На основании сходства ДНК и состава жирных кислот род Francisella был разделен на три вида: F.tularensis ( Ft ), F. philomiragia и F. hispaniensis . ¹ Ft далее классифицируется на пять подвидов: Ft tularensis (также называемый Ft тип A), Ft holarctica ( Ft тип B), Ft novicida , mediasi вариант Ft holarctica , найденный в Японии. ² В случае F. novicida следует также отметить, что на основании высокой степени генетического родства между Ft и F.novicida , F. novicida был отнесен к подвидам в размере форинтов в 2006 году. Однако было формальное возражение в пользу того, чтобы F. novicida были определены как отдельный вид в 2010 году, ³ , в котором он Было высказано предположение, что первоначальное назначение было основано исключительно на генетическом родстве и не принимало во внимание фенотипические и геномные различия между Ft и F. novicida . Однако, несмотря на это возражение, первоначальное присвоение F.novicida как подвид Ft был подтвержден. ⁴ Что еще более важно, из вышеупомянутых видов только типы A и B являются основными причинами заболеваний человека, тогда как F. novicida вирулентен для мышей, но не вирулентен для человека. ⁵ F. philomiragia — возбудитель ондатры. Ft тип A — это высоковирулентный организм, который встречается исключительно в Северной Америке и ассоциируется с кроликами и широким спектром членистоногих-переносчиков. ⁶ Ft тип A также более генетически разнообразен и эволюционно старше, чем умеренно вирулентный Ft типа B. ² Кроме того, молекулярная характеристика идентифицировала две отдельные клады или генотипы Ft типа A, которые различаются по своему географическому положению и вирулентности. ^7,8 Напротив, Ft типа B обычно менее вирулентен и ассоциируется с полуводными грызунами, зайцами, клещами и комарами. Он широко распространен в большей части северного полушария и является единственным видом, обитающим в Европе. ⁶ Кроме того, исследования молекулярного типирования выявили три различных биоварианта Ft типа B, которые различаются по структуре устойчивости к антибиотикам и географическому расположению в Европе. ⁹ Штамм живой вакцины (LVS) является ослабленным вариантом Ft подвида holarctica . Однако форинтов типа A представляет наибольшую опасность с точки зрения биотерроризма и болезней человека, поскольку он очень вирулентен и внутрикожно (ID), или вдыхание всего от 10 до 50 бактерий может вызвать серьезную инфекцию и смерть. ^10,11

Иммунный ответ на

Обычно считается, что иммунные ответы на Ft индуцируются с помощью традиционных механизмов индукции иммунного ответа, которые включают антиген Ft (Ag). поглощение, обработка и представление B-клетками, дендритными клетками (DC), макрофагами (MØ) и последующая активация Ft -специфичных T- и B-клеток.Таким образом, ключом к разработке эффективной вакцины против Ft является четкое понимание тех иммунных компонентов, которые необходимы для защиты. Кроме того, путь заражения, а также бактериальная вирулентность в конечном итоге будут определять степень защиты, достигаемую данным способом вакцинации. Ft может заразить хозяина несколькими путями: язвенно-язвенным (через царапины на коже), легочным (через легкие), ротоглоточным (через желудочно-кишечный тракт), окулоглоточным (инфекция через конъюнктиву) и брюшным тифом (путь передачи может быть через проглатывание). ^12–14 Также важно отметить, что, хотя было продемонстрировано, что все подвиды Ft могут инфицировать людей, в большинстве исследований, направленных на понимание иммунного ответа на Francisella , использовались мыши. Кроме того, важно отметить, что штамм типа A очень вирулентен как для людей, так и для мышей. ^2,15 Точно так же штамм типа B Ft holarctica , который включает Ft LVS, вирулентен как для мышей, так и для человека, однако мыши гораздо более восприимчивы. ⁵

Гуморальный иммунитет

Роль гуморального иммунитета в разрешении инфекции и защите от Ft остается спорной, отчасти из-за общепринятого мнения о том, что клеточные иммунные ответы более важны для защиты от внутриклеточных патогенов. ¹⁶ Однако ряд исследований продемонстрировал, что гуморальный иммунитет может играть роль в защите от туляремии, что согласуется с наблюдением, что Ft имеет внеклеточную фазу. ^16–18 Более того, исследования показали, что и мышиные, и человеческие ответы антител (Ab) схожи с точки зрения распознавания Ag, причем Ab преимущественно направлены против бактериальных липополисахаридов (LPS). В случае людей устойчивый ответ по антителам вырабатывается в течение 2 недель после иммунизации или инфицирования, в то время как максимальный ответ антител у мышей наступает через 7 недель после заражения. ^16,19–22 Более того, исследования ясно показали роль иммуноглобулина (Ig) A и IgG в защите. ^{16,19,22–31} В частности, пассивная иммунизация наивных мышей иммунной сывороткой от Ft LPS, убитых нагреванием Ft LVS или живых Ft LVS-иммунизированных животных обеспечивает защиту от последующих Ft LVS-инфекция. Тем не менее, мыши, зараженные Ft SchuS4, не защищены. ^16,22,30,31 Кроме того, пассивный перенос Ft -специфических IgM или IgG обеспечивал защиту от инфекции Ft LVS. ²⁵ Кроме того, сыворотка, выделенная у людей, иммунизированных Ft LVS, индуцировала значительную защиту у мышей против инфекции Ft LVS. ²⁹ Однако наиболее значимо пассивная иммунизация наивных мышей иммунной сывороткой от мышей, переживших инфекцию Ft SchuS4 после лечения левофлоксацином, показала защиту против заражения Ft SchuS4 у мышей-реципиентов. ²⁷ В других исследованиях пассивный перенос антител, специфичных для фракции мембранного белка Ft LVS, мог усилить лечение низкими дозами гентамицина и обеспечить защиту от респираторного заражения Ft SchuS4 при введении в 1-й и 4-й дни после введения. -испытание. ³² Дополнительные исследования, подтверждающие роль Ат, продемонстрировали, что индуцированный вакциной иммунитет против легочной туляремии теряется у мышей с дефицитом IgA. ^16,23,24,28 В случае IgG-опосредованной защиты также важно отметить, что требуются рецепторы Fcγ (FcγR). ^16,22 В частности, Kirimanjeswara et al. ²² продемонстрировали, что внутрибрюшинная инокуляция мышей-реципиентов иммунной сывороткой от Ft LVS-иммунизированных животных может успешно защитить мышей-реципиентов дикого типа (WT) от IN Ft LVS. испытание.Однако защитная способность Ft LVS-специфических иммунных сывороток была потеряна, когда мышей с нокаутом общей γ-цепи (KO) FcγR использовали в качестве наивных реципиентов. ²²

В заключение, хотя общепринято, что Abs действительно опосредует защиту в случае вызова Ft LVS (тип B), в случае вызова Ft SchuS4 (тип A) важность Ab более спорно. В частности, остается неясным, что одного только антитела с помощью вакцинации будет достаточно для обеспечения полной и последовательной защиты от заражения Ft типа A.

Клеточный иммунитет

Уже более двух десятилетий считается, что клеточный иммунитет (CMI) играет решающую роль в защите от туляремии. ¹⁶ Это мнение было частично связано с внутриклеточной природой инфекции Ft . Таким образом, ранние исследования роли CMI были сосредоточены на CD4 + и CD8 + Т-клетках, ³³ , хотя появляющиеся данные также показывают критическую роль DC, MØ, ³⁴ полиморфно-ядерных нейтрофилов (PMN) и естественных киллеров (NK). клетки. ³⁵

Что касается Т-клеток, также было высказано предположение, что Т-клетки являются первичной популяцией клеток, ответственной за опосредование иммунитета против Ft . ¹⁶ В частности, как CD4, так и CD8 Т-клетки могут пролиферировать и продуцировать интерферон-γ (IFN-γ) в ответ на ряд белков Ft . ³³ Кроме того, истощение CD4 T-клеток, CD8 T-клеток или IFN-γ отменяет индуцированный вакциной иммунитет против инфекции типа A Ft SchuS4. ^36,37 Кроме того, исследования продемонстрировали, что пассивная защита, наблюдаемая при введении Ft -специфических Ab мышам-реципиентам, наивным реципиентам, зависит от IFN-γ и зрелых Т-клеток у этих мышей, лишенных IFN-γ или атимусных голых мышей. мыши не были защищены от инфекции LVS Ft после адоптивного переноса иммунной сыворотки мыши. ^16,25

Инфицированные MØ являются преобладающим местом бактериальной репликации внутри хозяина, что несколько неожиданно, истощение альвеолярных MØ с использованием липосомального клодроната не препятствует прогрессированию заболевания и смерти у мышей, инфицированных IN с Ft LVS. ²² Этот результат, вероятно, частично связан со способностью Ft реплицироваться в других клетках-хозяевах, включая эпителиальные клетки и DC. ^35,38–40 В частности, многочисленные исследования показали, что Ft может инфицировать DC, препятствовать созреванию DC и тем самым ослаблять иммунный ответ в течение первых 72 часов инфекции, что приводит к беспрепятственному росту и распространению на системные органы. ^16,35,39,41 Тем не менее, в исследовании клодроната также было продемонстрировано, что альвеолярные MØ имеют решающее значение для пассивной Ab-опосредованной защиты, поскольку, когда эти клетки истощаются, защита теряется. ²² В этом отношении также было показано, что альвеолярные M0 действительно интернализуются и убивают Ft при обработке IFN-γ и иммунной сывороткой. ²² Таким образом, MØ играют роль в клиренсе патогенов, что является оптимальным при наличии Ft -специфических Ab и IFN-γ.

В случае PMN их роль в разрешении инфекции Ft , аналогичная роли Ab в разрешении инфекции Ft типа A, является спорной. Хотя Ab-опосредованное истощение PMN предполагает, что эти клетки необходимы для выживания при первичной внутрикожной (ID) или внутривенной (IV) инфекции Ft , это не относится к интраназальному (IN) заражению. ^35,42,43 Было продемонстрировано, что ни истощение, ни рекрутирование PMN в легкие мышей, инфицированных IN Ft SchuS4, не влияют на бактериальную нагрузку или время выживания. ⁴³ Интересно, что PMN, продуцирующие IFN-γ, обнаруживаются в месте инфицирования в течение 72 часов, что указывает на потенциально защитную роль цитокинов, выделяемых этими клетками. ^16,35,43,44 Также было продемонстрировано, что Ab-опосредованная защита пассивно перенесенной Ft LVS-специфической иммунной сыворотки теряется, когда PMN истощаются, и мышей впоследствии вводят IN с Ft LVS. ²²

NK-клетки являются ранним ответчиком на инфекцию Ft и, таким образом, считаются ранним источником IFN-γ. ^45,46 Кроме того, NK-клетки играют ключевую роль в регуляции образования гранулемы печени, что помогает контролировать распространение бактерий. ⁴⁷ Интересно, что истощение NK-клеток снижает среднее время выживания после первичной инфекции, но не влияет на индуцированный вакциной иммунитет, поскольку меньше NK-клеток рекрутируется в легкие иммунизированных и зараженных мышей по сравнению с неиммунизированными контрольными мышами. ^23,45 Это говорит о том, что, хотя NK-клетки являются ранними ответчиками на инфекцию и продуцируют IFN-γ, они необходимы только после первичного воздействия на наивных людей.

В заключение, что касается вышеупомянутых клеток и разработки вакцины, очевидно, что индукция Т-клеток памяти и, в частности, Т-хелперных клеток 1 (Th2), продуцирующих IFN-γ, вероятно, будет ключом к развитию эффективная стратегия вакцинации против Ft . В поддержку этого утверждения исследования также показали, что, хотя и Ab, и IFN-γ могут иметь решающее значение для защиты, индуцированной вакциной, ²⁴ потребность в Ab может быть преодолена, когда уровни IFN-γ достаточно высоки. ²⁸ Тем не менее, данные также свидетельствуют о том, что Ab может играть защитную роль, дополняя защитное действие IFN-γ в индуцированной вакциной защите против инфекции Ft типа A.

