
24. 24. Дарра PA, Patel DT, De Luca PM, Lindsay RW, Davey DF, Flynn BJ и др. (2007) Многофункциональные клетки Th2 определяют коррелят опосредованной вакциной защиты от Leishmania major.Нат Мед 13: 843–850. pmid: 17558415
25. 25. Lindenstrom T, Agger EM, Korsholm KS, Darrah PA, Aagaard C, Seder RA и др. (2009) Субъединичная вакцинация против туберкулеза обеспечивает долгосрочный защитный иммунитет, характеризующийся многофункциональными Т-клетками памяти CD4. J Immunol 182: 8047–8055. pmid: 19494330
26. 26. Jayaraman P, Jacques MK, Zhu C, Steblenko KM, Stowell BL, Madi A, et al. (2016) TIM3 способствует истощению Т-клеток во время инфекции Mycobacterium tuberculosis.PLoS Pathog 12: e1005490. pmid: 26967901
27. 27. Крузен В.М., Грошель М.И., Мартинсон Н., Зумла А., Мейрер М., ван дер Верф Т.С. и др. (2017) Нестероидные противовоспалительные препараты как терапия туберкулеза под контролем хозяина: систематический обзор. Front Immunol 8: 772. pmid: 28713389
28. 28. Сингх Д.К., Двиведи В.П., Ранганатан А., Бишай В.Р., Ван Каер Л., Дас Г. (2016) Блокада канала Kv1.3 K + повышает эффективность вакцины БЦЖ за счет увеличения Т-лимфоцитов в центральной памяти.J Infect Dis 214: 1456–1464. pmid: 27571906
29. 29. Mpande CAM, Dintwe OB, Musvosvi M, Mabwe S, Bilek N, Hatherill M и др. (2018) Функциональная антиген-специфическая память стволовых клеток (TSCM) CD4 (+) Т-клетки индуцируются инфекцией Mycobacterium tuberculosis человека. Front Immunol 9: 324. pmid: 29545791
30. 30. Чон Д. (2017) Рекомендации ВОЗ по лечению лекарственно-устойчивого туберкулеза, обновление 2016 г .: Применимость в Южной Корее. Tuberc Respir Dis (Сеул) 80: 336–343.
31. 31. Cholo MC, Mothiba MT, Fourie B, Anderson R (2017) Механизмы действия и терапевтическая эффективность липофильных антимикобактериальных агентов клофазимина и бедаквилина. J Antimicrob Chemother 72: 338–353. pmid: 27798208
32. 32. Gocke AR, Lebson LA, Grishkan IV, Hu L, Nguyen HM, Whartenby KA, et al. (2012) Делеция Kv1.3 смещает Т-клетки в сторону иммунорегуляторного фенотипа и делает мышей устойчивыми к аутоиммунному энцефаломиелиту. J Immunol 188: 5877–5886.pmid: 22581856
33. 33. Seder RA, Darrah PA, Roederer M (2008) Качество Т-клеток в памяти и защите: значение для дизайна вакцины. Nat Rev Immunol 8: 247–258. pmid: 18323851
34. 34. Raghuvanshi S, Sharma P, Singh S, Van Kaer L, Das G (2010) Mycobacterium tuberculosis уклоняется от иммунитета хозяина, рекрутируя мезенхимальные стволовые клетки. Proc Natl Acad Sci U S. A 107: 21653–21658. pmid: 21135221
35. 35. Keswani RK, Tian C, Peryea T., Girish G, Wang X, Rosania GR (2016) Репозиционирование клофазимина в качестве нацеленного на макрофаги фотоакустического контрастного агента.Sci Rep 6: 23528. pmid: 27000434