Иммунный ответ при инфекции и вакцинации

Иммунный ответ человека на инфекцию Ft и вакцинацию рассматривался в другом месте. ⁴⁸ Вкратце, в случае естественной инфекции, Ft -специфических IgM, IgG и IgA Abs выявляются через ~ 2 недели после заражения.Подобно инфекции Ft у мышей, большая часть ответа Ab направлена ​​на Ft LPS. ²¹ Также аналогично тому, что наблюдается у мышей, продукция ex vivo цитокинов Th2-типа, таких как IFN-γ, TNF-α и IL-2, Т-клетками CD4 и CD8 наблюдается рестимулированными лимфоцитами, полученными от инфицированных туляремией. частные лица. ^49,50 Подобно естественной инфекции, в случае вакцинации с использованием Ft LVS, вводимых посредством скарификации, Ft -специфических IgM, IgA и IgG-антител обнаруживаются в сыворотке через 2 недели после вакцинации, а лимфоциты от вакцинированных лиц. рестимулированные ex vivo продуцируют цитокины Th2-типа, в частности IFN-γ. ^20,51 Тем не менее, важно также отметить, что в случае ответов Ab, как и у мышей, инфицированных Ft , образование антител против Ft не обязательно является предиктором защиты от последующего заражения вирулентным вирусом. Ft организмов типа A.

Из-за своей высокой инфекционности, высокого уровня смертности при очень низкой инфекционной дозе (от десяти до 50 организмов) и способности распыляться, Ft был назначен агентом биологической защиты категории А. Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC).Необходимость вакцины дополнительно подчеркивается тем фактом, что, хотя штаммы WT Ft действительно реагируют на лечение антибиотиками, которое включает фторхинолоны, тетрациклины и аминогликозиды, штаммы ⁵² Ft были сконструированы так, чтобы быть устойчивыми к антибиотикам. ^14,15 Кроме того, несмотря на обширные исследования и инвестиции за последние 15 лет, вакцины, одобренной FDA, не существует. Таким образом, остается острая потребность в эффективной вакцине Ft .Далее обсуждаются различные стратегии, которые использовались для достижения этой цели.

Живые аттенуированные вакцины

Живые аттенуированные вакцины на данный момент показали наибольшие перспективы, хотя опасения по поводу реверсии остаются серьезным препятствием на пути их использования в качестве вакцины Ft . Ряд живых аттенуированных вакцин-кандидатов был изготовлен Советским Союзом из Ft holarctica в 1940-х и 1950-х годах. ⁵³ Однако форинтов LVS — единственная доступная на Западе вакцина для борьбы с туляремией. ⁵⁴ Однако, хотя Ft LVS действительно обеспечивает частичную защиту от проблемы типа A у людей, ⁵⁴ он не лицензирован в США, в первую очередь из-за неопределенности относительно его источника ослабления и его нестабильности в культуре. ^53,55 Однако, несмотря на то, что Ft LVS не одобрены в качестве вакцины, значительные дополнительные деньги и усилия были потрачены на разработку безопасной и эффективной ослабленной вакцины Ft с использованием Ft LVS (), Ф.novicida () и Ft SchuS4 (). Наши собственные исследования (неопубликованные данные) и другие исследования ⁵⁶ с использованием SodB мутанта Ft LVS ясно продемонстрировали потенциал для создания защиты от первичной инфекции, а также от вторичного воздействия высоких доз до Ft SchuS4 при иммунизации этим ослабленным организмом (). Таким образом, если будет разработана полностью защитная аттенуированная вакцина, в которой проблемы безопасности устранены или дополнительно сведены к минимуму, возможно, с помощью множественных целевых / четко определенных мутаций, этот подход все же может дать сильный кандидат на вакцину Ft .

Острая защита и защита в период выздоровления мышей C57BL / 6, вакцинированных живой аттенуированной вакциной Ft ( мутант SodB ) и впоследствии зараженных высокой дозой Ft SchuS4.

Примечания: самок мышей C57BL / 6 были иммунизированы ID либо PBS, либо ∼ 1 × 10 ³ КОЕ аттенуированного мутанта Ft LVS SodB , выращенного в среде BHI в 50 мкл в день 0 и усиленных IN на на 21 день либо 20 мкл PBS, либо ~ 1 × 10 ³ КОЕ аттенуированного мутанта Ft LVS SodB .Затем мышей заражали IN на 42 день с помощью 75 КОЕ Ft SchuS4 (∼60–70 × LD ₅₀ ) и впоследствии наблюдали в течение 30 дней на выживаемость ( A ). Через 35 дней после первичного заражения выжившим повторно вводили IN с использованием 70 КОЕ SchuS4, а затем наблюдали в течение 30 дней на выживаемость ( B ). Через 35 дней после вторичного заражения выжившим снова вводили IN 3500 КОЕ из Ft SchuS4, а затем снова наблюдали в течение 30 дней на выживаемость ( C ).*** P ≤0,001.

Сокращения: футов, Francisella tularensis ; ID, внутрикожный; PBS, фосфатно-солевой буфер; IN, интраназальный; LVS, штамм живой вакцины; LD ₅₀ , средняя летальная доза; КОЕ — колониеобразующая единица; BHI, инфузия мозга и сердца.

Таблица 1

Ft LVS живые аттенуированные вакцины на основе

Таблица 2

Живые аттенуированные вакцины на основе F. novicida

Таблица 3

Ft Живые аттенуированные вакцины на основе SchuS4

Инактивированные вакцины Ft

Более 70 лет назад, Foshay и его исследования группа попыталась разработать первую убитую вакцину от туляремии. ^57,58 Хотя препараты вакцины Foshay были способны защищать нечеловеческих приматов от Ft SchuS4, ⁵³ , они проявляли значительную токсичность, включая образование некротических повреждений. Кроме того, не наблюдалось значительной защиты у лабораторных работников или в последующих контролируемых испытаниях на животных. ^57,58 В соответствии с последним исследованием, более поздние попытки разработки убитой вакцины Ft также имели неоднозначный успех.

В то время как включение адъюванта Фрейнда в убитую (обработанную фенол-мертиолатом) Ft LVS или Ft SchuS4 не увеличивало эффективность вакцины Ft , ⁵⁹ — убитую нагреванием вакцину Ft LVS 12 экспрессия в векторе на основе вируса вазикулярного стоматита приводила к увеличению клиренса LVS Ft по сравнению с неадъювантной вакциной. ³¹ В другом исследовании вакцинация слизистой оболочки инактивированным LVS Ft (i Ft ) LVS (обработанным параформальдегидом или УФ) в сочетании с IL-12 обеспечила> 90% защиту от смертельного заражения Ft LVS.Эта защита коррелировала с повышенным бактериальным клиренсом, уменьшением воспаления тканей и повышением Ft -специфических ответов IgG и IgA Ab в сыворотке. Однако эта стратегия оказалась неэффективной для защиты от вызова Ft SchuS4. ²³ Аналогичным образом, в то время как Eyles et al ⁶⁰ показали, что внутримышечная иммунизация мышей BALB / c i Ft с адъювантом иммуностимулирующими комплексами (ISCOMS) или предварительно приготовленные ISCOMS, смешанные с иммуностимулирующими олигонуклеотидами CpG, обеспечивали надежную защиту от респираторных проблем с Ft holarctica HN63, тот же вакцинный состав не защищал от провокации малыми дозами аэрозоля Ft SchuS4.

Альтернативный подход к использованию адъювантов включал использование FcγR-нацеленных моноклональных антител (mAb) -i Ft иммунных комплексов (IC). Такие IC при введении IN индуцировали полную защиту от заражения Ft LVS и до 50% защиты от заражения Ft SchuS4. ²⁴ В соответствии с этой повышенной защитой также наблюдались усиленные гуморальные и клеточные иммунные ответы по сравнению с Ft , вводимыми отдельно. ²⁴ Bitsaktsis et al. ²⁸ также продемонстрировали, что добавление адъюванта CTB к i Ft может аналогичным образом индуцировать полную защиту мышей, зараженных Ft LVS, и частичную защиту мышей, зараженных Ft SchuS4. Наблюдаемая защита также коррелировала с повышенным продуцированием IFN-γ, как и в исследованиях с использованием IC mAb-i Ft в качестве иммуногена. ²⁴ Таким образом, хотя убитые вакцины с меньшей вероятностью вызывают сильный клеточный иммунный ответ, в отличие от ослабленных вакцин, наблюдалась успешная защита от штамма Ft типа A. ²³ .Важно отметить, что также считается, что убитые вакцины обеспечивают значительное преимущество в безопасности по сравнению с аттенуированными вакцинами.

Субъединичные вакцины

С точки зрения производства, безопасности и одобрения FDA, идеальная вакцина против туляремии будет использовать подход рекомбинантных субъединиц, который устранит возможность реверсии, которая может возникнуть с живыми аттенуированными вакцинами, и значительно снизит вероятность заражения. токсичность, которая может возникнуть с убитыми вакцинами. Однако до настоящего времени не было идентифицировано белков Ft , способных генерировать сильный защитный иммунитет против заражения Ft типа A. ^{15,33,61–63} Кроме того, хотя LPS, очищенный от Ft LVS, или как часть неочищенной мембранной фракции, был использован в качестве кандидата на вакцину и обеспечивает некоторую защиту от инфекции LVS Ft , LPS имеет доказала свою неэффективность в качестве защитного иммуногена против Ft SchuS4, что затрудняет разработку субъединичной вакцины против Ft в настоящее время. ^{5,19,30,64–67} Дополнительные усилия по разработке такой вакцины включали вакцинацию мышей капсулярным полисахаридом O-Ag в присутствии адъюванта или химически конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином, что усиливало защиту от Ft LVS. но не смог защитить мышей от заражения аэрозолем более вирулентными штаммами Ft . ^64,68 Кроме того, при иммунизации мышей LPS Ft LVS в присутствии PorB, порин, продуцируемый Neisseria meningitidis и лигандом TLR2, увеличивал выживаемость мышей, зараженных Ft LVS, дополнительные исследования все еще необходимы, чтобы определить, эффективен ли этот подход против более вирулентных подвидов Ft . ⁶⁹ Кроме того, иммуноген LPS, полученный из Ft SchuS4, не генерировал защитного иммунитета против последующего заражения Ft SchuS4, хотя он действительно обеспечивал защиту, когда мышей заражали Ft holarctica . ^67,70

Другие бактериальные компоненты также были исследованы на предмет использования в субъединичной вакцине, но с ограниченным успехом. Tul4, поверхностный липопротеин Ft , при введении отдельно не вызывал иммунных ответов, способных контролировать бактериальную репликацию Ft LVS после внутривенного заражения. ⁷¹ Кроме того, иммунизация мышей Tul4 и DnaK, белком теплового шока Ft , в присутствии GPI (полусинтетический адъювант тритерпеновых гликозидов) также может индуцировать значительную защиту мышей от респираторного заражения Ft LVS.Однако об эффективности этого подхода в защите от заражения Ft SchuS4 не сообщалось. ⁷² В других исследованиях использовалась внутрибрюшинная иммунизация белками внешней мембраны Ft , эмульгированными в адъюванте Фрейнда, которые действительно защищали около 50% мышей, зараженных IN Ft SchuS4, хотя специфический белок, ответственный за эту защиту, не был идентифицирован. ⁶⁶ Из-за обилия белка А внешней мембраны Ft (FopA) и знания, что FopA-специфические Ab обнаруживаются в сыворотках выздоравливающих пациентов, Hickey et al. ⁷³ стремились определить, будет ли FopA обеспечивать защиту от Ft вызов.Хотя иммунизация FopA в присутствии IL-12 и гидроксида алюминия действительно защищала мышей от заражения IN или ID Ft LVS, она не обеспечивала защиты от заражения ID Ft SchuS4. ⁷³ Таким образом, в то время как многочисленные исследования были сосредоточены на использовании / идентификации Ft -Ag, который может быть включен в субъединичную вакцину Ft , ключевым требованием для субъединичной вакцины является идентификация одного Ag, который обеспечивает эффективную защиту от Штамм Ft до сих пор не встречен.

Бактериальные и вирусные векторные вакцины

Аттенуированные микроорганизмы, такие как бактерии и вирусы, успешно используются в качестве носителей для доставки вакцинных АГ. Кроме того, появление генной инженерии облегчило изменение патогенных микроорганизмов, тем самым ослабив их и позволив им служить носителями для гетерологичных АГ. Кроме того, внутренние характеристики микроорганизмов, такие как LPS и другие молекулы молекулярного паттерна, ассоциированные с патогенами, позволяют таким носителям вызывать сильные врожденные иммунные ответы, которые, в свою очередь, могут управлять устойчивым адаптивным иммунным ответом против целевого Ag (ов) / организма. ^74,75 Для этой цели был разработан ряд микробов: Salmonella , Listeria monocytogenes , ⁷⁶ Vibrio cholerae , молочнокислые бактерии, ⁷⁷ Bordetella pertussis ,

Несмотря на 15 лет интенсивных исследований, направленных на разработку эффективной вакцины против высоковирулентного типа A Ft , полностью защитная вакцина, одобренная Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA), остается труднодостижимой.Хотя аттенуированные вакцины дали наиболее многообещающие результаты, с относительно большим выбором потенциальных кандидатов, опасения по поводу безопасности и, в частности, реверсии, представляют собой значительные препятствия для лицензирования аттенуированной вакцины Ft . Некоторые многообещающие результаты были также получены с убитыми вакцинами, в частности, при нацеливании i Ft на FcγR IN. Однако и в этом отношении необходимо преодолеть ряд ограничений. Во-первых, в этом случае не была достигнута 100% защита от штамма типа A Ft (SchuS4).Кроме того, образование IC mAb-i Ft может значительно варьироваться от партии к партии, и, как результат, наблюдаемая степень защиты также может значительно варьироваться, что также приводит к значительным трудностям в отношении воспроизводимости вакцины и, следовательно, утверждения FDA. . Таким образом, в этом случае необходимо будет разработать стратегию вакцины, направленную на FcγR, которая может быть более легко получена, более четко определена и, кроме того, задействует активирующий FcγR без взаимодействия с ингибирующим FcγR (FcγRIIB).Фактически, такая вакцина на форинтов в настоящее время разрабатывается в нашей лаборатории. Что касается субъединичных вакцин, это представляет собой идеальный подход с точки зрения стоимости, безопасности и производства и может быть реализован с использованием подхода как белковой, так и ДНК-вакцины. Однако основным ограничивающим фактором в обоих случаях является отсутствие идентифицированного защитного Ag Ft для включения в такую ​​вакцину. Учитывая отсутствие прогресса в этом отношении за последние 15 лет, включение нескольких Ft Ag может предоставить альтернативные средства создания эффективной субъединичной вакцины.Таким образом, несмотря на отсутствие успеха до сих пор, все еще существует ряд жизнеспособных вариантов для производства полностью защитной вакцины Ft . Более того, ряд опубликованных исследований, многие из которых перечислены в — и -, представленные в этом обзоре, демонстрируют защиту от заражения Ft типа A после вакцинации.

Что касается будущих исследований, направленных на разработку вакцины Ft , также очевидно, что ряд важных факторов, таких как штамм бактерий, питательная среда, генетика используемой модели животного и пол, могут влиять на защиту и должны быть рассмотрены.Как указано в -, эти факторы сильно различаются между исследованиями и лабораториями и могут объяснять несоответствия в исследованиях защиты, наблюдаемые между лабораториями. Таким образом, в конечном итоге будет необходимо определить оптимальные условия в каждом из этих случаев и последовательно использовать эти условия при оценке эффективности вакцины Ft .

Разработка вакцины против туляремии: паралич или прогресс?

Abstract

Francisella tularensis ( Ft ) — грамотрицательный межклеточный патоген и средство биологической защиты категории А.Однако, несмотря на 15 лет значительных государственных инвестиций и интенсивных исследований, направленных на разработку одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США вакцины против форинтов , основная цель остается недостижимой. В этой статье дается обзор исследовательских усилий, направленных на разработку вакцины Ft , а также ряда важных факторов, некоторые из которых только недавно были признаны таковыми, которые могут существенно повлиять на разработку и оценку эффективности вакцины Ft. Наконец, дается оценка вероятности появления вакцины Ft , одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, и возможных средств, с помощью которых этого можно достичь.

Ключевые слова: Сексуальные предубеждения, влияние СМИ, дифференциальная защита, клеточный иммунитет, гуморальный иммунитет

Введение

Пятнадцать лет спустя после нападений 2001 года на Всемирный торговый центр в Нью-Йорке, когда было признано, что такие организмы, как Francisella tularensis ( Ft ) может быть использована в качестве средства биологической защиты, вакцина от туляремии, одобренная Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), остается недостижимой целью. И это несмотря на значительные финансовые вложения с 2001 года в исследования и разработку такой вакцины.Таким образом, остается вопрос, возможна ли вакцина Ft . В этом обзоре обсуждается то, что мы узнали с 2001 года, смешивающие факторы, которые, возможно, помогли вызвать у некоторых чувство паралича в области вакцины против туляремии, а также вопрос о том, остается ли одобренная FDA вакцина против туляремии.

Микробиология и этиология

Кислые фосфатазы гидролизуют широкий спектр субстратов, включая белки с фосфорилированными тирозинами. У Francisella было описано пять кислых фосфатаз (AcpA, AcpB, AcpC, Hap и гомолог Hap). Кислая фосфатаза А (AcpA) необходима для выживания внутримакрофагов и эффективного ухода от фагосомы. ⁷⁰ A производное F. novicida , мутировавшее в четырех из этих генов, acpA , acpB , acpC и hap , было дефектным для роста и выживания в макрофагах, неспособных выйти из фагосомы, и был сильно ослаблен у мышей. Мыши, вакцинированные этим четверным мутантом, выжили при жестком заражении F. novicida дикого типа. ⁷²

Ферменты, кодируемые dsbB — и dsbA , необходимы для того, чтобы катализировать образование дисульфидных связей у грамотрицательных бактерий.Белки DsbA и DsbB участвуют в сборке нескольких факторов вирулентности у бактерий. ⁴⁶ Манн и его коллеги ввели мутации в FTT0107c и FTT1103, которые кодируют DsbB- и DsbA-подобные белки, соответственно, в Schu S4. Оба мутанта были неспособны реплицироваться внутри клетки, и мутант FTT1103 также показал нарушенную способность покидать фагосому. Оба мутантных штамма были сильно аттенуированы у мышей, однако только мутант FTT1103 индуцировал защиту от заражения Schu S4 дикого типа. ^81,82 Важно отметить, что мутант Schu S4 FTT1103 является единственным живым аттенуированным штаммом, который продемонстрировал высокий уровень защиты от заражения дикого типа типа A в строгой модели мыши C57BL / 6.

FTT918 кодирует гипотетический белок 58 кДа, который является фактором вирулентности неизвестной функции. Делеция этого гена в Schu S4 приводила к снижению скорости внутриклеточного роста перитонеальных макрофагов мыши. Мыши, вакцинированные мутантом с делецией FTT918, были защищены от низких доз заражения (~ 10 КОЕ) вирулентного штамма типа A FSC033. ¹⁰³

Пили типа IV считаются факторами вирулентности в широком спектре бактерий, а гены, кодирующие пили типа IV, были идентифицированы в геномах Francisella. ⁵⁸ В F. tularensis подвида holarctica делеция пилиновых генов привела к ослаблению вирулентности у мышей и нарушению способности распространяться от начального очага инфекции к селезенке. ³⁰ Исследования в LVS показали, что делеции в pilF , кодирующем сборочную АТФазу, и pilT , кодирующем дизассемблирующую АТФазу, вызывали полную потерю пилей.В то время как оба мутанта pilF и pilT LVS были способны размножаться внутриклеточно в клетках, оба мутанта были дефектными в отношении адгезии к макрофагам, эпителиальным клеткам и гепатоцитам. Мутанты ослабляли у мышей при внутрикожном введении. ¹⁴

Каталаза кодируется katG и используется бактериями для детоксикации бактерицидных соединений, таких как H ₂ O ₂ и ONOO ^—. Мутанты Schu S4 и LVS в katG продемонстрировали повышенную чувствительность к H ₂ O ₂ in vitro, но не были затронуты их способностью к внутриклеточной репликации в перитонеальных макрофагах мыши.Мутант LVS katG был аттенуирован у мышей, в то время как мутант Schu S4 katG сохранил свою вирулентность. ⁶³

Мутанты регуляторных белков

вакцины против туляремии

Hum Vaccin. Авторская рукопись; доступно в PMC 11 июля 2011 г.

Опубликован в окончательной редакции как:

Hum Vaccin. 2009 Dec; 5 (12): 832–838.

PMCID: PMC3132883

NIHMSID: NIHMS307467

Школа медицины Университета Мэриленда, Центр разработки вакцин, Балтимор, Мэриленд, США

Реферат

Francisella tularensis — это агент категории A, для которого разработка вакцины и средств противодействия является приоритетом. Возобновление интереса к этому патогену за последние восемь лет привело к получению огромного количества новых данных как о самом патогене, так и о его взаимодействии с клетками-хозяевами. Эта информация способствовала разработке различных вакцин-кандидатов, включая бесклеточную субъединицу, убитые целые клетки и живые аттенуированные. Этот обзор суммирует прогресс и перспективы этих различных кандидатов.

Ключевые слова: общественное здравоохранение, францизелла, туляремия, вакцина, бактерии, инфекция, биозащита

Введение

Francisella tularensis , не образующая спор, инкапсулированная грамотрицательная коккобацилла, является этиологическим агентом потенциально смертельной болезни. зоонозная болезнь туляремия. После биотеррористических атак сибирской язвы в США в 2001 году F. tularensis было помещено в список избранных агентов Категории А как один из шести патогенов, которые имели наивысший приоритет для разработки превентивных контрмер.С тех пор был достигнут значительный прогресс как в понимании патогенного процесса F. tularensis , так и в понимании иммунного ответа хозяина. Это, в свою очередь, стимулировало разработку новых интересных кандидатов на вакцину от туляремии.

F. tularensis впервые был идентифицирован как причина туляремии в 1911 году во время вспышки чумной болезни среди белок, населяющих озеро Туларе в Калифорнии. С тех пор было показано, что F. tularensis может инфицировать широкий круг животных, включая млекопитающих, птиц, земноводных, рыб и беспозвоночных. ⁷³ Это разнообразие помогает объяснить различные разговорные названия, связанные с туляремией, включая кроличью лихорадку, заячью лихорадку, оленьую лихорадку и лихорадку леммингов. ⁷³ F. tularensis способен проникать и реплицироваться внутри макрофагов, а также нефагоцитарных клеток (включая гепатоциты и альвеолярные эпителиальные клетки). ^22,31,42 F. tularensis проникает в клетки как с помощью нового механизма асимметричных петель псевдоподов ¹⁹ , так и с помощью рецепторно-зависимого механизма, который, как было показано, вовлекает рецепторы-поглотители класса A, ⁷⁹ фактор комплемента C3 рецептор (CR3 и CR4), ^5,7,90 рецептор IgG (FcγR), сурфактантный белок А и рецептор маннозы. ⁹⁰ После интернализации F. tularensis способно избегать деградационной среды фаголизосомы ^13,15,17,59 в цитоплазму, где он реплицируется. Высокая вирулентность F. tularensis является результатом многих факторов, включая его способность размножаться в больших количествах в тканях и органах хозяина, а также его способность вызывать выраженный воспалительный ответ. ^8,23,28,39 У людей синдром заболевания зависит как от пути заражения, так и от вирулентности инфекционного штамма.Инфекция кожным, оральным или легочным путями приводит к язвенно-глоточной, ротоглоточной или легочной (ранее называемой брюшным тифом) туляремии, соответственно, и самые высокие показатели смертности связаны с легочной формой заболевания. ⁹⁴ Два подвида, F. tularensis подвида holarctica (также называемого Типом B) и F. tularensis подвида tularensis (Тип A), несут ответственность за подавляющее большинство случаев туляремии человека во всем мире. Менее вирулентные штаммы типа B встречаются в Северной Америке, Европе и Азии, а более вирулентные штаммы типа A встречаются в основном в Северной Америке. ⁵⁴ Третий подвид, F. tularensis подвид novicida, который редко является патогеном человека, широко изучается в качестве модели туляремии. В то время как организм F. tularensis широко распространен в Соединенных Штатах, заболеваемость туляремией отсутствует, поскольку ежегодно регистрируется около 100 случаев туляремии человека. Эти случаи возникают в основном в результате прямого контакта с инфицированными животными или укусов членистоногих-переносчиков (например, клещей), хотя также описано легочное заболевание в результате вдыхания аэрозолей, образующихся при стрижке газонов или щетке в зараженных клещами районах. ^27,45,67

Привлекательность F. tularensis в качестве потенциального биологического оружия проистекает из его способности распространяться аэрозольным путем, его чрезвычайно низкой инфекционной дозы и его способности вызывать серьезные заболеваемость и смертность. ²³ Кроме того, F. tularensis имеет историю использования оружия, впервые задокументированную японцами для ведения войны между 1932–1945 гг., ⁴³ и позже как бывшим Советским Союзом, так и США. ^18,23 Эта история породила опасения, что F. tularensis может быть использовано в качестве биологического оружия в будущем. ^74,75 Текущим стандартом лечения туляремии является лечение антибиотиками, поскольку эта терапия очень эффективна, если ее применять на ранней стадии заражения. ⁹⁸ Однако неспецифические симптомы туляремии, которые включают увеличение лимфатических узлов, лихорадку и летаргию, могут привести к неправильной идентификации патогена, что может отсрочить соответствующую терапию. Терапевтические возможности могут быть дополнительно ограничены развитием естественной устойчивости к антибиотикам или созданием устойчивых штаммов.Поэтому безопасная и эффективная вакцина, которую можно использовать как в профилактических целях, среди целевых групп населения, таких как военные или медицинские работники, а также среди населения в целом в кризисной ситуации, была бы очень ценным инструментом общественного здравоохранения.