36. 36. Байк Дж., Стрингер К.А., Мане Дж., Розания Г.Р. (2013) Анализ многоуровневого распределения и биоаккумуляции клофазимина показывает массивную реакцию секвестрации ксенобиотиков, опосредованную иммунной системой. Противомикробные агенты Chemother 57: 1218–1230. pmid: 23263006
37. 37. Молива Дж. И., Тернер Дж., Торреллес Дж. Б. (2017) Иммунные ответы на вакцинацию Bacillus Calmette-Guerin: почему они не защищают от микобактерий туберкулеза? Фронт Иммунол 8: 407.pmid: 28424703
38. 38. Imkamp FM (1981) Клофазимин (лампрен или B663) в лепровых реакциях. Лепр Rev 52: 135–140. pmid: 7242222
39. 39. Browne SG, Harman DJ, Waudby H, McDougall AC (1981) Клофазимин (Lamprene, B663) в лечении лепроматозной лепры в Соединенном Королевстве. 12-летний обзор 31 случая, 1966–1978 гг. Int J Lepr Other Mycobact Dis 49: 167–176. pmid: 7196886
40. 40. Свансон Р.В., Адамсон Дж., Мудли С., Нгкобо Б., Аммерман, Северная Каролина, Дорасами А. и др.(2015) Фармакокинетика и фармакодинамика клофазимина на мышиной модели туберкулеза. Антимикробные агенты Chemother 59: 3042–3051. pmid: 25753644
41. 41. Венкатесан К. (1989) Клинические фармакокинетические аспекты лечения больных проказой. Clin Pharmacokinet 16: 365–386. pmid: 2661102
42. 42. Schaad-Lanyi Z, Dieterle W, Dubois JP, Theobald W, Vischer W (1987) Фармакокинетика клофазимина у здоровых добровольцев. Int J Lepr Other Mycobact Dis 55: 9–15.pmid: 3559339
43. 43. Зиральдо С., Гонг С., Киршнер Д.Е., Линдерман Дж. Дж. (2015) Стратегическое праймирование с использованием нескольких антигенов может дать фенотипы клеток памяти, оптимизированные для заражения Mycobacterium tuberculosis: компьютерное исследование. Front Microbiol 6: 1477. pmid: 26779136
44. 44. Huster KM, Busch V, Schiemann M, Linkemann K, Kerksiek KM, Wagner H, et al. (2004) Избирательная экспрессия рецептора IL-7 на Т-клетках памяти позволяет идентифицировать раннее CD40L-зависимое образование отдельных подмножеств CD8 + Т-клеток памяти.Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5610–5615. pmid: 15044705
45. 45. Левинсон Д.А., Левинсон Д.М., Скриба Т.Дж. (2017) Полифункциональные CD4 (+) Т-клетки как мишени для вакцинации от туберкулеза. Front Immunol 8: 1262. pmid: 264
46. 46. Орландо В., депутат Ла Манна, Голетти Д., Пальмиери Ф., Ло Прести Е., Йоостен С.А. и др. (2018) Т-клетки CD4 человека с наивным фенотипом продуцируют множественные цитокины во время инфекции Mycobacterium Tuberculosis и коррелируют с активным заболеванием.Front Immunol 9: 1119. pmid: 29875774
47. 47. Мурански П., Restifo Н. П. (2013) Основы приверженности и пластичности клеток Th27. Кровь 121: 2402–2414. pmid: 23325835
48. 48. Bettelli E, Carrier Y, Gao W., Korn T., Strom TB, Oukka M и др. (2006) Реципрокные пути развития для генерации патогенных эффекторных Th27 и регуляторных Т-клеток. Природа 441: 235–238. pmid: 16648838
49. 49. Чжао Д.М., Ю С., Чжоу Х, Харинг Дж. С., Хельд В., Бадовинац В. П. и др.(2010) Конститутивная активация передачи сигналов Wnt способствует образованию Т-клеток памяти CD8. J Immunol 184: 1191–1199. pmid: 20026746
50. 50. Bhatt K, Verma S, Ellner JJ, Salgame P (2015) Поиск коррелятов защиты от туберкулеза. Clin Vaccine Immunol 22: 258–266. pmid: 25589549
51. 51. Мурански П., Борман З.А., Керкар С.П., Клебанофф К.А., Джи Й., Санчес-Перес Л. и др. (2011) Клетки Th27 являются долгоживущими и сохраняют молекулярную подпись, подобную стволовым клеткам.Иммунитет 35: 972–985. pmid: 22177921
52. 52. Lindenstrom T, Woodworth J, Dietrich J, Aagaard C, Andersen P, Agger EM (2012) Индуцированные вакциной клетки th27 сохраняются в течение длительного периода после вакцинации в качестве отдельного и фенотипически стабильного подмножества памяти. Инфекция иммунной 80: 3533–3544. pmid: 22851756
53. 53. Pepper M, Linehan JL, Pagan AJ, Zell T, Dileepan T, Cleary PP, et al. (2010) Различные пути бактериальной инфекции индуцируют долгоживущие клетки памяти Th2 и короткоживущие клетки Th27.Nat Immunol 11: 83–89. pmid: 19935657
54. 54. Brites D, Gagneux S (2015) Совместная эволюция Mycobacterium tuberculosis и Homo sapiens. Immunol Rev 264: 6–24. pmid: 25703549
55. 55. Nemes E, Geldenhuys H, Rozot V, Rutkowski KT, Ratangee F, Bilek N, et al. (2018) Профилактика инфекции M. tuberculosis с помощью вакцины h5: IC31 или ревакцинации БЦЖ. N Engl J Med 379: 138–149. pmid: 29996082
56. 56. Pollock KM, Whitworth HS, Montamat-Sicotte DJ, Grass L, Cooke GS, Kapembwa MS, et al.(2013) Иммунофенотипирование Т-клеток позволяет отличить активный туберкулез от латентного. J Infect Dis 208: 952–968. pmid: 23966657
57. 57. Cieri N, Oliveira G, Greco R, Forcato M, Taccioli C, Cianciotti B и др. (2015) Генерация стволовых Т-клеток памяти человека после трансплантации гаплоидентичных Т-избыточных гемопоэтических стволовых клеток. Кровь 125: 2865–2874. pmid: 25736310
58. 58. Zhang Y, Joe G, Hexner E, Zhu J, Emerson SG (2005) Реагирующие на хозяина стволовые клетки памяти CD8 + при болезни трансплантат против хозяина.Нат Мед 11: 1299–1305. pmid: 16288282
59. 59. Miyahara Y, Odunsi K, Chen W, Peng G, Matsuzaki J, Wang RF, (2008) Генерация и регуляция человеческих CD4 + IL-17-продуцирующих Т-клеток при раке яичников. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 15505–15510. pmid: 18832156
60. 60. Муцида Д., Пак Й., Ким Г., Туровская О., Скотт И., Кроненберг М. и др. (2007) Реципрокная дифференцировка Th27 и регуляторных Т-клеток, опосредованная ретиноевой кислотой. Наука 317: 256–260. pmid: 17569825