Два основных факта подтверждают возможность разработки вакцины против францизеллы. Во-первых, после естественного инфицирования была продемонстрирована иммуноспецифическая защита от повторного заражения. ^11,97 Во-вторых, иммунизация штаммом живой вакцины (LVS) продемонстрировала эффективность против заражения людей диким типом.LVS произошел от аттенуированного штамма типа B, который был разработан и использовался для массовой вакцинации в Советском Союзе в 1946 году. ¹⁰¹ LVS был передан из Института Гамалеи в Москве в Медицинский научно-исследовательский институт инфекционных болезней армии США, Форт-Детрик, штат Мэриленд. в 1956 году. Было показано, что вакцинация лабораторного персонала группы риска LVS снижает заболеваемость лабораторной респираторной туляремией. ¹² LVS, хотя и безопасен для людей, может быть летальным для мышей и, следовательно, стал ценным инструментом для использования в мышиной модели инфекции туляремии.Хотя LVS продемонстрировал принципиальное доказательство того, что вакцина может вызвать защитный ответ, она остается нелицензированной для использования среди населения в целом. В ответ на желание разработать безопасную и эффективную вакцину против туляремии исследователи сосредоточили свои усилия на рациональном дизайне вакцин против туляремии с использованием трех основных методов: бесклеточной субъединицы, убитых цельноклеточных и живых аттенуированных вакцин.

Бесклеточные субъединичные вакцины

Бесклеточные субъединичные вакцины — это бесклеточные вакцины, которые получают из синтезированных или очищенных антигенных компонентов микроорганизма.Основное преимущество бесклеточных субъединичных вакцин состоит в том, что они не заразны. Антигены, распознаваемые либо Т-клетками, либо иммунными сыворотками, представляют собой возможные кандидаты в вакцины на бесклеточные субъединицы.

В течение двух недель после заражения туляремией или иммунизации у людей вырабатывается устойчивый антительный ответ, который в первую очередь направлен против ЛПС. ^{2,50,56,57,97} Соответственно, LPS был исследован как потенциальный кандидат на вакцину F. tularensis . F. tularensis ЛПС тетраацилирован и поэтому только слабо активирует TLR4. ^20,25,41 Он не может индуцировать продукцию воспалительных цитокинов in vivo и in vitro ²⁰ , однако предварительная обработка F. tularensis LPS способна защитить мышей от последующего заражения LVS. ^{20,21,24,35,36,86} Было показано, что эта защита является в первую очередь гуморальной, поскольку пассивная инфузия сывороток от мышей F. tularensis , иммунизированных LPS, защищает наивных мышей от последующего заражения LVS. ³⁶ Однако эта пассивная защита не является действительно пассивной, необходимы Т-клетки, поскольку перенос сыворотки не защищает мышей, у которых истощены Т-клетки CD4 ⁺ или CD8 ⁺ . ³⁶ IFNγ также необходим, поскольку ни пассивный перенос иммунной сыворотки, ни прямая иммунизация LPS не обеспечивали защиты мышей IFNγ ^{— / —} . ^24,55

Исследования с использованием иммунизации целыми бактериями показали, что антитела против О-антигена F. tularensis LPS ответственны за LPS-опосредованную защиту. Пассивное введение антител, вызванных к LVS целых клеток, защищает от заражения LVS, в противном случае летального, в то время как антитела, вызванные иммунизацией штаммом с дефицитом O-антигена, F.tularensis LVS wbtA , не надо. ^91,92 Кроме того, пассивно вводимая кроличья антисыворотка против F. tularensis LVS, но не антисыворотка, обедненная анти-О-антителами, защищает мышей от летального заражения. ⁹¹ Однако другие исследования показали, что защитные антитела не ограничиваются О-антигеном ЛПС. Сыворотка, взятая у мышей, иммунизированных термоубитым мутантом LVS O-антигена (мутант wbtC , который полностью лишен экспрессии O-антигена), была способна защитить 80% наивных мышей от последующих i.п. вызов с LVS. ⁶⁰

То, что защита от F. tularensis может быть обеспечена посредством гуморального иммунитета, является спорным вопросом, поскольку F. tularensis является внутриклеточным патогеном. Преобладающая методология разработки вакцин предполагает, что гуморальный иммунитет играет решающую роль в защите от внеклеточных патогенов, в то время как клеточный иммунитет гораздо более важен для защиты от внутриклеточных патогенов. Однако недавние исследования показали, что большинство F.tularensis , выделенный из крови инфицированных мышей, локализовался в плазме, а не в лейкоцитах. ²⁹ Такая картина распределения наблюдалась независимо от способа инокуляции или размера, времени после инокуляции или вирулентности заражающего штамма. ²⁹

Одним из существенных недостатков использования ЛПС в качестве вакцины является его неспособность защищать от наиболее вирулентных штаммов. Иммунизация LPS, очищенным от LVS, полностью защищала мышей от заражения LVS и некоторыми вирулентными штаммами типа B.Вакцинация LVS LPS увеличивала среднее время до смерти, но не защищала от заражения штаммом типа A Schu S4. ³⁶ Возможно, что эти различия в выживаемости связаны с присущими им отличиями ЛПС от штаммов типов A и B. Однако исследования показали, что структура О-антигенов идентична у штаммов типа A и B ^41,80,100 , и иммунизация LPS, очищенным от Schu S4, не смогла защитить мышей от заражения Schu S4 и только увеличила среднее время до смерть. ⁸⁰ Следовательно, несопоставимые результаты LVS и заражения типа A после иммунизации LPS, скорее всего, связаны с различиями в вирулентности между штаммами и их различными требованиями к защите.

Одним из возможных способов увеличения защитной способности ЛПС может быть сочетание иммунизации ЛПС с индукцией иммунного ответа, опосредованного специфическими клетками Francisella. Эта идея оказалась многообещающей, так как мыши, иммунизированные LPS и получавшие бустер живого LVS, были защищены от заражения Schu S4. ³⁶ Кроме того, иммунизация мышей ЛПС в комбинации с Neisseria meningitidis PorB, лигандом TLR2 / 1, который, как было показано, усиливает костимулирующую активность Т-клеток антигенпрезентирующих клеток как in vitro, так и in vivo, ^{65 , 66,93} значительно улучшили выживаемость после интраназального заражения LVS по сравнению с иммунизацией только LPS F. tularensis . ¹⁶

В качестве альтернативной композиции субъединичной вакцины Huntley et al.исследовали потенциальную полезность белков внешней мембраны F. tularensis (OMP) в качестве бесклеточной субъединичной вакцины. Иммунизация 3 дозами нативных OMP с адъювантом обеспечивала защиту 50% мышей от интраназального заражения Schu S4. ⁴⁹

Бесклеточные субъединичные вакцины также могут использовать антигены, активирующие Т-клетки. Скрининг антигенов Т-лимфоцитов выявил пул эпитопов-кандидатов из антигенов Schu S4 для включения в рационально разработанную вакцину против туляремии. ⁶⁹ HLA-трансгенных мышей, иммунизированных подмножеством этих эпитопов, включенных в схему первичной пептидной буст-вакцины из цепочек ДНК, были защищены от смертельной интратрахеальной инфекции F. tularensis LVS. ⁶⁹

Другой Т-клеточный эпитоп, специфичный для F. tularensis , состоит из аминокислот 86–99 из 17-кДа липопротеина Tul4 (также известного как LpnA). Эти аминокислоты функционируют как иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп CD4 ⁺ у мышей B6, и Т-клетки, специфичные для этого эпитопа, могут составлять до 20% отвечающих Т-лимфоцитов CD4 ⁺ при острой инфекции Francisella. ^95,104 Однако иммунизация Salmonella typhimurium , экспрессирующая Tul4, ⁹⁶ , а также иммунизация Tul4, включенная в иммуностимулирующие комплексы ³⁸ , обеспечивала лишь частичную защиту от заражения LVS.

Убитые цельноклеточные вакцины

Успешные убитые цельноклеточные вакцины — это биологически сложные, неинфекционные препараты инфекционных агентов, которые способны вызывать защитный иммунный ответ. В 1940-х годах Ли Фошей разработал составы убитой цельноклеточной вакцины против туляремии путем фенолизации или экстракции ацетоном. ^32,33,51 Иммунизация нечеловеческих приматов вакциной Foshay предотвратила смерть после заражения 740 КОЕ Schu S4. Однако иммунизация вызвала побочные реакции у животных, включая местные некротические поражения и регионарную лимфаденопатию. ⁵¹ Введение вакцины Foshay добровольцам привело к развитию более легких реакций, но не смогло предотвратить развитие поражений после внутрикожного заражения 10 КОЕ Schu S4. ⁸⁸ Кроме того, введение вакцины Foshay не предотвращало и не изменяло развитие явной туляремии у людей, которые вдыхали 50 КОЕ Schu S4. ⁸⁷ Хотя в последние годы разработке убитой вакцины F. tularensis уделялось минимальное внимание, в 2007 г. — ⁴⁰ , Lavine et al. сообщили, что иммунизация убитым нагреванием F. tularensis LVS отдельно или в комбинации с вектором на основе вируса везикулярного стоматита, экспрессирующим IL-12, защищала мышей от последующих i.p. вызов с LVS. Оказалось, что эта защита опосредована антителами, поскольку сыворотка мышей, иммунизированных убитым нагреванием LVS, была способна защитить наивных животных от последующих i.п. вызов с LVS. ⁶⁰ Однако Baron et al. обнаружил, что i.n. инокуляция инактивированным LVS защищала только от последующего i.n. заражение живым LVS, когда инактивированные бактерии вводили в сочетании с рекомбинантным IL-12. ⁶

Живые аттенуированные вакцины

Живые аттенуированные вакцины в широком смысле определяются как вакцины, полученные из живых организмов, которые, хотя и ослаблены по вирулентности, все же остаются иммуногенными. Наиболее широко протестированной живой вакциной против туляремии является LVS.Множественные исследования заражения на приматах, отличных от человека, а также на людях продемонстрировали эффективность вакцинации LVS в обеспечении по крайней мере частичной защиты от заражения Schu S4; хотя степень защиты варьировалась в зависимости от пути и дозы введения вакцины и контрольного заражения. ^47,48,68,89 Тем не менее, хотя LVS продемонстрировал принципиальное доказательство того, что живой аттенуированный штамм может защищать от заражения, он страдает рядом недостатков, которые делают его неоптимальной вакциной.LVS основан на штамме типа B и обеспечивает лишь частичную защиту от вирулентного заражения типа A, молекулярный механизм его ослабления не определен, и LVS демонстрирует нестабильный фенотип колонии. ^26,44,78,102 Соответственно, исследователи попытались воспроизвести и улучшить защитную способность LVS путем создания полностью определенных, стабильных, аттенуированных мутантов. Современные молекулярные методы позволили сконструировать точные генетические мутации, приводящие к созданию полностью определенных мутантных штаммов. ³⁴

Гены, которые подверглись мутации, можно в общих чертах разделить на три группы: метаболические ферменты, факторы вирулентности и регуляторные белки (). Большинство целевых мутаций были сначала сконструированы и протестированы в LVS или F. novicida из-за простоты манипулирования этими штаммами и способности работать в условиях BSL-2. Это позволило исследователям идентифицировать многообещающие гены-мишени до их мутации в штаммах типа A и необходимости более высокого уровня сдерживания.