Результаты испытаний противотуберкулезной вакцины открывают потенциал для ревакцинации БЦЖ

Исследование является первым испытанием «профилактики инфекции», проведенным в отношении туберкулеза, ведущего в мире убийцы инфекционных заболеваний…

Aeras, некоммерческая организация, занимающаяся разработкой вакцин против туберкулеза (ТБ), объявила о результатах инновационного клинического испытания, которое предоставляет новые обнадеживающие доказательства того, что вакцины против ТБ могут предотвратить устойчивые инфекции у подростков из группы высокого риска.

В испытании фазы 2 по профилактике инфекций, проведенном в Южной Африке, ревакцинация вакциной Бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) значительно снизила устойчивое инфицирование туберкулезом у подростков. Экспериментальная вакцина-кандидат, h5: IC31, также уменьшала стойкие инфекции, хотя и не на статистически значимых уровнях. Однако тенденция, наблюдаемая для h5: IC31, является первым случаем, когда субъединичная вакцина показала какие-либо признаки способности защищать человека от инфекции или заболевания ТБ.

ТБ-инфекции, развившиеся в ходе исследования, были определены с помощью теста QuantiFERON-TB Gold in Tube (QFT-GIT), коммерчески доступного анализа крови, который помогает диагностировать инфекции ТБ. В испытании считалось, что люди с отрицательным результатом на QFT-GIT не болеют туберкулезом. В ходе испытания измерялась скорость, с которой люди переходили к положительному результату QFT-GIT, что свидетельствует о наличии туберкулезной инфекции. Те люди, которые дали положительный результат QFT-GIT последовательно в течение 6 месяцев, считались устойчивыми.

Новые противотуберкулезные вакцины необходимы для прекращения этой смертоносной эпидемии, особенно с ростом числа лекарственно-устойчивых штаммов

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), около одной трети населения мира страдает так называемой латентной инфекцией ТБ. , что означает, что люди были инфицированы бактериями ТБ, но (пока) не заболели этим заболеванием и не могут передавать его. Люди, инфицированные бактериями ТБ, имеют 10-процентный риск заболеть ТБ на протяжении всей жизни. Больные туберкулезом могут заразить 10-15 других людей при тесном контакте в течение года.Без надлежащего лечения 45% ВИЧ-отрицательных людей с туберкулезом в среднем и почти все ВИЧ-положительные люди с туберкулезом умрут.

Д-р Марк Хатерилл, директор Южноафриканской инициативы по созданию противотуберкулезных вакцин (SATVI) в Университете Кейптауна и главный исследователь исследования, сказал: «Мы рады провести первую известную рандомизированную плацебо-контролируемую профилактику. испытания на туберкулез и продемонстрировать, что вакцинация может снизить уровень устойчивой инфекции туберкулеза в условиях высокой передачи.Хотя ни одна из вакцин не оказалась статистически значимой в предотвращении начальной инфекции ТБ, мы чрезвычайно воодушевлены сигналами, наблюдаемыми для обеих вакцин в предотвращении устойчивых инфекций ТБ. Мы считаем, что результаты этого нового дизайна исследования принесут значительную научную пользу в области понимания инфекции ТБ, и, основываясь на этом положительном сигнале, мы с нетерпением ждем возможности тестирования потенциала таких вакцин для предотвращения заболевания ТБ среди неинфицированных подростков в более широком смысле. более традиционное клиническое испытание профилактики заболеваний.”

В исследовании оценивалась вакцинация h5: IC31 и ревакцинация БЦЖ с точки зрения безопасности, иммуногенности и способности предотвращать начальные и устойчивые инфекции ТБ среди здоровых подростков в провинции Западный Кейп в Южной Африке. h5: IC31 — кандидатная субъединичная вакцина для исследования, разрабатываемая совместно Aeras и Sanofi Pasteur, вакцинным бизнесом Sanofi (EURONEXT: SAN) (NYSE: SNY) и Statens Serum Institut. БЦЖ — единственная лицензированная вакцина против туберкулеза, доступная во всем мире.Клиническое испытание проводилось в SATVI и в Исследовательском центре Эмавундлени (часть Центра ВИЧ Десмонда Туту). Его финансировали Санофи Пастер, министерство международного развития Соединенного Королевства, и компания Aeras. Исследование было одобрено Советом по контролю за лекарственными средствами Южной Африки и соответствующими местными независимыми комитетами по этике.

Д-р Линда-Гейл Беккер, ведущий исследователь исследования, главный операционный директор Фонда Десмонда Туту по борьбе с ВИЧ и президент Международного общества по СПИДу, сказала: «Мы хотели бы поблагодарить всех участников исследования и их семьи за участие. в этом новом клиническом испытании.Мы считаем, что полученные результаты важны и требуют дальнейшего изучения других субъединичных вакцин и переоценки ревакцинации БЦЖ как потенциальной стратегии профилактики ТБ в странах с высокой заболеваемостью. Эффективная вакцина против туберкулеза остается актуальной глобальной целью ».

Д-р Жаки Ши, генеральный директор Aeras, заявил: «Новые вакцины против туберкулеза необходимы для прекращения этой смертоносной эпидемии, особенно с ростом числа штаммов, устойчивых к лекарствам. В этом инновационном исследовании мы не только наблюдали важные результаты для БЦЖ, мы также увидели первый ранний сигнал об эффективности против инфекции, продемонстрированный субъединичной противотуберкулезной вакциной-кандидатом (h5: IC31).Кроме того, мы установили, что новый дизайн исследования по профилактике инфекций может предоставить доказательства наличия биологического сигнала раньше и с меньшими затратами, чем исследования эффективности традиционных противотуберкулезных вакцин. Собранные данные послужат основой для следующей серии клинических исследований, а также позволят найти корреляты защиты от устойчивой инфекции. Позже в этом году компания Aeras и ее партнеры с нетерпением ждут объявления первичных результатов исследования фазы 2b по профилактике заболеваний с использованием M72 / AS01E, еще одной субъединичной вакцины-кандидата, и начала двух клинических испытаний фазы 2 с дополнительной, многообещающей субъединицей-кандидатом.”

В исследовании приняли участие 990 ВИЧ-отрицательных здоровых подростков (от 12 до 17 лет), вакцинированных в младенчестве вакциной БЦЖ. Все участники были равномерно рандомизированы в три группы исследования: плацебо, h5: IC31 или ревакцинация БЦЖ. Все участники были проверены, чтобы убедиться, что они не были инфицированы Mycobacterium tuberculosis (Mtb) до вакцинации в исследовании. В начале этого новаторского исследования, подтверждающего концепцию, статистическая значимость была установлена ​​на уровне одностороннего p <0,1, чтобы повысить риск наблюдения ложноположительного сигнала эффективности, а не ложноотрицательного.

Данные показали, что обе вакцины оказались безопасными и вызвали иммунный ответ у исследованных подростков. В исследовании не сообщалось о серьезных нежелательных явлениях, связанных с вакцинацией, а наиболее частым нежелательным явлением, связанным с вакциной, было отек места инъекции у участников, подвергшихся ревакцинации БЦЖ, типичный для вакцинации БЦЖ.

Что касается первичной конечной точки эффективности, 134 участника дали положительный результат на исходную инфекцию Mtb, измеренную с помощью преобразования QFT-GIT из отрицательного в положительный (плацебо = 49; БЦЖ = 41; h5: IC31 = 44).По сравнению с плацебо ни одна вакцина не достигла статистической значимости в предотвращении начального преобразования QFT-GIT. Наблюдаемая эффективность вакцины составила 20,1% (p = 0,15) для ревакцинации БЦЖ и 9,4% (p = 0,32) для h5: IC31.

Что касается вторичной конечной точки эффективности, 82 участника продемонстрировали устойчивую конверсию QFT-GIT, продолжавшуюся не менее 6 месяцев после первоначальной конверсии (плацебо = 36; БЦЖ = 21; h5: IC31 = 25). Эти участники были оценены, чтобы увидеть, вернутся ли они к отрицательному результату, измеренному с помощью теста QFT-GIT.В группе ревакцинации БЦЖ эффективность вакцины для предотвращения устойчивой инфекции составляла 45,4% (p = 0,013), а в группе h5: IC31 эффективность вакцины составляла 30,5% (p = 0,08).