Таблица 1

Живые аттенуированные вакцины-кандидаты

Мутанты метаболических ферментов

Целевые мутации в генах, кодирующих критические ферменты, произошли в метаболических путях ослабляющих мутаций у многих бактериальных патогенов. ⁶¹ Анализ геномов Francisella выявил присутствие ферментов, которые участвуют в путях биосинтеза ароматических аминокислот. ^53,58 Хотя мутанты F. novicida , purA , purCD или purM были аттенуированы у мышей, они не защищали от гомологичного заражения дикого типа. Напротив, i.p. инъекция мутанта F. novicida purF вызвала иммунный ответ у мышей, который обеспечивал защиту от заражения родительским штаммом, но не против заражения Schu S4. ^83,99 Делеции в purMCD , guaA или guaB сильно аттенуированных Francisella LVS. ^76,77,86 Эти три мутантных штамма не распространялись в органах инфицированных мышей и не могли реплицироваться внутриклеточно в макрофагах. ^76,86 Мышей, вакцинированных мутантами LVS purMCD , guaA или guaB , защищали от летального заражения родительским штаммом LVS. Однако сингл i.n.иммунизация LVS purMCD не защищала мышей от i.n. и i.d. провокация низкими дозами Schu S4 типа А. ⁷⁷ Эти результаты контрастируют с результатами, полученными после иммунизации родительским LVS, поскольку один i.n. доза LVS защищала мышей от последующих низких доз i.d. И в. вызов с Schu S4. ⁷⁷ Мутанты Schu S4 guaA и guaB и мутант Schu S4 purMCD были аттенуированы на мышах. ^77,85 Однако иммунизация мутантом Schu S4 guaA или guaB не могла защитить от гомологичного заражения. ⁸⁵ Интраназальная иммунизация однократной дозой мутанта Schu S4 purMCD обеспечивала лишь частичную защиту от i.n. провокация с Schu S4 и спровоцировала повреждение ткани в легких. ⁷⁷

γ-глутамилтранспептидаза (GGT) является важным ферментом, который катализирует первую стадию разложения трипептида глутатиона (GSH). В F. tularensis GGT позволяет использовать γ-глутамил в качестве источника цистеина во время внутриклеточной репликации.Мутация ggt в LVS привела к значительному дефекту роста макрофагов J774 и снижению вирулентности у мышей; LD ₅₀ мутанта была на три порядка ниже, чем LD ₅₀ для LVS, когда мышей заражали внутрибрюшинным путем. ¹

Мутанты по факторам вирулентности

Факторы вирулентности представляют собой еще одну рациональную мишень для мутации. ЛПС Francisella, как и других грамотрицательных бактерий, состоит из липида A, основного олигосахарида и полисахарида O-антигена (O-PS). ⁴¹ В отличие от многих других грамотрицательных патогенных бактерий, ЛПС F. tularensis тетраацилирован и не вызывает явного провоспалительного цитокинового ответа. ^20,25,41 Однако мутации, затрагивающие F. tularensis LPS, ослабляют вирулентность бактерий. Делеции в wbtA -кодируемой эпимеразе / дегидратазе локуса Francisella O-PS приводили к штамму LVS Δ wbtA , который был аттенуирован на вирулентность у мышей. ^84,91 Мутации в гене сахарной трансамин / перозаминсинтетазы, wbtI , привели к полной потере экспрессии О-антигена.Мутант wbtI был очень чувствителен к бактерицидному действию сыворотки, однако он все еще был способен размножаться до уровней дикого типа в макрофагах J774, что может объяснить, почему этот штамм был умеренно аттенуирован у мышей. ⁶² Мутанты трех ферментов, необходимых для углеводных модификаций липида А F. novicida ( flmF1, flmF2 и flmK ), были получены и оценены на мышах. Мутант flmF1 не был аттенуирован у мышей, но мутанты flmF2 и flmK были аттенуированы после заражения как аэрозольным, так и подкожным путями заражения. ⁵²

С точки зрения их защитной способности иммунизация мутантами LVS wbtA или wbtI защищала мышей от заражения LVS низкого уровня (25 LD ₅₀ s). ^62,91 Однако иммунизация LVS Δ wbtA не была способна вызвать защиту от заражения Schu S4. ⁹¹ Мыши, иммунизированные мутантами flmF2 или flmK легочным путем, были защищены от смертельного вируса F.novicida , но только мутант flmK индуцировал защитный иммунитет, когда мышей иммунизировали подкожной инъекцией. ⁵²

Другие факторы вирулентности, на которые нацелена делеция, включают супероксиддисмутазу ( sodB ). ^3,4 Мутантный штамм F. tularensis sodB был значительно ослаблен в отношении вирулентности у мышей. Мыши BALB / c, вакцинированные мутантным штаммом LVSΔ sodB , были частично защищены от интраназального заражения низкими дозами Schu S4, и уровни защиты были улучшены у бустированных мышей. ³ Хотя после иммунизации мутантом LVSΔ sodB индуцировалась лишь умеренная и краткосрочная защита, примечательно, что иммунизация этим мутантом LVS индуцировала лучшую защиту от заражения Schu S4, чем родительский штамм LVS.

вакцины против туляремии

Hum Vaccin. Авторская рукопись; доступно в PMC 11 июля 2011 г.

Опубликован в окончательной редакции как:

Hum Vaccin. 2009 Dec; 5 (12): 832–838.

PMCID: PMC3132883

NIHMSID: NIHMS307467

Школа медицины Университета Мэриленда, Центр разработки вакцин, Балтимор, Мэриленд, США

Реферат

Francisella tularensis — это агент категории A, для которого разработка вакцины и средств противодействия является приоритетом. Возобновление интереса к этому патогену за последние восемь лет привело к получению огромного количества новых данных как о самом патогене, так и о его взаимодействии с клетками-хозяевами. Эта информация способствовала разработке различных вакцин-кандидатов, включая бесклеточную субъединицу, убитые целые клетки и живые аттенуированные. Этот обзор суммирует прогресс и перспективы этих различных кандидатов.

Ключевые слова: общественное здравоохранение, францизелла, туляремия, вакцина, бактерии, инфекция, биозащита

Введение

Francisella tularensis , не образующая спор, инкапсулированная грамотрицательная коккобацилла, является этиологическим агентом потенциально смертельной болезни. зоонозная болезнь туляремия. После биотеррористических атак сибирской язвы в США в 2001 году F. tularensis было помещено в список избранных агентов Категории А как один из шести патогенов, которые имели наивысший приоритет для разработки превентивных контрмер.С тех пор был достигнут значительный прогресс как в понимании патогенного процесса F. tularensis , так и в понимании иммунного ответа хозяина. Это, в свою очередь, стимулировало разработку новых интересных кандидатов на вакцину от туляремии.

F. tularensis впервые был идентифицирован как причина туляремии в 1911 году во время вспышки чумной болезни среди белок, населяющих озеро Туларе в Калифорнии. С тех пор было показано, что F. tularensis может инфицировать широкий круг животных, включая млекопитающих, птиц, земноводных, рыб и беспозвоночных. ⁷³ Это разнообразие помогает объяснить различные разговорные названия, связанные с туляремией, включая кроличью лихорадку, заячью лихорадку, оленьую лихорадку и лихорадку леммингов. ⁷³ F. tularensis способен проникать и реплицироваться внутри макрофагов, а также нефагоцитарных клеток (включая гепатоциты и альвеолярные эпителиальные клетки). ^22,31,42 F. tularensis проникает в клетки как с помощью нового механизма асимметричных петель псевдоподов ¹⁹ , так и с помощью рецепторно-зависимого механизма, который, как было показано, вовлекает рецепторы-поглотители класса A, ⁷⁹ фактор комплемента C3 рецептор (CR3 и CR4), ^5,7,90 рецептор IgG (FcγR), сурфактантный белок А и рецептор маннозы. ⁹⁰ После интернализации F. tularensis способно избегать деградационной среды фаголизосомы ^13,15,17,59 в цитоплазму, где он реплицируется. Высокая вирулентность F. tularensis является результатом многих факторов, включая его способность размножаться в больших количествах в тканях и органах хозяина, а также его способность вызывать выраженный воспалительный ответ. ^8,23,28,39 У людей синдром заболевания зависит как от пути заражения, так и от вирулентности инфекционного штамма.Инфекция кожным, оральным или легочным путями приводит к язвенно-глоточной, ротоглоточной или легочной (ранее называемой брюшным тифом) туляремии, соответственно, и самые высокие показатели смертности связаны с легочной формой заболевания. ⁹⁴ Два подвида, F. tularensis подвида holarctica (также называемого Типом B) и F. tularensis подвида tularensis (Тип A), несут ответственность за подавляющее большинство случаев туляремии человека во всем мире. Менее вирулентные штаммы типа B встречаются в Северной Америке, Европе и Азии, а более вирулентные штаммы типа A встречаются в основном в Северной Америке. ⁵⁴ Третий подвид, F. tularensis подвид novicida, который редко является патогеном человека, широко изучается в качестве модели туляремии. В то время как организм F. tularensis широко распространен в Соединенных Штатах, заболеваемость туляремией отсутствует, поскольку ежегодно регистрируется около 100 случаев туляремии человека. Эти случаи возникают в основном в результате прямого контакта с инфицированными животными или укусов членистоногих-переносчиков (например, клещей), хотя также описано легочное заболевание в результате вдыхания аэрозолей, образующихся при стрижке газонов или щетке в зараженных клещами районах. ^27,45,67

Привлекательность F. tularensis в качестве потенциального биологического оружия проистекает из его способности распространяться аэрозольным путем, его чрезвычайно низкой инфекционной дозы и его способности вызывать серьезные заболеваемость и смертность. ²³ Кроме того, F. tularensis имеет историю использования оружия, впервые задокументированную японцами для ведения войны между 1932–1945 гг., ⁴³ и позже как бывшим Советским Союзом, так и США. ^18,23 Эта история породила опасения, что F. tularensis может быть использовано в качестве биологического оружия в будущем. ^74,75 Текущим стандартом лечения туляремии является лечение антибиотиками, поскольку эта терапия очень эффективна, если ее применять на ранней стадии заражения. ⁹⁸ Однако неспецифические симптомы туляремии, которые включают увеличение лимфатических узлов, лихорадку и летаргию, могут привести к неправильной идентификации патогена, что может отсрочить соответствующую терапию. Терапевтические возможности могут быть дополнительно ограничены развитием естественной устойчивости к антибиотикам или созданием устойчивых штаммов.Поэтому безопасная и эффективная вакцина, которую можно использовать как в профилактических целях, среди целевых групп населения, таких как военные или медицинские работники, а также среди населения в целом в кризисной ситуации, была бы очень ценным инструментом общественного здравоохранения.

Два основных факта подтверждают возможность разработки вакцины против францизеллы. Во-первых, после естественного инфицирования была продемонстрирована иммуноспецифическая защита от повторного заражения. ^11,97 Во-вторых, иммунизация штаммом живой вакцины (LVS) продемонстрировала эффективность против заражения людей диким типом.LVS произошел от аттенуированного штамма типа B, который был разработан и использовался для массовой вакцинации в Советском Союзе в 1946 году. ¹⁰¹ LVS был передан из Института Гамалеи в Москве в Медицинский научно-исследовательский институт инфекционных болезней армии США, Форт-Детрик, штат Мэриленд. в 1956 году. Было показано, что вакцинация лабораторного персонала группы риска LVS снижает заболеваемость лабораторной респираторной туляремией. ¹² LVS, хотя и безопасен для людей, может быть летальным для мышей и, следовательно, стал ценным инструментом для использования в мышиной модели инфекции туляремии.Хотя LVS продемонстрировал принципиальное доказательство того, что вакцина может вызвать защитный ответ, она остается нелицензированной для использования среди населения в целом. В ответ на желание разработать безопасную и эффективную вакцину против туляремии исследователи сосредоточили свои усилия на рациональном дизайне вакцин против туляремии с использованием трех основных методов: бесклеточной субъединицы, убитых цельноклеточных и живых аттенуированных вакцин.