Побочные эффекты ревакцинации БЦЖ: 12 случаев

Бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ) — это живой аттенуированный штамм, используемый для вакцинации против туберкулеза. Местные и системные побочные эффекты, хотя и редки, связаны с вакциной БЦЖ. Они часто встречаются в случаях передозировки и неправильной вакцинации. Эти осложнения также возникают в некоторых случаях ревакцинации.Это было ретроспективное исследование, продолжавшееся 5 лет с января 2000 г. по март 2005 г. Под наблюдением находились 12 пациентов с осложнениями после ревакцинации БЦЖ. Пациенты были ревакцинированы БЦЖ после отрицательной внутрикожной реакции. Регистрировались следующие параметры: возраст, пол, история болезни, метод вакцинации, тип осложнения, лечение и исход. Было 10 мужчин и 2 женщины, средний возраст 21 год (от 19 до 23 лет). Среднее время до консультации составило 4 недели.Осложнения включали подкожный абсцесс в 8 случаях, глубокие хронические язвы в 4 случаях, осложненные оститом плечевой кости в одном случае. Введенная доза составила 0,1 мл у 9 пациентов и 1 мл у 3 других (т.е. в 10 раз больше рекомендуемой дозы). У шести пациентов были обширные и прогрессирующие изъязвления, один положительный результат посева, наличие гранулемы с казеумным некрозом и один случай плечевого остита, и было назначено специальное лечение. ВОЗ больше не рекомендует ревакцинацию, поскольку ее эффективность считается низкой или даже нулевой.Внутрикожная инъекция — эталонный метод вакцинации БЦЖ. Технические ошибки, такие как введение слишком высокой дозы вакцины или подкожное введение раствора вакцины, увеличивают частоту побочных эффектов. В нашем исследовании три пациента ошибочно получили 1 мл вакцины, и в 9 случаях инъекция была слишком глубокой. В литературе имеется мало сообщений о механизмах, лежащих в основе этих постревакцинальных происшествий; Обсуждаются два основных физиопатологических механизма: инфекционный и иммунологический.Нет единого мнения относительно лечения этих осложнений. Шесть из 12 пациентов получали специфическую терапию в течение 6 месяцев.

Редакционная

В среднем я даю БЦЖ 50 детям. каждый месяц. Однако, несмотря на максимальную заботу о процедура прививки, у меня 10% отказ от вакцины БЦЖ занимать. Я отношусь к этому как к неудачной вакцинации БЦЖ, если нет шрама наблюдается даже после 90 дней инокуляции.Делаю ревакцинацию и Я получаю 90% положительных результатов от ревакцинированных детей. В В этом контексте я прошу следующих пояснений: 1. Правильно ли предполагать «провалившийся» Вакцинация БЦЖ, если рубец БЦЖ не виден даже через 90 дней после прививка? 2. Принята ли частота 10% отказов BCG? приемлемо? 3. Почему я получаю 90% положительных результатов в ревакцинированные младенцы? 4.Обязательно ли делать вакцинацию БЦЖ каждый ребенок, у которого нет шрама от БЦЖ, даже если мать уверены, что БЦЖ была сделана ребенку в возрасте около 1 месяца? 5. Обязательно ли проводить пробу Манту в все дети старше 1 года, у которых нет рубца от БЦЖ и которым Я хочу сделать ревакцинацию БЦЖ? Sudhakar Joshi, D4, Panchavati CHS, Marol, Andheri (E), Mumbai 400 059, Индия. Ответить Доктор Судхакар Джоши заслуживает нашей признательности за его личные наблюдения по поводу вакцинации БЦЖ, а также за ясные и сжатые вопросы, которые он задавал. Позвольте мне ответить им последовательно. 1. Хотя правильно предполагать неудачно Вакцинация БЦЖ, если через 90 дней после прививки не видно рубцов, не обязательно означает, что он действительно не смог вызвать некоторый иммунный ответ, который может быть подтвержден лабораторными исследованиями.С клинически невозможно отличить отказавший вакцинация и отсутствие рубца, несмотря на иммунную ответ, лучший клинический вариант — сделать прививку БЦЖ в секунду. время. Этот вопрос обсуждался в нескольких предыдущих статьях в Индийская педиатрия, как статья, письмо в редакцию и Диалог иммунизации. 2. Неудача (дуба со шрамом формирование) 10% равняется 90% успешности, что составляет вполне респектабельно и приемлемо.Этот показатель говорит нам, что вакцина удовлетворительна, метод посева хороший. 3. Наблюдение доктора Джошиса о 90% успешности предыдущие неудачные случаи требуют некоторого внимания. Я предполагаю что эволюция локального поражения и образование в них рубца были больше похоже на первичную вакцинацию БЦЖ, а не на ускоренную реакция ревакцинации, или так называемая положительная проба БЦЖ. Другими словами, я предполагаю, что они вели себя так, как будто у них нет предыдущий опыт работы с BCG.Если мое предположение верно, оно показывает, что отказ был: (а) свидетельством истинного отказа, а не просто отсутствие рубца, несмотря на иммунный ответ; и (б) случайный явление, а не из-за факторов хозяина или агента. Возможно это может быть связано с какой-то нераспознанной ошибкой прививки техники, но такое объяснение маловероятно, так как успех высокая скорость как при первичной, так и при второй прививке неудачных дел. 4. Ответ на вопрос уже есть доступно в опыте доктора Джошиса. Очевидно, что младенцы нормально реагирует на вторую прививку, что доказывает, что это правильная стратегия. Если бы у этих младенцев был иммунитет, они показал бы ускоренный отклик (и, как указывалось ранее, я Предположим, что это было не так). Проблема не в этих 99%, но оставшийся 1%, у которого не было шрамов и шрамов, несмотря на два попытки.Снова есть две возможности, а именно: нет. иммунный ответ или отсутствие рубца, несмотря на иммунный ответ. Мое мнение состоит в том, что мы должны предположить, что первое имеет место; в других словами, в идеале должна быть предпринята третья попытка, когда снова процент ответов может составлять 90%. Математически также шанс казалось бы, успех 90% для каждой попытки, для последовательных совокупный ответ на каждую дополнительную дозу 90%, 99% и 99.9%. С третьей попытки я бы остановился, даже если бы не было взять, при условии иммунного ответа без шрама. Теперь было процент успеха составил 99% в первый раз и 99,9% во второй. прививка, я бы не пошел на третью попытку. Я верующий в нашем собственном опыте в качестве руководства, при условии, что мы интерпретируем наши результаты вдумчиво. 5. Нет, пробу Манту делать не обязательно. перед повторной вакцинацией БЦЖ дошкольникам, у которых в анамнезе Прививка БЦЖ, но без рубца.Не было бы вреда дать их BCG снова, и вы увидите, что некоторые, ускоренные ответ в других и отсутствие ответа в некоторых. Научно говоря, было бы идеально протестировать их с помощью PPD и классифицировать их как людей без ответа (что означает отсутствие предшествующего иммунного ответа), с положительным ответом, но уплотнение от 5 до 10 мм (наиболее вероятно иммунный ответ из-за более ранней БЦЖ) или уплотнение 15 мм и более (наиболее вероятно заражены микобактериями туберкулеза).В первая группа заслуживает второй попытки с BCG. Это будет трудно интерпретировать уплотнения размером от 3 до 4 мм, и моя предвзятость следует рассматривать их как иммунные из-за БЦЖ. Будет сложнее интерпретировать уплотнение от 11 до 14 мм относительно того, вызвано ли оно БЦЖ или M. tuberculosis, но я ошибаюсь, полагая, что это из-за инфекции M. tuberculosis, особенно потому, что нет Шрам от БЦЖ. Те дети с М.туберкулезная инфекция (15 мм или обязательно больше уплотнения, и, возможно, от 11 до 14 мм также), на мой взгляд, следует провести химиопрофилактику изониазидом. Я понимаю, что в реальном мире не так много внимания нам платят за эти вопросы, и я думаю, что мы делаем ошибку, не относиться к этим вопросам очень серьезно. Без такой осторожной обращение с инфицированными детьми, борьба с туберкулезом текущими тактика лечения исключительно открытой болезни легких у взрослых не удастся, по моему личному мнению, достичь цели. Т. Джейкоб Джон, председатель Комитета МАП по иммунизатину, Индийская академия педиатрии, 2/91 E2, Камалакшипурам, Веллор 632 002, Теннесси, Индия.