Бесклеточные субъединичные вакцины

Бесклеточные субъединичные вакцины — это бесклеточные вакцины, которые получают из синтезированных или очищенных антигенных компонентов микроорганизма.Основное преимущество бесклеточных субъединичных вакцин состоит в том, что они не заразны. Антигены, распознаваемые либо Т-клетками, либо иммунными сыворотками, представляют собой возможные кандидаты в вакцины на бесклеточные субъединицы.

В течение двух недель после заражения туляремией или иммунизации у людей вырабатывается устойчивый антительный ответ, который в первую очередь направлен против ЛПС. ^{2,50,56,57,97} Соответственно, LPS был исследован как потенциальный кандидат на вакцину F. tularensis . F. tularensis ЛПС тетраацилирован и поэтому только слабо активирует TLR4. ^20,25,41 Он не может индуцировать продукцию воспалительных цитокинов in vivo и in vitro ²⁰ , однако предварительная обработка F. tularensis LPS способна защитить мышей от последующего заражения LVS. ^{20,21,24,35,36,86} Было показано, что эта защита является в первую очередь гуморальной, поскольку пассивная инфузия сывороток от мышей F. tularensis , иммунизированных LPS, защищает наивных мышей от последующего заражения LVS. ³⁶ Однако эта пассивная защита не является действительно пассивной, необходимы Т-клетки, поскольку перенос сыворотки не защищает мышей, у которых истощены Т-клетки CD4 ⁺ или CD8 ⁺ . ³⁶ IFNγ также необходим, поскольку ни пассивный перенос иммунной сыворотки, ни прямая иммунизация LPS не обеспечивали защиты мышей IFNγ ^{— / —} . ^24,55

Исследования с использованием иммунизации целыми бактериями показали, что антитела против О-антигена F. tularensis LPS ответственны за LPS-опосредованную защиту. Пассивное введение антител, вызванных к LVS целых клеток, защищает от заражения LVS, в противном случае летального, в то время как антитела, вызванные иммунизацией штаммом с дефицитом O-антигена, F.tularensis LVS wbtA , не надо. ^91,92 Кроме того, пассивно вводимая кроличья антисыворотка против F. tularensis LVS, но не антисыворотка, обедненная анти-О-антителами, защищает мышей от летального заражения. ⁹¹ Однако другие исследования показали, что защитные антитела не ограничиваются О-антигеном ЛПС. Сыворотка, взятая у мышей, иммунизированных термоубитым мутантом LVS O-антигена (мутант wbtC , который полностью лишен экспрессии O-антигена), была способна защитить 80% наивных мышей от последующих i.п. вызов с LVS. ⁶⁰

То, что защита от F. tularensis может быть обеспечена посредством гуморального иммунитета, является спорным вопросом, поскольку F. tularensis является внутриклеточным патогеном. Преобладающая методология разработки вакцин предполагает, что гуморальный иммунитет играет решающую роль в защите от внеклеточных патогенов, в то время как клеточный иммунитет гораздо более важен для защиты от внутриклеточных патогенов. Однако недавние исследования показали, что большинство F.tularensis , выделенный из крови инфицированных мышей, локализовался в плазме, а не в лейкоцитах. ²⁹ Такая картина распределения наблюдалась независимо от способа инокуляции или размера, времени после инокуляции или вирулентности заражающего штамма. ²⁹

Одним из существенных недостатков использования ЛПС в качестве вакцины является его неспособность защищать от наиболее вирулентных штаммов. Иммунизация LPS, очищенным от LVS, полностью защищала мышей от заражения LVS и некоторыми вирулентными штаммами типа B.Вакцинация LVS LPS увеличивала среднее время до смерти, но не защищала от заражения штаммом типа A Schu S4. ³⁶ Возможно, что эти различия в выживаемости связаны с присущими им отличиями ЛПС от штаммов типов A и B. Однако исследования показали, что структура О-антигенов идентична у штаммов типа A и B ^41,80,100 , и иммунизация LPS, очищенным от Schu S4, не смогла защитить мышей от заражения Schu S4 и только увеличила среднее время до смерть. ⁸⁰ Следовательно, несопоставимые результаты LVS и заражения типа A после иммунизации LPS, скорее всего, связаны с различиями в вирулентности между штаммами и их различными требованиями к защите.

Одним из возможных способов увеличения защитной способности ЛПС может быть сочетание иммунизации ЛПС с индукцией иммунного ответа, опосредованного специфическими клетками Francisella. Эта идея оказалась многообещающей, так как мыши, иммунизированные LPS и получавшие бустер живого LVS, были защищены от заражения Schu S4. ³⁶ Кроме того, иммунизация мышей ЛПС в комбинации с Neisseria meningitidis PorB, лигандом TLR2 / 1, который, как было показано, усиливает костимулирующую активность Т-клеток антигенпрезентирующих клеток как in vitro, так и in vivo, ^{65 , 66,93} значительно улучшили выживаемость после интраназального заражения LVS по сравнению с иммунизацией только LPS F. tularensis . ¹⁶

В качестве альтернативной композиции субъединичной вакцины Huntley et al.исследовали потенциальную полезность белков внешней мембраны F. tularensis (OMP) в качестве бесклеточной субъединичной вакцины. Иммунизация 3 дозами нативных OMP с адъювантом обеспечивала защиту 50% мышей от интраназального заражения Schu S4. ⁴⁹

Бесклеточные субъединичные вакцины также могут использовать антигены, активирующие Т-клетки. Скрининг антигенов Т-лимфоцитов выявил пул эпитопов-кандидатов из антигенов Schu S4 для включения в рационально разработанную вакцину против туляремии. ⁶⁹ HLA-трансгенных мышей, иммунизированных подмножеством этих эпитопов, включенных в схему первичной пептидной буст-вакцины из цепочек ДНК, были защищены от смертельной интратрахеальной инфекции F. tularensis LVS. ⁶⁹

Другой Т-клеточный эпитоп, специфичный для F. tularensis , состоит из аминокислот 86–99 из 17-кДа липопротеина Tul4 (также известного как LpnA). Эти аминокислоты функционируют как иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп CD4 ⁺ у мышей B6, и Т-клетки, специфичные для этого эпитопа, могут составлять до 20% отвечающих Т-лимфоцитов CD4 ⁺ при острой инфекции Francisella. ^95,104 Однако иммунизация Salmonella typhimurium , экспрессирующая Tul4, ⁹⁶ , а также иммунизация Tul4, включенная в иммуностимулирующие комплексы ³⁸ , обеспечивала лишь частичную защиту от заражения LVS.

Убитые цельноклеточные вакцины

Успешные убитые цельноклеточные вакцины — это биологически сложные, неинфекционные препараты инфекционных агентов, которые способны вызывать защитный иммунный ответ. В 1940-х годах Ли Фошей разработал составы убитой цельноклеточной вакцины против туляремии путем фенолизации или экстракции ацетоном. ^32,33,51 Иммунизация нечеловеческих приматов вакциной Foshay предотвратила смерть после заражения 740 КОЕ Schu S4. Однако иммунизация вызвала побочные реакции у животных, включая местные некротические поражения и регионарную лимфаденопатию. ⁵¹ Введение вакцины Foshay добровольцам привело к развитию более легких реакций, но не смогло предотвратить развитие поражений после внутрикожного заражения 10 КОЕ Schu S4. ⁸⁸ Кроме того, введение вакцины Foshay не предотвращало и не изменяло развитие явной туляремии у людей, которые вдыхали 50 КОЕ Schu S4. ⁸⁷ Хотя в последние годы разработке убитой вакцины F. tularensis уделялось минимальное внимание, в 2007 г. — ⁴⁰ , Lavine et al. сообщили, что иммунизация убитым нагреванием F. tularensis LVS отдельно или в комбинации с вектором на основе вируса везикулярного стоматита, экспрессирующим IL-12, защищала мышей от последующих i.p. вызов с LVS. Оказалось, что эта защита опосредована антителами, поскольку сыворотка мышей, иммунизированных убитым нагреванием LVS, была способна защитить наивных животных от последующих i.п. вызов с LVS. ⁶⁰ Однако Baron et al. обнаружил, что i.n. инокуляция инактивированным LVS защищала только от последующего i.n. заражение живым LVS, когда инактивированные бактерии вводили в сочетании с рекомбинантным IL-12. ⁶

Живые аттенуированные вакцины

Живые аттенуированные вакцины в широком смысле определяются как вакцины, полученные из живых организмов, которые, хотя и ослаблены по вирулентности, все же остаются иммуногенными. Наиболее широко протестированной живой вакциной против туляремии является LVS.Множественные исследования заражения на приматах, отличных от человека, а также на людях продемонстрировали эффективность вакцинации LVS в обеспечении по крайней мере частичной защиты от заражения Schu S4; хотя степень защиты варьировалась в зависимости от пути и дозы введения вакцины и контрольного заражения. ^47,48,68,89 Тем не менее, хотя LVS продемонстрировал принципиальное доказательство того, что живой аттенуированный штамм может защищать от заражения, он страдает рядом недостатков, которые делают его неоптимальной вакциной.LVS основан на штамме типа B и обеспечивает лишь частичную защиту от вирулентного заражения типа A, молекулярный механизм его ослабления не определен, и LVS демонстрирует нестабильный фенотип колонии. ^26,44,78,102 Соответственно, исследователи попытались воспроизвести и улучшить защитную способность LVS путем создания полностью определенных, стабильных, аттенуированных мутантов. Современные молекулярные методы позволили сконструировать точные генетические мутации, приводящие к созданию полностью определенных мутантных штаммов. ³⁴

Гены, которые подверглись мутации, можно в общих чертах разделить на три группы: метаболические ферменты, факторы вирулентности и регуляторные белки (). Большинство целевых мутаций были сначала сконструированы и протестированы в LVS или F. novicida из-за простоты манипулирования этими штаммами и способности работать в условиях BSL-2. Это позволило исследователям идентифицировать многообещающие гены-мишени до их мутации в штаммах типа A и необходимости более высокого уровня сдерживания.

Таблица 1

Живые аттенуированные вакцины-кандидаты

Мутанты метаболических ферментов

Целевые мутации в генах, кодирующих критические ферменты, произошли в метаболических путях ослабляющих мутаций у многих бактериальных патогенов. ⁶¹ Анализ геномов Francisella выявил присутствие ферментов, которые участвуют в путях биосинтеза ароматических аминокислот. ^53,58 Хотя мутанты F. novicida , purA , purCD или purM были аттенуированы у мышей, они не защищали от гомологичного заражения дикого типа. Напротив, i.p. инъекция мутанта F. novicida purF вызвала иммунный ответ у мышей, который обеспечивал защиту от заражения родительским штаммом, но не против заражения Schu S4. ^83,99 Делеции в purMCD , guaA или guaB сильно аттенуированных Francisella LVS. ^76,77,86 Эти три мутантных штамма не распространялись в органах инфицированных мышей и не могли реплицироваться внутриклеточно в макрофагах. ^76,86 Мышей, вакцинированных мутантами LVS purMCD , guaA или guaB , защищали от летального заражения родительским штаммом LVS. Однако сингл i.n.иммунизация LVS purMCD не защищала мышей от i.n. и i.d. провокация низкими дозами Schu S4 типа А. ⁷⁷ Эти результаты контрастируют с результатами, полученными после иммунизации родительским LVS, поскольку один i.n. доза LVS защищала мышей от последующих низких доз i.d. И в. вызов с Schu S4. ⁷⁷ Мутанты Schu S4 guaA и guaB и мутант Schu S4 purMCD были аттенуированы на мышах. ^77,85 Однако иммунизация мутантом Schu S4 guaA или guaB не могла защитить от гомологичного заражения. ⁸⁵ Интраназальная иммунизация однократной дозой мутанта Schu S4 purMCD обеспечивала лишь частичную защиту от i.n. провокация с Schu S4 и спровоцировала повреждение ткани в легких. ⁷⁷

γ-глутамилтранспептидаза (GGT) является важным ферментом, который катализирует первую стадию разложения трипептида глутатиона (GSH). В F. tularensis GGT позволяет использовать γ-глутамил в качестве источника цистеина во время внутриклеточной репликации.Мутация ggt в LVS привела к значительному дефекту роста макрофагов J774 и снижению вирулентности у мышей; LD ₅₀ мутанта была на три порядка ниже, чем LD ₅₀ для LVS, когда мышей заражали внутрибрюшинным путем. ¹