ТБ Онлайн — ревакцинация БЦЖ демонстрирует потенциал для повышения иммунитета против ТБ

Когда молодые люди из Индии, вакцинированные при рождении, снова получают вакцину БЦЖ, их иммунный ответ против туберкулеза (ТБ) улучшается, и у них может быть меньше шансов заболеть этой болезнью, говорится в новом исследовании, проведенном учеными из Центр исследования инфекционных заболеваний (CIDR), Индийский институт науки (IISc).

Исследование, опубликованное в журнале JCI Insight , было проведено в сотрудничестве с клиницистами и исследователями из Индии, США, Европы и Великобритании. Это показывает, что ревакцинация БЦЖ увеличивает количество и реакцию определенного подмножества белых кровяных телец, называемых клетками Th27, которые участвуют в борьбе с туберкулезом.

«Мы можем впервые продемонстрировать иммуногенность ревакцинации в контексте Индии», — говорит Аннапурна Вьякарнам, научный сотрудник Рамалингасвами и приглашенный научный сотрудник CIDR, а также старший автор статьи.«Он индуцирует правильный тип иммунных клеток».

Считается, что около четверти населения мира страдает латентным туберкулезом — они переносят в организме бактерии Mycobacterium tuberculosis , но не имеют симптомов болезни. Вероятность заболевания туберкулезом в течение жизни у них составляет 5-15 процентов.

Единственной клинически одобренной противотуберкулезной вакциной является БЦЖ, ослабленная форма бактерии под названием Mycobacterium bovis , которую вводят при рождении в Индии. Он эффективен в профилактике туберкулезного менингита и военных заболеваний у младенцев, но его эффекты редко сохраняются дольше 15-20 лет.Молодые люди особенно подвержены риску заболевания туберкулезом.

«БЦЖ — это испытанная вакцина», — говорит Вьякарнам. «Сейчас есть большой интерес к попыткам увидеть, способна ли ревакцинация молодых людей в возрастной группе 18-22 лет повысить противотуберкулезный иммунитет».

Она и ее коллеги набрали 200 молодых людей из города Маданапалле, штат Андхра-Прадеш, где находится один из старейших противотуберкулезных санаториев в стране. Команда была заинтересована в том, чтобы выяснить, обеспечивает ли ревакцинация дополнительную защиту в среде с высокой заболеваемостью туберкулезом.

Всем добровольцам при рождении была сделана БЦЖ. Они были разделены на две группы: те, у кого был латентный туберкулез, определенный с помощью стандартного теста под названием QuantiFERON-TB Gold test, и те, у кого не было бактерий. В каждой группе половина пациентов была вакцинирована БЦЖ. Образцы крови были извлечены и проанализированы в течение 9 месяцев, и были проведены подробные исследования проточной цитометрии для проверки наличия до 256 субпопуляций иммунных клеток.

Было обнаружено, что по сравнению с невакцинированными людьми у ревакцинированных лиц более чем в два раза больше иммунных клеток, принадлежащих к определенным подмножествам, называемым CD4 и CD8 T-клетками.Эти клетки производят сигнальные белки, называемые цитокинами, которые активизируют иммунный ответ организма против туберкулеза. Ревакцинация также увеличила количество клеток врожденного иммунитета, которые образуют первую линию защиты от туберкулеза.

«Наше исследование также показало, что предположительно безопасно ревакцинировать людей, уже инфицированных Mycobacterium tuberculosis , но без болезни (иначе называемых субъектами с латентным туберкулезом)», — говорит Вякарнам.

Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли ревакцинация помочь взрослым с латентной инфекцией стать устойчивыми к развитию болезни или полностью устранить бактерии из своего организма, говорят исследователи.

ССЫЛКА:
ревакцинация БЦЖ усиливает адаптивные полифункциональные Th2 / Th27 и врожденные эффекторы у взрослых индейцев IGRA + и IGRA–, опубликовано в JCI Insight , декабрь 2019 г. (https://insight.jci.org/articles/view/ 130540) (pdf)

Источник: Индийский институт науки

.