Мутанты по факторам вирулентности

Факторы вирулентности представляют собой еще одну рациональную мишень для мутации. ЛПС Francisella, как и других грамотрицательных бактерий, состоит из липида A, основного олигосахарида и полисахарида O-антигена (O-PS). ⁴¹ В отличие от многих других грамотрицательных патогенных бактерий, ЛПС F. tularensis тетраацилирован и не вызывает явного провоспалительного цитокинового ответа. ^20,25,41 Однако мутации, затрагивающие F. tularensis LPS, ослабляют вирулентность бактерий. Делеции в wbtA -кодируемой эпимеразе / дегидратазе локуса Francisella O-PS приводили к штамму LVS Δ wbtA , который был аттенуирован на вирулентность у мышей. ^84,91 Мутации в гене сахарной трансамин / перозаминсинтетазы, wbtI , привели к полной потере экспрессии О-антигена.Мутант wbtI был очень чувствителен к бактерицидному действию сыворотки, однако он все еще был способен размножаться до уровней дикого типа в макрофагах J774, что может объяснить, почему этот штамм был умеренно аттенуирован у мышей. ⁶² Мутанты трех ферментов, необходимых для углеводных модификаций липида А F. novicida ( flmF1, flmF2 и flmK ), были получены и оценены на мышах. Мутант flmF1 не был аттенуирован у мышей, но мутанты flmF2 и flmK были аттенуированы после заражения как аэрозольным, так и подкожным путями заражения. ⁵²

С точки зрения их защитной способности иммунизация мутантами LVS wbtA или wbtI защищала мышей от заражения LVS низкого уровня (25 LD ₅₀ s). ^62,91 Однако иммунизация LVS Δ wbtA не была способна вызвать защиту от заражения Schu S4. ⁹¹ Мыши, иммунизированные мутантами flmF2 или flmK легочным путем, были защищены от смертельного вируса F.novicida , но только мутант flmK индуцировал защитный иммунитет, когда мышей иммунизировали подкожной инъекцией. ⁵²

Другие факторы вирулентности, на которые нацелена делеция, включают супероксиддисмутазу ( sodB ). ^3,4 Мутантный штамм F. tularensis sodB был значительно ослаблен в отношении вирулентности у мышей. Мыши BALB / c, вакцинированные мутантным штаммом LVSΔ sodB , были частично защищены от интраназального заражения низкими дозами Schu S4, и уровни защиты были улучшены у бустированных мышей. ³ Хотя после иммунизации мутантом LVSΔ sodB индуцировалась лишь умеренная и краткосрочная защита, примечательно, что иммунизация этим мутантом LVS индуцировала лучшую защиту от заражения Schu S4, чем родительский штамм LVS.

вакцины против туляремии

Hum Vaccin. Авторская рукопись; доступно в PMC 11 июля 2011 г.

Опубликован в окончательной редакции как:

Hum Vaccin. 2009 Dec; 5 (12): 832–838.

PMCID: PMC3132883

NIHMSID: NIHMS307467

Школа медицины Университета Мэриленда, Центр разработки вакцин, Балтимор, Мэриленд, США

Реферат

Francisella tularensis — это агент категории A, для которого разработка вакцины и средств противодействия является приоритетом. Возобновление интереса к этому патогену за последние восемь лет привело к получению огромного количества новых данных как о самом патогене, так и о его взаимодействии с клетками-хозяевами. Эта информация способствовала разработке различных вакцин-кандидатов, включая бесклеточную субъединицу, убитые целые клетки и живые аттенуированные. Этот обзор суммирует прогресс и перспективы этих различных кандидатов.

Ключевые слова: общественное здравоохранение, францизелла, туляремия, вакцина, бактерии, инфекция, биозащита

Введение

Francisella tularensis , не образующая спор, инкапсулированная грамотрицательная коккобацилла, является этиологическим агентом потенциально смертельной болезни. зоонозная болезнь туляремия. После биотеррористических атак сибирской язвы в США в 2001 году F. tularensis было помещено в список избранных агентов Категории А как один из шести патогенов, которые имели наивысший приоритет для разработки превентивных контрмер.С тех пор был достигнут значительный прогресс как в понимании патогенного процесса F. tularensis , так и в понимании иммунного ответа хозяина. Это, в свою очередь, стимулировало разработку новых интересных кандидатов на вакцину от туляремии.

F. tularensis впервые был идентифицирован как причина туляремии в 1911 году во время вспышки чумной болезни среди белок, населяющих озеро Туларе в Калифорнии. С тех пор было показано, что F. tularensis может инфицировать широкий круг животных, включая млекопитающих, птиц, земноводных, рыб и беспозвоночных. ⁷³ Это разнообразие помогает объяснить различные разговорные названия, связанные с туляремией, включая кроличью лихорадку, заячью лихорадку, оленьую лихорадку и лихорадку леммингов. ⁷³ F. tularensis способен проникать и реплицироваться внутри макрофагов, а также нефагоцитарных клеток (включая гепатоциты и альвеолярные эпителиальные клетки). ^22,31,42 F. tularensis проникает в клетки как с помощью нового механизма асимметричных петель псевдоподов ¹⁹ , так и с помощью рецепторно-зависимого механизма, который, как было показано, вовлекает рецепторы-поглотители класса A, ⁷⁹ фактор комплемента C3 рецептор (CR3 и CR4), ^5,7,90 рецептор IgG (FcγR), сурфактантный белок А и рецептор маннозы. ⁹⁰ После интернализации F. tularensis способно избегать деградационной среды фаголизосомы ^13,15,17,59 в цитоплазму, где он реплицируется. Высокая вирулентность F. tularensis является результатом многих факторов, включая его способность размножаться в больших количествах в тканях и органах хозяина, а также его способность вызывать выраженный воспалительный ответ. ^8,23,28,39 У людей синдром заболевания зависит как от пути заражения, так и от вирулентности инфекционного штамма.Инфекция кожным, оральным или легочным путями приводит к язвенно-глоточной, ротоглоточной или легочной (ранее называемой брюшным тифом) туляремии, соответственно, и самые высокие показатели смертности связаны с легочной формой заболевания. ⁹⁴ Два подвида, F. tularensis подвида holarctica (также называемого Типом B) и F. tularensis подвида tularensis (Тип A), несут ответственность за подавляющее большинство случаев туляремии человека во всем мире. Менее вирулентные штаммы типа B встречаются в Северной Америке, Европе и Азии, а более вирулентные штаммы типа A встречаются в основном в Северной Америке. ⁵⁴ Третий подвид, F. tularensis подвид novicida, который редко является патогеном человека, широко изучается в качестве модели туляремии. В то время как организм F. tularensis широко распространен в Соединенных Штатах, заболеваемость туляремией отсутствует, поскольку ежегодно регистрируется около 100 случаев туляремии человека. Эти случаи возникают в основном в результате прямого контакта с инфицированными животными или укусов членистоногих-переносчиков (например, клещей), хотя также описано легочное заболевание в результате вдыхания аэрозолей, образующихся при стрижке газонов или щетке в зараженных клещами районах. ^27,45,67

Привлекательность F. tularensis в качестве потенциального биологического оружия проистекает из его способности распространяться аэрозольным путем, его чрезвычайно низкой инфекционной дозы и его способности вызывать серьезные заболеваемость и смертность. ²³ Кроме того, F. tularensis имеет историю использования оружия, впервые задокументированную японцами для ведения войны между 1932–1945 гг., ⁴³ и позже как бывшим Советским Союзом, так и США. ^18,23 Эта история породила опасения, что F. tularensis может быть использовано в качестве биологического оружия в будущем. ^74,75 Текущим стандартом лечения туляремии является лечение антибиотиками, поскольку эта терапия очень эффективна, если ее применять на ранней стадии заражения. ⁹⁸ Однако неспецифические симптомы туляремии, которые включают увеличение лимфатических узлов, лихорадку и летаргию, могут привести к неправильной идентификации патогена, что может отсрочить соответствующую терапию. Терапевтические возможности могут быть дополнительно ограничены развитием естественной устойчивости к антибиотикам или созданием устойчивых штаммов.Поэтому безопасная и эффективная вакцина, которую можно использовать как в профилактических целях, среди целевых групп населения, таких как военные или медицинские работники, а также среди населения в целом в кризисной ситуации, была бы очень ценным инструментом общественного здравоохранения.

Два основных факта подтверждают возможность разработки вакцины против францизеллы. Во-первых, после естественного инфицирования была продемонстрирована иммуноспецифическая защита от повторного заражения. ^11,97 Во-вторых, иммунизация штаммом живой вакцины (LVS) продемонстрировала эффективность против заражения людей диким типом.LVS произошел от аттенуированного штамма типа B, который был разработан и использовался для массовой вакцинации в Советском Союзе в 1946 году. ¹⁰¹ LVS был передан из Института Гамалеи в Москве в Медицинский научно-исследовательский институт инфекционных болезней армии США, Форт-Детрик, штат Мэриленд. в 1956 году. Было показано, что вакцинация лабораторного персонала группы риска LVS снижает заболеваемость лабораторной респираторной туляремией. ¹² LVS, хотя и безопасен для людей, может быть летальным для мышей и, следовательно, стал ценным инструментом для использования в мышиной модели инфекции туляремии.Хотя LVS продемонстрировал принципиальное доказательство того, что вакцина может вызвать защитный ответ, она остается нелицензированной для использования среди населения в целом. В ответ на желание разработать безопасную и эффективную вакцину против туляремии исследователи сосредоточили свои усилия на рациональном дизайне вакцин против туляремии с использованием трех основных методов: бесклеточной субъединицы, убитых цельноклеточных и живых аттенуированных вакцин.

Бесклеточные субъединичные вакцины

Бесклеточные субъединичные вакцины — это бесклеточные вакцины, которые получают из синтезированных или очищенных антигенных компонентов микроорганизма.Основное преимущество бесклеточных субъединичных вакцин состоит в том, что они не заразны. Антигены, распознаваемые либо Т-клетками, либо иммунными сыворотками, представляют собой возможные кандидаты в вакцины на бесклеточные субъединицы.

В течение двух недель после заражения туляремией или иммунизации у людей вырабатывается устойчивый антительный ответ, который в первую очередь направлен против ЛПС. ^{2,50,56,57,97} Соответственно, LPS был исследован как потенциальный кандидат на вакцину F. tularensis . F. tularensis ЛПС тетраацилирован и поэтому только слабо активирует TLR4. ^20,25,41 Он не может индуцировать продукцию воспалительных цитокинов in vivo и in vitro ²⁰ , однако предварительная обработка F. tularensis LPS способна защитить мышей от последующего заражения LVS. ^{20,21,24,35,36,86} Было показано, что эта защита является в первую очередь гуморальной, поскольку пассивная инфузия сывороток от мышей F. tularensis , иммунизированных LPS, защищает наивных мышей от последующего заражения LVS. ³⁶ Однако эта пассивная защита не является действительно пассивной, необходимы Т-клетки, поскольку перенос сыворотки не защищает мышей, у которых истощены Т-клетки CD4 ⁺ или CD8 ⁺ . ³⁶ IFNγ также необходим, поскольку ни пассивный перенос иммунной сыворотки, ни прямая иммунизация LPS не обеспечивали защиты мышей IFNγ ^{— / —} . ^24,55

Исследования с использованием иммунизации целыми бактериями показали, что антитела против О-антигена F. tularensis LPS ответственны за LPS-опосредованную защиту. Пассивное введение антител, вызванных к LVS целых клеток, защищает от заражения LVS, в противном случае летального, в то время как антитела, вызванные иммунизацией штаммом с дефицитом O-антигена, F.tularensis LVS wbtA , не надо. ^91,92 Кроме того, пассивно вводимая кроличья антисыворотка против F. tularensis LVS, но не антисыворотка, обедненная анти-О-антителами, защищает мышей от летального заражения. ⁹¹ Однако другие исследования показали, что защитные антитела не ограничиваются О-антигеном ЛПС. Сыворотка, взятая у мышей, иммунизированных термоубитым мутантом LVS O-антигена (мутант wbtC , который полностью лишен экспрессии O-антигена), была способна защитить 80% наивных мышей от последующих i.п. вызов с LVS. ⁶⁰

То, что защита от F. tularensis может быть обеспечена посредством гуморального иммунитета, является спорным вопросом, поскольку F. tularensis является внутриклеточным патогеном. Преобладающая методология разработки вакцин предполагает, что гуморальный иммунитет играет решающую роль в защите от внеклеточных патогенов, в то время как клеточный иммунитет гораздо более важен для защиты от внутриклеточных патогенов. Однако недавние исследования показали, что большинство F.tularensis , выделенный из крови инфицированных мышей, локализовался в плазме, а не в лейкоцитах. ²⁹ Такая картина распределения наблюдалась независимо от способа инокуляции или размера, времени после инокуляции или вирулентности заражающего штамма. ²⁹

Одним из существенных недостатков использования ЛПС в качестве вакцины является его неспособность защищать от наиболее вирулентных штаммов. Иммунизация LPS, очищенным от LVS, полностью защищала мышей от заражения LVS и некоторыми вирулентными штаммами типа B.Вакцинация LVS LPS увеличивала среднее время до смерти, но не защищала от заражения штаммом типа A Schu S4. ³⁶ Возможно, что эти различия в выживаемости связаны с присущими им отличиями ЛПС от штаммов типов A и B. Однако исследования показали, что структура О-антигенов идентична у штаммов типа A и B ^41,80,100 , и иммунизация LPS, очищенным от Schu S4, не смогла защитить мышей от заражения Schu S4 и только увеличила среднее время до смерть. ⁸⁰ Следовательно, несопоставимые результаты LVS и заражения типа A после иммунизации LPS, скорее всего, связаны с различиями в вирулентности между штаммами и их различными требованиями к защите.

Одним из возможных способов увеличения защитной способности ЛПС может быть сочетание иммунизации ЛПС с индукцией иммунного ответа, опосредованного специфическими клетками Francisella. Эта идея оказалась многообещающей, так как мыши, иммунизированные LPS и получавшие бустер живого LVS, были защищены от заражения Schu S4. ³⁶ Кроме того, иммунизация мышей ЛПС в комбинации с Neisseria meningitidis PorB, лигандом TLR2 / 1, который, как было показано, усиливает костимулирующую активность Т-клеток антигенпрезентирующих клеток как in vitro, так и in vivo, ^{65 , 66,93} значительно улучшили выживаемость после интраназального заражения LVS по сравнению с иммунизацией только LPS F. tularensis . ¹⁶

В качестве альтернативной композиции субъединичной вакцины Huntley et al.исследовали потенциальную полезность белков внешней мембраны F. tularensis (OMP) в качестве бесклеточной субъединичной вакцины. Иммунизация 3 дозами нативных OMP с адъювантом обеспечивала защиту 50% мышей от интраназального заражения Schu S4. ⁴⁹

Бесклеточные субъединичные вакцины также могут использовать антигены, активирующие Т-клетки. Скрининг антигенов Т-лимфоцитов выявил пул эпитопов-кандидатов из антигенов Schu S4 для включения в рационально разработанную вакцину против туляремии. ⁶⁹ HLA-трансгенных мышей, иммунизированных подмножеством этих эпитопов, включенных в схему первичной пептидной буст-вакцины из цепочек ДНК, были защищены от смертельной интратрахеальной инфекции F. tularensis LVS. ⁶⁹

Другой Т-клеточный эпитоп, специфичный для F. tularensis , состоит из аминокислот 86–99 из 17-кДа липопротеина Tul4 (также известного как LpnA). Эти аминокислоты функционируют как иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп CD4 ⁺ у мышей B6, и Т-клетки, специфичные для этого эпитопа, могут составлять до 20% отвечающих Т-лимфоцитов CD4 ⁺ при острой инфекции Francisella. ^95,104 Однако иммунизация Salmonella typhimurium , экспрессирующая Tul4, ⁹⁶ , а также иммунизация Tul4, включенная в иммуностимулирующие комплексы ³⁸ , обеспечивала лишь частичную защиту от заражения LVS.

Убитые цельноклеточные вакцины

Успешные убитые цельноклеточные вакцины — это биологически сложные, неинфекционные препараты инфекционных агентов, которые способны вызывать защитный иммунный ответ. В 1940-х годах Ли Фошей разработал составы убитой цельноклеточной вакцины против туляремии путем фенолизации или экстракции ацетоном. ^32,33,51 Иммунизация нечеловеческих приматов вакциной Foshay предотвратила смерть после заражения 740 КОЕ Schu S4. Однако иммунизация вызвала побочные реакции у животных, включая местные некротические поражения и регионарную лимфаденопатию. ⁵¹ Введение вакцины Foshay добровольцам привело к развитию более легких реакций, но не смогло предотвратить развитие поражений после внутрикожного заражения 10 КОЕ Schu S4. ⁸⁸ Кроме того, введение вакцины Foshay не предотвращало и не изменяло развитие явной туляремии у людей, которые вдыхали 50 КОЕ Schu S4. ⁸⁷ Хотя в последние годы разработке убитой вакцины F. tularensis уделялось минимальное внимание, в 2007 г. — ⁴⁰ , Lavine et al. сообщили, что иммунизация убитым нагреванием F. tularensis LVS отдельно или в комбинации с вектором на основе вируса везикулярного стоматита, экспрессирующим IL-12, защищала мышей от последующих i.p. вызов с LVS. Оказалось, что эта защита опосредована антителами, поскольку сыворотка мышей, иммунизированных убитым нагреванием LVS, была способна защитить наивных животных от последующих i.п. вызов с LVS. ⁶⁰ Однако Baron et al. обнаружил, что i.n. инокуляция инактивированным LVS защищала только от последующего i.n. заражение живым LVS, когда инактивированные бактерии вводили в сочетании с рекомбинантным IL-12. ⁶

Живые аттенуированные вакцины

Живые аттенуированные вакцины в широком смысле определяются как вакцины, полученные из живых организмов, которые, хотя и ослаблены по вирулентности, все же остаются иммуногенными. Наиболее широко протестированной живой вакциной против туляремии является LVS.Множественные исследования заражения на приматах, отличных от человека, а также на людях продемонстрировали эффективность вакцинации LVS в обеспечении по крайней мере частичной защиты от заражения Schu S4; хотя степень защиты варьировалась в зависимости от пути и дозы введения вакцины и контрольного заражения. ^47,48,68,89 Тем не менее, хотя LVS продемонстрировал принципиальное доказательство того, что живой аттенуированный штамм может защищать от заражения, он страдает рядом недостатков, которые делают его неоптимальной вакциной.LVS основан на штамме типа B и обеспечивает лишь частичную защиту от вирулентного заражения типа A, молекулярный механизм его ослабления не определен, и LVS демонстрирует нестабильный фенотип колонии. ^26,44,78,102 Соответственно, исследователи попытались воспроизвести и улучшить защитную способность LVS путем создания полностью определенных, стабильных, аттенуированных мутантов. Современные молекулярные методы позволили сконструировать точные генетические мутации, приводящие к созданию полностью определенных мутантных штаммов. ³⁴

Гены, которые подверглись мутации, можно в общих чертах разделить на три группы: метаболические ферменты, факторы вирулентности и регуляторные белки (). Большинство целевых мутаций были сначала сконструированы и протестированы в LVS или F. novicida из-за простоты манипулирования этими штаммами и способности работать в условиях BSL-2. Это позволило исследователям идентифицировать многообещающие гены-мишени до их мутации в штаммах типа A и необходимости более высокого уровня сдерживания.

Таблица 1

Живые аттенуированные вакцины-кандидаты

Мутанты метаболических ферментов

Целевые мутации в генах, кодирующих критические ферменты, произошли в метаболических путях ослабляющих мутаций у многих бактериальных патогенов. ⁶¹ Анализ геномов Francisella выявил присутствие ферментов, которые участвуют в путях биосинтеза ароматических аминокислот. ^53,58 Хотя мутанты F. novicida , purA , purCD или purM были аттенуированы у мышей, они не защищали от гомологичного заражения дикого типа. Напротив, i.p. инъекция мутанта F. novicida purF вызвала иммунный ответ у мышей, который обеспечивал защиту от заражения родительским штаммом, но не против заражения Schu S4. ^83,99 Делеции в purMCD , guaA или guaB сильно аттенуированных Francisella LVS. ^76,77,86 Эти три мутантных штамма не распространялись в органах инфицированных мышей и не могли реплицироваться внутриклеточно в макрофагах. ^76,86 Мышей, вакцинированных мутантами LVS purMCD , guaA или guaB , защищали от летального заражения родительским штаммом LVS. Однако сингл i.n.иммунизация LVS purMCD не защищала мышей от i.n. и i.d. провокация низкими дозами Schu S4 типа А. ⁷⁷ Эти результаты контрастируют с результатами, полученными после иммунизации родительским LVS, поскольку один i.n. доза LVS защищала мышей от последующих низких доз i.d. И в. вызов с Schu S4. ⁷⁷ Мутанты Schu S4 guaA и guaB и мутант Schu S4 purMCD были аттенуированы на мышах. ^77,85 Однако иммунизация мутантом Schu S4 guaA или guaB не могла защитить от гомологичного заражения. ⁸⁵ Интраназальная иммунизация однократной дозой мутанта Schu S4 purMCD обеспечивала лишь частичную защиту от i.n. провокация с Schu S4 и спровоцировала повреждение ткани в легких. ⁷⁷

γ-глутамилтранспептидаза (GGT) является важным ферментом, который катализирует первую стадию разложения трипептида глутатиона (GSH). В F. tularensis GGT позволяет использовать γ-глутамил в качестве источника цистеина во время внутриклеточной репликации.Мутация ggt в LVS привела к значительному дефекту роста макрофагов J774 и снижению вирулентности у мышей; LD ₅₀ мутанта была на три порядка ниже, чем LD ₅₀ для LVS, когда мышей заражали внутрибрюшинным путем. ¹

Мутанты по факторам вирулентности

Факторы вирулентности представляют собой еще одну рациональную мишень для мутации. ЛПС Francisella, как и других грамотрицательных бактерий, состоит из липида A, основного олигосахарида и полисахарида O-антигена (O-PS). ⁴¹ В отличие от многих других грамотрицательных патогенных бактерий, ЛПС F. tularensis тетраацилирован и не вызывает явного провоспалительного цитокинового ответа. ^20,25,41 Однако мутации, затрагивающие F. tularensis LPS, ослабляют вирулентность бактерий. Делеции в wbtA -кодируемой эпимеразе / дегидратазе локуса Francisella O-PS приводили к штамму LVS Δ wbtA , который был аттенуирован на вирулентность у мышей. ^84,91 Мутации в гене сахарной трансамин / перозаминсинтетазы, wbtI , привели к полной потере экспрессии О-антигена.Мутант wbtI был очень чувствителен к бактерицидному действию сыворотки, однако он все еще был способен размножаться до уровней дикого типа в макрофагах J774, что может объяснить, почему этот штамм был умеренно аттенуирован у мышей. ⁶² Мутанты трех ферментов, необходимых для углеводных модификаций липида А F. novicida ( flmF1, flmF2 и flmK ), были получены и оценены на мышах. Мутант flmF1 не был аттенуирован у мышей, но мутанты flmF2 и flmK были аттенуированы после заражения как аэрозольным, так и подкожным путями заражения. ⁵²

С точки зрения их защитной способности иммунизация мутантами LVS wbtA или wbtI защищала мышей от заражения LVS низкого уровня (25 LD ₅₀ s). ^62,91 Однако иммунизация LVS Δ wbtA не была способна вызвать защиту от заражения Schu S4. ⁹¹ Мыши, иммунизированные мутантами flmF2 или flmK легочным путем, были защищены от смертельного вируса F.novicida , но только мутант flmK индуцировал защитный иммунитет, когда мышей иммунизировали подкожной инъекцией. ⁵²

Другие факторы вирулентности, на которые нацелена делеция, включают супероксиддисмутазу ( sodB ). ^3,4 Мутантный штамм F. tularensis sodB был значительно ослаблен в отношении вирулентности у мышей. Мыши BALB / c, вакцинированные мутантным штаммом LVSΔ sodB , были частично защищены от интраназального заражения низкими дозами Schu S4, и уровни защиты были улучшены у бустированных мышей. ³ Хотя после иммунизации мутантом LVSΔ sodB индуцировалась лишь умеренная и краткосрочная защита, примечательно, что иммунизация этим мутантом LVS индуцировала лучшую защиту от заражения Schu S4, чем родительский штамм LVS.